Name: Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Scopri l'analisi elettrofisiologica di singole cellule sensoriali nel tessuto acuto dell'organo vomeronasale del topo. Questo metodo patch-clamp rivela i meccanismi della chemosensazione in vivo.

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Ringraziamo Ivan Rodriguez e Benoit von der Weid per aver generato la linea di topi FPR-rs3-i-venus, le loro critiche costruttive e le discussioni fruttuose. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni della Fondazione Volkswagen (I/83533), della Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) e dall'Excellence Initiative dei governi federali e statali tedeschi. MS è professore di Lichtenberg presso la Fondazione Volkswagen.

Tutte le procedure di animali erano in conformità con la legislazione locale e dell&#39;Unione europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali (direttiva 86/609 / CEE) e con le raccomandazioni formulate dalla Federazione delle Associazioni di laboratorio animali europea della scienza (FELASA). Entrambi / 6 topi C57BL e topi Fpr-RS3-i-Venere sono stati alloggiati in gruppi di entrambi i sessi a temperatura ambiente su un / buio ciclo 12 ore di luce con cibo e acqua ad libitum. Per gli esperimenti sono stati utilizzati i giovani adulti (6-20 settimane) di entrambi i sessi. Non sono state osservate evidenti differenze di genere-dipendente. 1. Soluzione Preparazione <ol><li> Preparare extracellulare soluzione S 1: 4- (2-idrossi-etil) piperazina-1-etansolfonico acido (HEPES) soluzione tamponata extracellulare contenente (in mM) 145 NaCl, KCl 5, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES; pH = 7.3 (regolato con NaOH); osmolarità = 300 mOsm (regolato con glucosio). </li><li> preparare extracellular soluzione S 2: Carbogen-ossigenato (95% O 2, 5% CO 2) soluzione extracellulare contenente (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, CaCl 2 1, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7.3; osmolarità = 300 mOsm (regolato con glucosio). </li><li> Preparare la soluzione di temperatura agarosio a basso gelificazione 4% (S 3) per l&#39;incorporamento dei tessuti: 4% Temperatura agarosio a basso gelificazione. Sciogliere 2 g low-gelificazione agarosio in 50 ml di S 1 in un laboratorio bottiglia di vetro da 100 ml insieme con un agitatore magnetico. Per sciogliere l&#39;agarosio, mettere la bottiglia in un bagno di acqua (con coperchio non ben chiuso) a 70 ° C per circa 20 minuti o fino a quando la soluzione diventa trasparente sotto agitazione. Raffreddare e mantenere agarosio fuso in un secondo bagno di acqua a 42 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Preparare intracellulare soluzione S 4: soluzione Pipetta contenente (in mm) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0.3 CaCl 2 (gratuito Ca 2+ = 110 Nm), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (regolata con KOH); osmolarità = 290 mOsm. </li><li> Modificare / regolare composizione S 1, S 2 e S 4 secondo disegno sperimentale individuale (per esempio, bloccanti farmacologici per isolare alcuni tipi di correnti voltaggio-attivato). </li></ol> 2. Area di lavoro Preparazione <ol><li> Riempire ossigenante fetta memorizzazione da camera con S 2, almeno 30 minuti prima di dissezione, posto in ghiaccio per la regolazione della temperatura e pH e la soluzione di ossigenare continuamente. </li><li> Riempire il serbatoio per fetta superfusione a registrare configurato con S 2 e ossigenare continuamente. </li><li> Prima di dissezione, riempire vibratome da camera con S 2 e organizzare ghiaccio tritato intorno alla camera. In alternativa, il trasferimento soluzione ossigenata di riserva ghiaccio freddo da ossigenante camera in vibratome da camera e mantenere l&#39;ossigenazione continuamente. </li><li> Disporre strumenti chirurgici e materiali di consumo. </li><li> Posizionare il gel impacco di ghiaccio sotto dissezionemicroscopio, coprire con un tovagliolo di carta per evitare che il tessuto VNO dal congelamento al fondo del piatto. </li><li> Pulire la lama di rasoio da risciacquo brevemente in etanolo al 70% e acqua distillata e montare a vibratome. Sostituire per ogni sessione di taglio. </li></ol> 3. VNO Dissection and Embedding <ol><li> Il sacrificio di animali da una breve esposizione al CO 2 e decapitare con le forbici chirurgiche affilate. Nota: Mentre il tempo da sacrificare l&#39;animale a mettere la capsula VNO su ghiaccio è critica, minimizzare il tempo di meno di 2 min. Per mantenere la vitalità del tessuto, incorporare entrambi completamente Dissected vnos in agarosio in meno di 30 minuti. </li><li> Rimuovere la mascella inferiore con grandi forbici chirurgiche. Inserisci attraverso la cavità orale e tagliare le ossa mandibola e muscolare di ogni lato separatamente. </li><li> Posizionare la parte restante della testa a testa in giù nel grande piatto Petri. </li><li> Tirare via la pelle della mascella superiore ed intorno alla punta del naso con pinze medie per ottenere un migliore accesso alincisivi. </li><li> Utilizzare forbici osso per tagliare via la maggior parte degli incisivi a ~ 45 ° nella direzione rostrale (Figura 1A). Ciò faciliterà la rimozione della capsula VNO dalla cavità nasale. Nota: Non tagliare alla radice del dente per evitare danni alla punta della capsula VNO. </li><li> Afferra il palato superiore rigida nella sua parte rostrale con una pinza a medio e sbucciare accuratamente di nuovo in un unico pezzo con un angolo piatto (Figura 1B). Nota: ripetutamente risciacquare con ghiacciata S 2. </li><li> Utilizzare forbici micro molla per tagliare la fusione ossea tra la punta dell&#39;osso vomere e la mascella. Inserire le punte a forbice con la parte curva della punta rivolta verso l&#39;esterno lontano dalla VNO e con attenzione tagliare l&#39;osso a piccoli passi sia sulla sinistra e laterale destra per la capsula VNO. </li><li> Per rimuovere la capsula VNO, usare le forbici micro primavera per tagliare l&#39;osso vomere alla parte caudale e sollevare con attenzione l&#39;osso vomere fuori dalla ncavità Asal con pinze medie. trasferire immediatamente il VNO di una piccola capsula di Petri con un microscopio stereo su un impacco di gel refrigerante in cui saranno eseguiti i passaggi rimanenti della dissezione. </li><li> Sciacquare il VNO in una piccola quantità di ghiaccio-freddo S 2 per evitare che il tessuto si secchi. </li><li> Separare le capsule cartilaginei che contengono i tessuti molli VNO afferrando la parte posteriore dell&#39;osso vomere con una pinza medie. Posizionare la capsula per una vista dorsale in modo che una spaccatura tra i due vnos diventa visibile (Figura 1D i). </li><li> Utilizzare la punta di una pinza sottile per separare sia la cartilagine VNO capsule dall&#39;osso centrale, mantenendo l&#39;osso vomere immobilizzato nella parte posteriore. Nota: Utilizzare pinze solo a bordo della capsula cartilagine e stare molto attenti a non forare attraverso la cartilagine come l&#39;epitelio sensoriale delicata è facilmente danneggiata. </li><li> Una volta che i due sono separati vnos, cominciare a rimuovere la cartilagine incapsulare gli abetit VNO. </li><li> Afferra il bordo superiore della capsula con una pinza sottile e dividere via il muro di cartilagine che è stato precedentemente attaccato all&#39;osso vomere (lato mediale). </li><li> Per rimuovere restante cartilagine ruotare il VNO con il lato laterale curva al fondo del piatto e saldamente pin la cartilagine su un lato con pinze. Spostare con attenzione la seconda pinza sottile dal lato posteriore ad un angolo molto piatta tra cartilagine e VNO per allentare la connessione tra il tessuto e la cartilagine. </li><li> Lentamente sbucciare la VNO via dalla cartilagine tenendolo sulla punta caudale, per evitare di danneggiare l&#39;epitelio sensoriale. </li><li> Una volta che il VNO è levered dalla capsula, assicurarsi di rimuovere tutte le piccole parti rimanenti della cartilagine come eventuali frammenti di cartilagine sarà staccare il tessuto dal circostante agarosio durante il processo di taglio. </li><li> Mettere una piccola goccia di ghiacciata S 2 al primo Dissected VNO per prevenire danni ai tessuti. Un grande vaso sanguigno sul wil lateralel diventa visibile che indica che l&#39;organo è ancora intatta e non è stato grossolanamente danneggiato durante la dissezione (Figura 2A ii). Nel caso il vaso sanguigno ha danneggiato, sarà ancora la pena di continuare con affettare VNO finché la morfologia complessiva non era chiaramente compromessa. </li><li> sezionare immediatamente la seconda VNO. </li><li> Per incorporare il vnos, riempire entrambe le piccole capsule di Petri fino all&#39;orlo con S fusa 3 (memorizzato in bagno d&#39;acqua a 42 ° C; vedi 1.3). </li><li> Tenere il VNO sull&#39;estremità caudale più ampio con una pinza sottile per evitare di danneggiare l&#39;epitelio sensoriale. </li><li> Immergere il VNO in agarosio e spostarlo orizzontalmente avanti e indietro più volte per rimuovere la pellicola di soluzione extracellulare nonché eventuali bolle d&#39;aria dalla sua superficie. </li><li> Posizionare il VNO verticalmente con la punta caudale verso il fondo del piatto. Invece di pizzicare il VNO con la pinza direttamente, regolare l&#39;orientamento spostando la punta pinza in stretta ProximiTy al VNO. Nota: orientamento durante incorporamento è fondamentale in quanto determina piano di sezione e l&#39;accessibilità ai neuroni sensoriali durante l&#39;esperimento. </li><li> Posizionare piatti impacco di ghiaccio gel e attendere che agarosio si è solidificato. Nota: Non modificare l&#39;orientamento VNO una volta che l&#39;agarosio si è iniziato consolidando quanto ciò staccare il tessuto dal agarosio circostante. </li></ol> 4. coronale VNO Tissue affettare <ol><li> Utilizzare piccola spatola per rimuovere blocco agarosio dal piccolo piatto nel coperchio di un grande piatto di Petri, capovolgere l&#39;agarosio a testa in giù lasciando la punta caudale del VNO rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Tagliare il blocco in una forma piramidale con un bisturi chirurgico (3-4 mm alla punta, 8-10 mm in basso). Fare attenzione a non danneggiare il tessuto incorporato. </li><li> Utilizzare colla super per fissare il blocco a forma di piramide al centro della piastra del campione vibratome ed attendere ~ 1 min per la colla si asciughi completamente. </li><li> Trasferire il piatto esemplare per l&#39;affettamento cHamber e preparare la seconda VNO, di conseguenza. Mantenere piastra con seconda provetta a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Utilizzare un microtomo lama vibrante con le seguenti impostazioni: Spessore: 150-200 micron; Velocità: 3,5 au = 0,15 mm / sec; Frequenza: 7.5 au = 75 Hz. Trasferimento fette di camera di ossigenazione fino al momento dell&#39;uso dopo aver ispezionato brevemente fetta morfologia sotto il microscopio da dissezione. Fette possono essere mantenuti per diverse ore. </li></ol> 5. monocellulari elettrofisiologiche Recordings <ol><li> Per le registrazioni, utilizzare un microscopio stadi montante fisso dotato di obiettivi immersione in acqua, Dodt o infrarossi differenziale interferire contrasto (IR-DIC) e epi-fluorescenza, nonché una videocamera CCD raffreddata. Per l&#39;acquisizione dei dati, utilizzare un amplificatore di patch-clamp, palcoscenico testa, AD scheda di interfaccia / DA e un PC (compreso il software di registrazione). </li><li> Preparare uno stock di 10-20 pipette di patch (4-7 MW). pipette tirare da capillari di vetro borosilicato (1,50 mm di diametro / 0,86 millimetri ID) Usinga micropipetta estrattore e fire-lucidare con un microforge. Nota: Fuoco lucidatura le punte delle pipette è fondamentale quando patch piuttosto piccola VSNs. Ciò contribuirà a prevenire la rottura della membrana cellulare quando si applica una pressione negativa in modo da ottenere una tenuta elevata resistenza. Dopo la lucidatura l&#39;apertura pipetta dovrebbe essere di circa 1 micron. </li><li> Mantenere pipette in un barattolo di stoccaggio pipetta per evitare danni e l&#39;accumulo di polvere fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare sistema di perfusione riempiendo i serbatoi di soluzione e tubi secondo il disegno sperimentale. Nota: rimuovere le bolle d&#39;aria dal tubo del tutto in quanto saranno fortemente interferire con registrazioni elettrofisiologiche. </li><li> Regolare la pressione per ottenere ~ 3 ml / min. Nota: Alte pressioni causeranno il movimento della fetta del tessuto così come la cessazione di registrazioni elettrofisiologiche. </li><li> Trasferimento fetta VNO alla camera di imaging e fissare la posizione fetta utilizzando ancora in acciaio inox cablato con 0,1 mm di spessore syntfibre hetic (Figura 2B - C). Nota: Non coprire la fetta di tessuto con uno dei fili di fibra sintetica, ma piuttosto l&#39;agarosio che circonda la fetta. </li><li> Trasferimento camera di imaging per la registrazione e la configurazione fetta continuamente superfuse con ossigenato S 2 a temperatura ambiente tramite un&#39;applicazione vasca. </li><li> Regolare il capillare di aspirazione alla superficie della soluzione per creare un&#39;aspirazione lento per scambio costante di soluzione del bagno. Regolare la 8-in-1 multi-barrel &quot;matita perfusione&quot; sopra e vicino alla parte non sensoriale della fetta VNO che contiene il vaso sanguigno (Figura 2C, 3A) 50. Sarà utile per organizzare matita perfusione e la registrazione pipetta di essere di fronte alla fetta da direzioni opposte. </li><li> Collegare l&#39;elettrodo di riferimento e soluzione del bagno utilizzando un ponte di agar a forma di L (riempito con 150 mM KCl). </li><li> Riempire pipetta di patch con una soluzione di pipetta S 4. </li><li> Montare la pipetta di argento elettrodo cerotto cloruro rivestite collegato allo stadio testa senza raschiando il rivestimento e fissare saldamente. </li><li> Applicare una leggera pressione positiva (circa 1 ml di una siringa di plastica 10 ml) alla pipetta di patch prima di entrare nel bagno. </li><li> Abbassare la pipetta nel bagno usando micro manipolatori abbastanza lontano da essere in grado di immergere l&#39;obiettivo senza colpire (Figura 2D). </li><li> Monitorare la resistenza pipetta (R pip, tra 4-7 MW) utilizzando il software elettrofisiologia collegato allo stadio testa. Nota: Se R pip è &lt;4 MW la punta di vetro è rotto. Se R pip è&gt; 10 MW, la punta è più probabile intasato e la pipetta deve essere sostituito. </li><li> Visualizza la fetta VNO con un CCD-fotocamera utilizzando contrasto interferenziale differenziale a raggi infrarossi ottimizzato (DIC) e identificare FPR-RS3-i-Venere cellule che esprimono (o simile neuroni marcati) con illuminazione a fluorescenzae un cubetto di filtro appropriato. </li><li> FOCUS e fluorescenti bersaglio o cellule non-fluorescenti a seconda del disegno sperimentale. </li><li> Per avvicinarsi al corpo cellulare, utilizzare volantini per la massima sensibilità. A causa della pressione positiva, una piccola ammaccatura nella membrana cellulare soma diventa visibile una volta che la punta della pipetta si trova nelle immediate vicinanze. </li><li> Rilasciare pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per aspirare nella membrana cellulare al fine di ottenere una tenuta elevata resistenza (1-20 GΩ). Applicare aspirazione breve e delicato per distruggere la membrana cellulare e stabilire la cellula intera configurazione. </li><li> Monitorare resistenza accesso costante durante l&#39;esperimento. Nota: includere solo i neuroni espongono piccola e stabile resistenza di accesso (≤3% dell&#39;ingresso R; variazione &lt;20% nel corso dell&#39;esperimento) nell&#39;analisi. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il VNO è una struttura chemosensory che rileva semiochimici. Fino ad oggi, la maggior parte dei recettori vomeronasali resta da deorphanized come sono stati identificati solo poche coppie recettore-ligando. Tra questi, V1rb2 è stato descritto essere specificamente attivati ​​dal maschio feromone urinario 2-eptanone 30, V2rp5 per essere attivato dal maschio specifico feromone ESP1 57 così come V2r1b e V2rf2 per essere attivati ​​dai peptidi MHC SYFPEITHI 48 e SEIDLILGY 58, risp...

La maggior parte degli animali si basano molto sulla loro sensi chimici di interagire con l&#39;ambiente circostante. L&#39;olfatto gioca un ruolo essenziale per la ricerca e la valutazione di cibo, evitando i predatori e la localizzazione di adeguati partner di accoppiamento. Nella maggior parte dei mammiferi, il sistema olfattivo consiste di almeno quattro sottosistemi anatomicamente e funzionalmente distinte periferici: principale epitelio olfattivo 1,2, ganglio Grueneberg 3,4, l&#39;organo settale Masera 5,6 e l&#39;organo vomeronasale. Il VNO comprende la struttura sensoriale periferica del sistema olfattivo accessorio (AOS), che svolge un ruolo importante nel rilevare segnali chimici che trasmettono informazioni su identità, genere, classe sociale e lo stato sessuale 7-10. Il VNO si trova alla base del setto nasale proprio sopra il palato. Nei topi, è un tubo bilaterale cieco fine racchiusi in una capsula cartilaginea 11-13. L&#39;organo è composto da un epitelio sensoriale mediale a forma di mezzalunaLium che ospita i VSNs e di una parte non sensoriale sulla parte laterale. Tra i due epiteli si trova un lume di muco pieno che è collegato alla cavità nasale attraverso la stretta vomeronasale condotto 14. Un grande vaso sanguigno laterale nel tessuto non sensoriale fornisce un meccanismo di pompaggio vascolare per facilitare l&#39;ingresso di relativamente grandi, molecole per lo più non volatili come peptidi o piccole proteine ​​nel lume VNO tramite pressione negativa 15,16. I componenti strutturali del VNO sono presenti alla nascita e l&#39;organo raggiunge dimensioni degli adulti poco prima della pubertà 17. Tuttavia, se l&#39;AOS roditore è già funzionale giovani è ancora oggetto di dibattito 18-20. VSNs si distinguono per la loro posizione sia epiteliale e il tipo di recettore esprimono. VSNs mostrano una morfologia bipolare con un assone amieliniche e un singolo dendrite apicale che sporge verso il lume e si conclude con una noce dendritica microvilli. VSN asciaons fasciculate per formare il nervo vomeronasale che lascia la capsula cartilaginea alla fine dorso-caudale, sale lungo il setto, passa la lamina cribrosa e progetti al bulbo olfattivo accessorio (AOB) 21,22. L&#39;epitelio sensoriale vomeronasal costituito da due strati: lo strato apicale si trova più vicino al lato luminale e porti sia V1R- e tutti tranne uno tipo di FPR-rs-esprimendo neuroni. Questi neuroni coesprimere G αi2 G-proteine ​​α-subunità e progetto per la parte anteriore della AOB 23-25. Neuroni sensoriali situati nelle V2Rs espressi strato basale più o FPR-RS1 accanto G αo e inviano i loro assoni alla regione posteriore del AOB 26-28. Neuroni vomeronasale sono probabilmente attivati ​​da piuttosto piccole semiochimici 29-33 (V1Rs) o composti proteici 34-38 (V2Rs) che vengono secreti in vari fluidi corporei quali urina, saliva e strappare fluido 37,39-41 </sup&gt;. In esperimenti in situ hanno dimostrato che VSNs sono attivati ​​anche da peptidi formylated e vari composti antimicrobici / infiammazione legata 25,42. Inoltre, eterologhi espressi FPR-rs proteine ​​condividono spettri agonisti con FPR espressi nel sistema immunitario, che indica un potenziale ruolo come rivelatori di malattia in conspecifici o fonti di cibo avariato 25 (vedi riferimento 43). Fondamentale per comprendere le relazioni recettore-ligando e cascate di segnalazione a valle in specifiche popolazioni di VSN è una valutazione dettagliata delle loro caratteristiche biofisiche di base in un ambiente nativo. In passato, l&#39;analisi di segnalazione cellulare ha notevolmente beneficiato di animali geneticamente modificati che segnano una popolazione definita di neuroni da coexpressing un fluorescente proteina marcatore 30,44-49. In questo protocollo, una linea di topo transgenico che esprime FPR-RS3 insieme ad un marcatore fluorescente (FPR-RS3-i-Venere) viene utilizzato.Questo approccio esemplifica come impiegare tale ceppo di topi geneticamente modificati per effettuare le analisi elettrofisiologica di una popolazione di cellule otticamente identificabile con singolo neurone registrazioni patch-clamp in coronali fette di tessuto VNO acute. Una pressione-driven dell&#39;aria sistema di perfusione multi-barile per stimoli sensoriali e gli agenti farmacologici consente un rapido, reversibile e focale stimolazione neuronale o inibizione durante le registrazioni. registrazioni a cellula intera in preparati fetta consentono un&#39;analisi dettagliata delle proprietà intrinseche, conduttanze voltaggio-attivato, così come i potenziali modelli di scarica di azione in ambiente nativo della cellula.

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte>Agarosio</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(bassa temperatura gelificante)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Bis(2-idrossietil)-2-amminoetanosolfonico acido (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilenglicole tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-idrossietil)-1-piperazineetantanosolfonico acido (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato acido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici e materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri grande,</td> decapitazione <td>VWR</td><td></td> da 90 mm<td>, dissezione della capsula VNO</td></tr><tr><td>Piccola piastra di Petri,</td> coperchio <td>VWR</td><td></td> da 35 mm <td>per dissezione VNO, piastra per l'inclusione in agarosio</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche affilate di grandi dimensioni</td><td>Decapitazione di Fine Science Tools</td><td></td><td>, rimozione della mascella inferiore</td></tr><tr><td>Forbici ossee forti</td><td>Incisivi da taglio</td><td>Fine Science Tools</td><td></td></tr><tr><td>Pinze medie, pinzette Dumont #2</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>per la rimozione della pelle e del palato</td></tr><tr><td>Micro forbici a molla, 8,5 cm, curve, lame da 7 mm&nbsp;</td>Strumenti <td></td><td>di scienza fine</td><td>che tagliano VNO&nbsp;</td></tr><tr><td>Due paia di pinze sottili, pinzette Dumont #5</td><td>Strumenti</td><td></td> di scienza fine <td>che sezionano VNO dalla capsula cartilaginea</td></tr><tr><td>Piccola spatola in acciaio inossidabile</td><td>Strumenti di scienza</td><td></td> fine <td>Manipolazione del blocco di agarosio e fette di tessuto</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td></td><td></td> chirurgico <td>che taglia il blocco di agarosio in forma piramidale</td></tr> <tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato (1,50 mm OD/0,86 mm ID)</td><td>Scienza Prodotti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera CCD</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtrante, eccitazione: BP 450-490, soppressione: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Lampada a fluorescenza</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico a piastra calda</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td>Dispositivo micromanipolatore <td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette, verticale a due fasi</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Eliminatore di rumore 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Osmometro&nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione 8-in-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH Meter cinque easy</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barattolo per pipette</td> World <td>Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Camera di registrazione&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Slice mini camera</td><td></td></tr><tr><td>Lame di rasoio</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Camera di stoccaggio delle fette ossigenante; le camere commerciali alternative sono: ad es, BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) o la Pre-camera (BSC-PC; Warner Instruments)</td><td>su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Interfaccia trigger&nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

approfondita fisiologica analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto fette del mouse vomeronasal organo

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Nella maggior parte dei mammiferi, l'organo vomeronasale (VNO) è una struttura chemiosensoriale che rileva segnali sociali sia etero che conspecifici. I neuroni sensoriali vomeronasali (VSN) esprimono un tipo specifico di recettore accoppiato a proteine G (GPCR) da almeno tre diverse famiglie di geni chemocettori che consentono il rilevamento sensibile e specifico di segnali chemiosensoriali. Queste famiglie comprendono le famiglie di geni V1r e V2r, nonché la famiglia di geni chemocettori putativi relativi al recettore del peptide formile (FPR) (Fpr-rs). Al fine di comprendere la fisiologia delle interazioni recettore-ligando vomeronasale e della segnalazione a valle, è essenziale identificare le proprietà biofisiche inerenti a ciascuna specifica classe di VSNs.
L'approccio fisiologico qui descritto consente l'identificazione e l'analisi approfondita di una popolazione definita di neuroni sensoriali utilizzando una linea di topi transgenici (Fpr-rs3-i-Venus). L'uso di questo protocollo, tuttavia, non è limitato a questa specifica linea e quindi può essere facilmente esteso ad altre linee geneticamente modificate o ad animali di tipo selvatico.

Al fine di conoscere le proprietà biofisiche e fisiologiche di popolazioni cellulari definiti, eseguiamo fette di tessuto coronale acute del mouse VNO (Figura 1 - 2). Dopo la dissezione, fette possono essere conservati in soluzione extracellulare ossigenato ghiacciata (S 2) per diverse ore. Alla messa a punto di registrazione, uno scambio costante con soluzione fresca ossigenata (Figura 2D) garantisce vitalità del tessuto per ...

Qui, descriviamo un approccio fisiologico che consente l'identificazione e l'analisi approfondita di una popolazione definita di neuroni sensoriali in fette di tessuto coronale acuto dell'organo vomeronasale del topo utilizzando registrazioni di patch-clamp a cellula intera.

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'analisi elettrofisiologica a singola cellula di una popolazione definita di neuroni sensoriali in sezioni di tessuto acuto provenienti dall'organo vomeronasale del topo. Questo metodo può contribuire a chiarire questioni fondamentali nel campo della chemosensibilità, come i meccanismi alla base del rilevamento di sostanze chimiche. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che, registrando l'attività dei neuroni sensoriali in sezioni di tessuto acuto, queste cellule possono essere studiate nel loro ambiente naturale.Per iniziare questa procedura, dopo aver sacrificato l'animale, rimuovere la mandibola inferiore inserendo un paio di forbici chirurgiche grandi attraverso la cavità orale e tagliando separatamente le ossa e i muscoli della mandibola di ciascun lato. Successivamente, rimuovere la pelle della mascella superiore e intorno alla punta del naso utilizzando pinzette medie, per ottenere un migliore accesso agli incisivi. Quindi, utilizzare le forbici per ossa per asportare la maggior parte degli incisivi con un angolo di 45 gradi in direzione rostrale, al fine di facilitare la rimozione della capsula dell'organo vomeronasale (VNO) dalla cavità nasale.Non tagliare la radice del dente per evitare danni alla punta della capsula del VNO. Successivamente, afferrare il palato rigido nella sua parte rostrale con pinzette medie ed estrarlo con cura in un unico pezzo, con un angolo piatto. Sciacquare ripetutamente la cavità nasale con la soluzione S2 fredda. Quindi utilizzare forbici microchirurgiche a molla per tagliare l'effusione ossea tra la punta dell'osso vomere e la mascella. Inserire le punte delle forbici con la parte curva rivolta lontano dal VNO. Tagliare con attenzione l'osso in piccoli passaggi sia sul lato sinistro che su quello destro, lateralmente alla capsula del VNO. Per rimuovere la capsula del VNO, effettuare un taglio attraverso l'osso vomerale nella parte caudale ed estrarre con cura l'osso vomerale dalla cavità nasale utilizzando pinze medie.Trasferire immediatamente il VNO in una piccola piastra di Petri sotto un microscopio stereoscopico posizionato su un gel ghiacciato, dove dovranno essere eseguiti i passaggi rimanenti della dissezione. Successivamente, risciacquare il VNO con una piccola quantità di S2 freddo per evitare che il tessuto si secchi. Quindi, separare le capsule cartilaginee che contengono i tessuti molli del VNO afferrando la parte posteriore dell'osso vomerale con pinzette di media grandezza.A tal fine, posizionare la capsula in vista dorsale in modo che sia visibile una separazione tra i due VNO. Utilizzare la punta di una pinzetta fine per separare entrambe le capsule cartilaginee del VNO dall'osso centrale, mantenendo al contempo l'osso vomerale fissato nella parte posteriore. Assicurarsi che la parete cartilaginea mediale precedentemente attaccata all'osso vomerale venga rimossa.Quando si rimuove la cartilagine intorno all'organo vomeronasale, utilizzare la pinzetta solo sul bordo della capsula cartilaginea. Fare molta attenzione a non danneggiare l'epitelio sensoriale delicato. Per rimuovere la cartilagine residua, ruotare l'organo vomeronasale in modo che il suo lato laterale curvo sia rivolto verso il fondo della piastra e fissare saldamente la cartilagine su un lato utilizzando la pinzetta.Quindi spostare con attenzione la seconda pinzetta fine dal lato posteriore, con un angolo molto ridotto, tra la cartilagine e l'organo vomeronasale (VNO) per allentare il collegamento tra il tessuto e la cartilagine. Per evitare di danneggiare l'epitelio sensoriale, staccare lentamente il VNO dalla cartilagine tenendolo dal suo estremo caudale. Una volta sollevato il VNO dalla capsula, rimuovere tutte le piccole parti residue di cartilagine, poiché eventuali frammenti rimanenti potrebbero staccare il tessuto dall'agarosio circostante durante il processo di taglio.Successivamente, posizionare una piccola goccia di S2 ghiacciata sul primo VNO dissezionato per prevenire danni al tessuto. Per incorporare i VNO, riempire entrambe le piccole capsule di Petri fino al bordo con S3 fuso. Dopodiché, immergere ciascun VNO nell'agarosio e muoverlo orizzontalmente avanti e indietro più volte per rimuovere il film di soluzione extracellulare e qualsiasi bolla d'aria dalla sua superficie. Posizionare il VNO verticalmente, con l'estremità rostrale rivolta verso il fondo della capsula.Successivamente, posizionare entrambe le piastre su un pack di ghiaccio gel e attendere che l'agarosio si sia solidificato. Non modificare l'orientamento del VNO una volta che l'agarosio ha iniziato a solidificare, poiché ciò potrebbe staccare il tessuto dall'agarosio circostante. In questa procedura, utilizzare una spatolina per rimuovere il blocco di agarosio dalla piccola piastra e trasferirlo sul coperchio di una piastra di Petri grande, quindi capovolgere l'agarosio con il lato inferiore verso l'alto, in modo che l'estremità rostrale del VNO risulti rivolta verso l'alto.Successivamente, tagliare il blocco a forma di piramide utilizzando un bisturi chirurgico, avendo cura di non danneggiare il tessuto inclusi. Quindi, utilizzare una colla istantanea per fissare il blocco a forma di piramide al centro della piastra del vibratomo. Attendere circa un minuto per consentire alla colla di asciugarsi completamente.Tagliare il campione in sezioni spesse da 150 a 200 micrometri. Esaminare brevemente la morfologia delle sezioni al microscopio stereoscopico. Successivamente, trasferire tutte le sezioni nella camera ossigenata fino al momento dell'utilizzo.In questo passaggio, trasferire una sezione del VNO nella camera di imaging e fissare la posizione della sezione utilizzando un ancoraggio in acciaio inossidabile collegato a fibre sintetiche dello spessore di 0,1 millimetri. Non coprire la sezione di tessuto con alcuno dei fili in fibra sintetica. Successivamente, trasferire la camera di imaging al sistema di registrazione e superfondere continuamente la sezione con S2 ossigenata a temperatura ambiente.Regolare la pipetta di aspirazione in modo che tocchi la superficie della soluzione per creare un costante scambio della soluzione di bagnatura. Successivamente, posizionare la penna di perfusione multicanale 8 in 1 sopra e vicino alla parte non sensoriale della sezione del VNO che contiene il vaso sanguigno. In seguito, collegare l'elettrodo di riferimento alla soluzione di bagnatura utilizzando il ponte di agar a forma di L riempito con cloruro di potassio 150 millimolare.Successivamente, riempire la pipetta per il patch con la soluzione per pipetta S4. Montare la pipetta sopra l'elettrodo rivestito di cloruro d'argento collegato allo stadio di testa senza rimuovere il rivestimento e fissarla saldamente. Quindi applicare una leggera pressione positiva alla pipetta per il patch prima di immergerla nel bagno. Monitorare la pipetta e assicurarsi che la resistenza sia compresa tra quattro megaohm e dieci megaohm.Visualizzare la sezione del VNO con una telecamera CCD utilizzando DIC ottimizzato per l'infrarosso e identificare le cellule esprimenti FPR-rs3 i-Venus o neuroni etichettati in modo simile mediante illuminazione a fluorescenza e un cubetto filtro appropriato. Avvicinarsi al corpo cellulare utilizzando le manopole per una massima sensibilità. A causa della pressione positiva, una piccola depressione sulla membrana del soma cellulare diventa visibile non appena la punta della pipetta è in prossimità.Quindi rilasciare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per aspirare la membrana cellulare, al fine di ottenere un sigillo ad alta resistenza compreso tra uno e 20 gigaohm. Successivamente, applicare una breve e delicata aspirazione per rompere la membrana cellulare e stabilire la configurazione a intera cellula. In questa figura, un'immagine confocale di una sezione coronale di tessuto VNO mostra la distribuzione dei neuroni positivi a FPR-rs3 Tau Venus nell'epitelio sensoriale vomeronasale.I neuroni positivi per FPR-rs3 Tau Venus mostrano un singolo dendrite apicale che termina in una struttura simile a un nodulo al confine luminale. Qui vengono mostrate le registrazioni con tecnica del whole cell patch clamp effettuate dal soma dei VSN. Di seguito sono riportati tracciati rappresentativi di registrazioni con tecnica del patch clamp su VSN positivi per FPR-rs3, che evidenziano una corrente sodica rapida e sensibile alla TTX.Le registrazioni con impulsi di tensione in condizioni di controllo rivelano una corrente interna rapida e transitoria dipendente dalla tensione. Il trattamento con TTX a un micromolare riduce fortemente la corrente. E la traccia sottratta digitalmente mostrata qui rivela la corrente sodica attivata dalla tensione sensibile al TTX.Le tracce rappresentative in clampaggio di corrente mostrano depolarizzazione e iperpolarizzazione, nonché treni di potenziali d'azione generati in seguito all'iniezione di corrente positiva e negativa a gradini. Una volta acquisita padronanza, l'intero processo di dissezione e taglio del tessuto può essere completato in circa un'ora per entrambi i VNO. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come registrazioni in patch clamp extracellulari loose o imaging del calcio, al fine di aumentare la produttività nell'analisi di popolazioni più ampie di neuroni.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare sezioni di tessuto acuto dall'organo vomeronasale della bocca e di come eseguire registrazioni elettrofisiologiche a livello di singola cellula dai neuroni sensoriali vomeronasali.

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Array registrazioni Multielectrode dell&#39;epitelio Vomeronasal

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L'organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chimici intraspecie che veicolano informazioni sociali e riproduttivi. Abbiamo effettuato Ca2 + esperimenti di imaging con topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nel tessuto VNO. Questo approccio ci consente di analizzare i modelli di risposta dei neuroni complicato vomeronasale a un gran numero di stimoli feromone.

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Questo video descrive l'isolamento di un organo vomeronasale di topo (VNO) e la preparazione del tessuto per il sezionamento del vibratomo. Le sezioni vengono utilizzate per caratterizzare gli attributi biofisici e fisiologici di uno specifico gruppo di neuroni sensoriali.

Preparazione dell'organo vomeronasale di topo per il sezionamento del vibratomo

Questo video mostra la registrazione elettrofisiologica dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) nei topi utilizzando una tecnica di patch-clamp perforata. L'epitelio olfattivo, contenente OSN con recettori degli odori marcati con fluorofori, viene isolato da un topo e fissato in una camera di registrazione. Una pipetta di registrazione è fissata alla manopola dendritica di un OSN e la nistatina all'interno della pipetta perfora la membrana per formare la connettività elettrica con la cellula.

Registrazione perforata con patch-clamp dei neuroni sensoriali olfattivi nei topi

Il video del protocollo descrive la creazione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica dai neuroni sensoriali dell'organo vomeronasale (VNO) nei topi. Una fetta di VNO coronale con neuroni sensoriali marcati in fluorescenza viene collocata in una configurazione di registrazione. Un neurone marcato viene patchato con una pipetta di registrazione in una configurazione di cellula intera per la registrazione elettrofisiologica in risposta a stimoli chimici.

Definizione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica dai neuroni sensoriali vomeronasali

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