Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire l'analisi elettrofisiologica di una singola cellula di una popolazione definita di neuroni sensoriali in fette di tessuto acuto dell'organo vomeronasale del topo. Questo metodo può aiutare a chiarire le questioni chiave nel campo della chemiosensazione, come i meccanismi di rilevamento chimico see-no. Il vantaggio principale di questa tecnica è che registrando dai neuroni sensoriali in fette di tessuto acuto, queste cellule possono essere studiate nel loro ambiente nativo.

Per iniziare questa procedura, dopo aver sacrificato l'animale, rimuovere la mascella inferiore, inserendo un paio di grandi forbici chirurgiche attraverso la cavità della bocca, e tagliare separatamente le ossa della mandibola e il muscolo di ciascun lato. Quindi, rimuovere la pelle della mascella superiore e intorno alla punta del naso con una pinza media, per ottenere un migliore accesso agli incisivi. Quindi utilizzare le forbici ossee per tagliare la parte più grande degli incisivi con un angolo di 45 gradi in direzione rostrale per facilitare la rimozione della capsula VNO dalla cavità nasale.

Non tagliare la radice del dente per evitare danni alla punta della capsula VNO. Dopodiché, afferrare il palato superiore rigido nella sua parte rostrale con una pinza media e staccarlo con cura in un unico pezzo ad angolo piatto. Sciacquare ripetutamente la cavità navale con la soluzione ghiacciata S2. Quindi utilizzare le micro forbici a molla per tagliare il versamento osseo tra la punta dell'osso del vomere e la mascella.

Inserire le punte delle forbici con la parte curva rivolta lontano dal VNO. E tagliare con cura l'osso a piccoli passi sia sul lato sinistro che su quello destro, lateralmente alla capsula VNO. Per rimuovere la capsula VNO, tagliare l'osso del vomero nella parte caudale e sollevare con cautela l'osso del vomero dalla cavità nasale utilizzando una pinza media.

Trasferire immediatamente il VNO in una piccola capsula di Petri sotto uno stereomicroscopio su un impacco di gel di ghiaccio, dove devono essere eseguite le restanti fasi della dissezione. Quindi, sciacquare il VNO con una piccola quantità di S2 ghiacciato, per evitare che il tessuto si secchi. Quindi, separare le capsule cartilaginee che contengono i tessuti molli VNO afferrando la parte posteriore dell'osso del vomero con una pinza media.

Per questo, posizionare la capsula per una vista dorsale in modo che diventi visibile una divisione tra entrambi i VNO. Utilizzare la punta di una pinza fine per separare entrambe le capsule VNO della cartilagine dall'osso centrale, mantenendo l'osso del vomere bloccato nella parte posteriore. Assicurarsi che la parete della cartilagine mediale precedentemente attaccata all'osso del vomere sia rimossa.

Quando si rimuove la cartilagine attorno al VNO, utilizzare una pinza solo sul bordo della capsula cartilaginea. E fai molta attenzione a non danneggiare il delicato epitelio sensoriale. Per rimuovere la cartilagine rimanente, ruotare il VNO con il lato laterale curvo verso il fondo del piatto e fissare saldamente la cartilagine su un lato utilizzando una pinza.

Quindi spostare con cautela la seconda pinza sottile dal lato posteriore con un angolo molto piatto tra cartilagine e VNO per allentare la connessione tra tessuto e cartilagine. Per evitare di danneggiare l'epitelio sensoriale, staccare lentamente il VNO dalla cartilagine tenendolo sulla punta caudale. Una volta che il VNO è stato sollevato dalla capsula, rimuovere tutte le piccole parti di cartilagine rimanenti poiché eventuali pezzi di cartilagine rimanenti staccheranno il tessuto dall'agarosio circostante durante il processo di affettatura.

Quindi, posizionare una piccola goccia di S2 ghiacciato sul primo VNO sezionato per evitare danni ai tessuti. Per incorporare i VNO, riempire entrambe le piccole piastre di Petri fino al bordo con S3 fuso. Dopodiché, immergere ogni VNO nell'agarosio e muoverlo orizzontalmente avanti e indietro più volte per rimuovere il film di soluzione extracellulare e le eventuali bolle d'aria dalla sua superficie. Posizionare il VNO verticalmente, con la punta rostrale rivolta verso il fondo del piatto.

Successivamente, posizionare entrambe le piastre su un impacco di ghiaccio in gel e attendere che l'agarosio si sia solidificato. Non modificare l'orientamento del VNO una volta che l'agarosio ha iniziato a solidificarsi, poiché ciò staccherà il tessuto dall'agarosio circostante. In questa procedura, utilizzare una piccola spatola per rimuovere il blocco di agarosio dal piatto piccolo nel coperchio di una grande capsula di Petri e capovolgere l'agarosio, lasciando la punta rostrale del VNO rivolta verso l'alto.

Quindi, taglia il blocco in una forma piramidale usando un bisturi chirurgico e fai attenzione a non danneggiare il tessuto incorporato. Quindi, usa la super colla per fissare il blocco a forma di piramide al centro della piastra del campione del vibratomo. E attendi circa un minuto affinché la colla si asciughi completamente.

Tagliare il campione in sezioni spesse da 150 a 200 micrometri. Ispezionare brevemente la morfologia della fetta al microscopio da dissezione. Trasferite poi tutte le fette nella camera di ossigenazione fino al momento dell'utilizzo.

In questa fase, trasferire una fetta VNO nella camera di imaging e fissare la posizione della fetta utilizzando un ancoraggio in acciaio inossidabile cablato con fibre sintetiche spesse un milometro di punto. Non coprire la fetta di tessuto con nessuno dei fili di fibra sintetica. Quindi, trasferire la camera di imaging nella configurazione di registrazione e sovrafondere continuamente la fetta con S2 ossigenato a temperatura ambiente.

Regolare il capillare di aspirazione sulla superficie della soluzione per creare uno scambio costante della soluzione del bagno. Quindi regolare la matita a profusione otto in uno multi barile sopra e vicino alla parte non sensoriale della fetta VNO che contiene il vaso sanguigno. Successivamente, collegare l'elettrodo di riferimento e la soluzione del bagno utilizzando il ponte agar a forma di L riempito con 150 millimolari di cloruro di potassio.

Successivamente riempire la pipetta per cerotti con la soluzione per pipette S4. Montare la pipetta sull'elettrodo rivestito di cloruro d'argento collegato allo stadio superiore senza raschiare il rivestimento e fissarla saldamente. Quindi applicare una leggera pressione positiva sulla pipetta cerotto prima di entrare nel bagno. Monitorare la pipetta e assicurarsi che sia compresa tra quattro megaohm e 10 megaohm.

Visualizza la fetta di VNO con una telecamera CCD utilizzando DIC ottimizzato a infrarossi e identifica le cellule che esprimono FPR-rs3 i-Venus o i neuroni marcati in modo simile utilizzando l'illuminazione a florescenza e un cubo filtro appropriato. Avvicinati al corpo della cella usando i volantini per la massima sensibilità. A causa della pressione positiva, una piccola ammaccatura sulla membrana del soma cellulare diventa visibile una volta che la punta della pipetta si trova nelle immediate vicinanze.

Quindi rilasciare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per aspirare la membrana cellulare al fine di ottenere una tenuta ad alta resistenza da uno a 20 gigaohm. Successivamente applicare un'aspirazione breve e delicata per interrompere la membrana cellulare e stabilire l'intera configurazione cellulare. In questa figura, un'immagine confocale di una fetta di tessuto VNO coronale mostra la distribuzione dei neuroni fluorescenti FPR-rs3 Tau Venus positivi nell'epitelio sensoriale vomeronasale.

I neuroni positivi FPR-rs3 Tau Venus mostrano un singolo dendrite apicale che termina in una struttura simile a una manopola al bordo luminale. E qui sono mostrate le registrazioni del patch clamp dell'intera cellula eseguite dal soma VSN. Ecco le tracce rappresentative delle registrazioni di patch clamp all'ingrosso di una corrente di sodio ad attivazione rapida sensibile TTX e VSN positivi FPR-rs3.

Le registrazioni dei gradini di tensione in condizioni di controllo rivelano una corrente veloce e transitoria verso l'interno dipendente dalla tensione. Il trattamento TTX su un micromolare riduce fortemente la corrente. E la traccia sottratta digitalmente mostrata qui rivela la corrente di sodio TTX sensibile alla tensione.

Le tracce rappresentative del morsetto di corrente mostrano la depolarizzazione e l'iperpolarizzazione e i treni di potenziali d'azione generati dall'iniezione di corrente positiva e negativa graduale. Una volta padroneggiato, l'intero processo di dissezione e affettamento dei tessuti può essere eseguito in circa un'ora per entrambi i VNO. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la registrazione di patch sciolte extracellulari o l'imaging del calcio, al fine di aumentare la produttività durante l'analisi di popolazioni più ampie di neuroni.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare fette di tessuto acute dall'organo vomeronasale della bocca e di come eseguire registrazioni elettrofisiologiche di singole cellule dai neuroni sensoriali vomeronasali.