Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'analisi elettrofisiologica a singola cellula di una popolazione definita di neuroni sensoriali in sezioni di tessuto acuto provenienti dall'organo vomeronasale del topo. Questo metodo può contribuire a chiarire questioni fondamentali nel campo della chemosensibilità, come i meccanismi alla base del rilevamento di sostanze chimiche. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che, registrando l'attività dei neuroni sensoriali in sezioni di tessuto acuto, queste cellule possono essere studiate nel loro ambiente naturale.

Per iniziare questa procedura, dopo aver sacrificato l'animale, rimuovere la mandibola inferiore inserendo un paio di forbici chirurgiche grandi attraverso la cavità orale e tagliando separatamente le ossa e i muscoli della mandibola di ciascun lato. Successivamente, rimuovere la pelle della mascella superiore e intorno alla punta del naso utilizzando pinzette medie, per ottenere un migliore accesso agli incisivi. Quindi, utilizzare le forbici per ossa per asportare la maggior parte degli incisivi con un angolo di 45 gradi in direzione rostrale, al fine di facilitare la rimozione della capsula dell'organo vomeronasale (VNO) dalla cavità nasale.

Non tagliare la radice del dente per evitare danni alla punta della capsula del VNO. Successivamente, afferrare il palato rigido nella sua parte rostrale con pinzette medie ed estrarlo con cura in un unico pezzo, con un angolo piatto. Sciacquare ripetutamente la cavità nasale con la soluzione S2 fredda. Quindi utilizzare forbici microchirurgiche a molla per tagliare l'effusione ossea tra la punta dell'osso vomere e la mascella.

Inserire le punte delle forbici con la parte curva rivolta lontano dal VNO. Tagliare con attenzione l'osso in piccoli passaggi sia sul lato sinistro che su quello destro, lateralmente alla capsula del VNO. Per rimuovere la capsula del VNO, effettuare un taglio attraverso l'osso vomerale nella parte caudale ed estrarre con cura l'osso vomerale dalla cavità nasale utilizzando pinze medie.

Trasferire immediatamente il VNO in una piccola piastra di Petri sotto un microscopio stereoscopico posizionato su un gel ghiacciato, dove dovranno essere eseguiti i passaggi rimanenti della dissezione. Successivamente, risciacquare il VNO con una piccola quantità di S2 freddo per evitare che il tessuto si secchi. Quindi, separare le capsule cartilaginee che contengono i tessuti molli del VNO afferrando la parte posteriore dell'osso vomerale con pinzette di media grandezza.

A tal fine, posizionare la capsula in vista dorsale in modo che sia visibile una separazione tra i due VNO. Utilizzare la punta di una pinzetta fine per separare entrambe le capsule cartilaginee del VNO dall'osso centrale, mantenendo al contempo l'osso vomerale fissato nella parte posteriore. Assicurarsi che la parete cartilaginea mediale precedentemente attaccata all'osso vomerale venga rimossa.

Quando si rimuove la cartilagine intorno all'organo vomeronasale, utilizzare la pinzetta solo sul bordo della capsula cartilaginea. Fare molta attenzione a non danneggiare l'epitelio sensoriale delicato. Per rimuovere la cartilagine residua, ruotare l'organo vomeronasale in modo che il suo lato laterale curvo sia rivolto verso il fondo della piastra e fissare saldamente la cartilagine su un lato utilizzando la pinzetta.

Quindi spostare con attenzione la seconda pinzetta fine dal lato posteriore, con un angolo molto ridotto, tra la cartilagine e l'organo vomeronasale (VNO) per allentare il collegamento tra il tessuto e la cartilagine. Per evitare di danneggiare l'epitelio sensoriale, staccare lentamente il VNO dalla cartilagine tenendolo dal suo estremo caudale. Una volta sollevato il VNO dalla capsula, rimuovere tutte le piccole parti residue di cartilagine, poiché eventuali frammenti rimanenti potrebbero staccare il tessuto dall'agarosio circostante durante il processo di taglio.

Successivamente, posizionare una piccola goccia di S2 ghiacciata sul primo VNO dissezionato per prevenire danni al tessuto. Per incorporare i VNO, riempire entrambe le piccole capsule di Petri fino al bordo con S3 fuso. Dopodiché, immergere ciascun VNO nell'agarosio e muoverlo orizzontalmente avanti e indietro più volte per rimuovere il film di soluzione extracellulare e qualsiasi bolla d'aria dalla sua superficie. Posizionare il VNO verticalmente, con l'estremità rostrale rivolta verso il fondo della capsula.

Successivamente, posizionare entrambe le piastre su un pack di ghiaccio gel e attendere che l'agarosio si sia solidificato. Non modificare l'orientamento del VNO una volta che l'agarosio ha iniziato a solidificare, poiché ciò potrebbe staccare il tessuto dall'agarosio circostante. In questa procedura, utilizzare una spatolina per rimuovere il blocco di agarosio dalla piccola piastra e trasferirlo sul coperchio di una piastra di Petri grande, quindi capovolgere l'agarosio con il lato inferiore verso l'alto, in modo che l'estremità rostrale del VNO risulti rivolta verso l'alto.

Successivamente, tagliare il blocco a forma di piramide utilizzando un bisturi chirurgico, avendo cura di non danneggiare il tessuto inclusi. Quindi, utilizzare una colla istantanea per fissare il blocco a forma di piramide al centro della piastra del vibratomo. Attendere circa un minuto per consentire alla colla di asciugarsi completamente.

Tagliare il campione in sezioni spesse da 150 a 200 micrometri. Esaminare brevemente la morfologia delle sezioni al microscopio stereoscopico. Successivamente, trasferire tutte le sezioni nella camera ossigenata fino al momento dell'utilizzo.

In questo passaggio, trasferire una sezione del VNO nella camera di imaging e fissare la posizione della sezione utilizzando un ancoraggio in acciaio inossidabile collegato a fibre sintetiche dello spessore di 0,1 millimetri. Non coprire la sezione di tessuto con alcuno dei fili in fibra sintetica. Successivamente, trasferire la camera di imaging al sistema di registrazione e superfondere continuamente la sezione con S2 ossigenata a temperatura ambiente.

Regolare la pipetta di aspirazione in modo che tocchi la superficie della soluzione per creare un costante scambio della soluzione di bagnatura. Successivamente, posizionare la penna di perfusione multicanale 8 in 1 sopra e vicino alla parte non sensoriale della sezione del VNO che contiene il vaso sanguigno. In seguito, collegare l'elettrodo di riferimento alla soluzione di bagnatura utilizzando il ponte di agar a forma di L riempito con cloruro di potassio 150 millimolare.

Successivamente, riempire la pipetta per il patch con la soluzione per pipetta S4. Montare la pipetta sopra l'elettrodo rivestito di cloruro d'argento collegato allo stadio di testa senza rimuovere il rivestimento e fissarla saldamente. Quindi applicare una leggera pressione positiva alla pipetta per il patch prima di immergerla nel bagno. Monitorare la pipetta e assicurarsi che la resistenza sia compresa tra quattro megaohm e dieci megaohm.

Visualizzare la sezione del VNO con una telecamera CCD utilizzando DIC ottimizzato per l'infrarosso e identificare le cellule esprimenti FPR-rs3 i-Venus o neuroni etichettati in modo simile mediante illuminazione a fluorescenza e un cubetto filtro appropriato. Avvicinarsi al corpo cellulare utilizzando le manopole per una massima sensibilità. A causa della pressione positiva, una piccola depressione sulla membrana del soma cellulare diventa visibile non appena la punta della pipetta è in prossimità.

Quindi rilasciare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per aspirare la membrana cellulare, al fine di ottenere un sigillo ad alta resistenza compreso tra uno e 20 gigaohm. Successivamente, applicare una breve e delicata aspirazione per rompere la membrana cellulare e stabilire la configurazione a intera cellula. In questa figura, un'immagine confocale di una sezione coronale di tessuto VNO mostra la distribuzione dei neuroni positivi a FPR-rs3 Tau Venus nell'epitelio sensoriale vomeronasale.

I neuroni positivi per FPR-rs3 Tau Venus mostrano un singolo dendrite apicale che termina in una struttura simile a un nodulo al confine luminale. Qui vengono mostrate le registrazioni con tecnica del whole cell patch clamp effettuate dal soma dei VSN. Di seguito sono riportati tracciati rappresentativi di registrazioni con tecnica del patch clamp su VSN positivi per FPR-rs3, che evidenziano una corrente sodica rapida e sensibile alla TTX.

Le registrazioni con impulsi di tensione in condizioni di controllo rivelano una corrente interna rapida e transitoria dipendente dalla tensione. Il trattamento con TTX a un micromolare riduce fortemente la corrente. E la traccia sottratta digitalmente mostrata qui rivela la corrente sodica attivata dalla tensione sensibile al TTX.

Le tracce rappresentative in clampaggio di corrente mostrano depolarizzazione e iperpolarizzazione, nonché treni di potenziali d'azione generati in seguito all'iniezione di corrente positiva e negativa a gradini. Una volta acquisita padronanza, l'intero processo di dissezione e taglio del tessuto può essere completato in circa un'ora per entrambi i VNO. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come registrazioni in patch clamp extracellulari loose o imaging del calcio, al fine di aumentare la produttività nell'analisi di popolazioni più ampie di neuroni.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare sezioni di tessuto acuto dall'organo vomeronasale della bocca e di come eseguire registrazioni elettrofisiologiche a livello di singola cellula dai neuroni sensoriali vomeronasali.