Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans

L'objectif de cette procédure est d'identifier les régulateurs post-embryonnaires de l'expression et de la localisation des protéines chez C. elegans à l'aide d'un criblage génomique basé sur l'ARNi et de protéines marquées par fluorescence. Une fois la souche appropriée pour le criblage construite, une bibliothèque d'ARNi est choisie. La première étape de la procédure consiste à emballer les clones de la bibliothèque dans des bactéries.

Les bactéries sont ensuite sélectionnées, cultivées et administrées à des nématodes C. elegans de stades déterminés. Après avoir laissé les nématodes se développer pendant 72 heures, on observe les modifications du phénotype d'intérêt. Enfin, les changements dans l'expression ou la localisation subcellulaire de la protéine ciblée sont visualisés par microscopie à fluorescence.

Cette méthode peut identifier les gènes nécessaires à la bonne localisation sous-cellulaire d'une protéine marquée par un fluorophore. Toutefois, ce protocole peut être modifié pour identifier les gènes affectant d'autres phénotypes post-embryonnaires d'intérêt. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles publiés existants est que nous avons optimisé la constance et le niveau de la réponse d'interférence par ARN chez les animaux en induisant la production d'ARN double brin dans des bactéries avant l'ensemencement.

La démonstration de la procédure sera effectuée par Kathy Fuss, une collaboratrice scientifique de mon laboratoire. Deux mois après le début de l'expérience, préparez la bibliothèque de clones en étalant d'abord les bactéries provenant de clones sélectionnés de la bibliothèque d'alimentation, ainsi que des témoins positifs et négatifs sur des plaques LB contenant de la tétracycline et de l'agar. Comme témoin positif, utilisez un clone contenant un gène produisant un phénotype post-embryonnaire dépendant de la dose, tel que BLE4. Comme témoin négatif, utilisez un vecteur vide ou un clone contenant un pseudogène prédit n'ayant aucun phénotype observé.

Incuber les plaques toute la nuit ; pour chaque clone, inoculer deux millilitres de milieu LB contenant 50 microgrammes par millilitre d'acide carbonique à partir d'une colonie isolée provenant des plaques striées. Incuber les cultures toute la nuit avec agitation. Le lendemain matin, les solutions doivent être troubles ; induire la production d'ARN double brin en ajoutant du IPTG aux cultures et les incuber pendant quatre à cinq heures supplémentaires dans les mêmes conditions.

Ajouter de l'IPTG permet d'obtenir une inhibition induite par l'ARNi du produit génique plus constante et plus efficace que de compter uniquement sur l'IPTG et l'agent d'induction de la plaque NGM. Après l'incubation avec l'IPTG, déposer 30 microlitres de culture de chaque clone dans chaque puits des plaques NGM 24 puits préparées pour l'ARNi. Un clone par puits. Chaque plaque doit comporter deux puits réservés aux témoins.

Marquez soigneusement l'emplacement de chaque banque. Incubez les clones dans les plaques de 24 puits, puis placez les plaques découvertes dans une hotte à flux laminaire stérile pour les faire sécher pendant environ 20 minutes. N'allowez pas les bords de l'agar de se détacher de la plaque.

Une fois les nématodes étalés sur les boîtes après séchage, des instructions sur la préparation des nématodes sont fournies. Dans la section suivante, commencez avec une population synchronisée de nématodes au premier stade larvaire, ou stade L1. Le fait de commencer avec des larves L1 permet d'éviter les phénotypes létaux embryonnaires éventuels.

Avoir une population d'animaux étagée à analyser augmente également la confiance que toute variation observée est due à l'ARNi et non à de simples variations normales survenant à différents stades. Toutefois, si l'ARNi provoque un retard de développement, cela doit être noté par l'analyste Blanchiment. Une population mixte de stades de la souche utilisée pour le criblage.

Seuls les embryons protégés par la coquille d'œuf survivront à cette étape, permettant de dater les stades animaux à moins de 12 heures près si l'opération est réalisée à 20 degrés Celsius, ou à moins de 18 heures près si elle est effectuée à 16 degrés Celsius le jour où les cultures bactériennes sont inoculées. Sélectionnez trois boîtes de 100 millimètres contenant des animaux de souche de criblage en bonne santé, comprenant à la fois des adultes, des embryons et des individus sensibles à la gravité.

Lavez tous les animaux dans un milieu M neuf stérile et transférez le lavage dans un tube stérile de 15 millilitres avec bouchon à vis. Si le volume du lavage est supérieur à 3,5 millilitres, effectuez une centrifugation sur les animaux et retirez tout le liquide sauf 3,5 millilitres. S’il est inférieur à 3,5 millilitres.

Augmenter le volume à 3,5 millilitres avec de l'eau ou du M neuf pour libérer les embryons des adultes à 1,5 millilitre d'un mélange d'hydroxyde de sodium et d'eau de Javel par lavage. Laisser les animaux incuber pendant pas plus de 10 minutes dans cette solution. Après avoir démarré un minuteur, vortexer chaque tube pendant 10 secondes et répéter le vortexage toutes les deux minutes.

Après chaque agitation sur vortex, observer la solution au microscope stéréoscopique à la recherche de carcasses animales. En six à huit minutes, les adultes seront fragmentés et les embryons devraient être libérés. Retirer les embryons de la solution d'eau de Javel en les centrifugeant pour former un culot, puis en éliminant autant que possible le surnageant sans perturber le culot.

Ensuite, resuspendre le culot dans un volume de 10 millilitres en ajoutant du M neuf stérile et en agitant. Répéter cette étape de lavage au moins une fois supplémentaire jusqu'à ce que l'odeur d'eau de javel soit complètement indétectable. Pour obtenir un stade plus précis des animaux, les arrêter à leur stade L1 en faisant éclore les embryons dans un milieu M neuf sans nourriture.

Cela se fait en transférant les embryons dans du M neuf vers un petit ballon Erlenmeyer. Agiter le ballon toute la nuit à la température appropriée pour la souche et l'expérience. Pendant ce temps, les animaux éclosent tous et entrent en diapause au stade L un le jour suivant.

Reprendre la croissance des larves à partir d'un moment donné en les transférant sur les bactéries préparées exprimant un ARN double brin. C'est le même jour que celui où les plaques 24 puits ont été ensemencées avec les bactéries. Commencer par transférer les animaux L1 dans un tube de 15 millilitres et les centrifuger. Ensuite, concentrer les animaux dans un demi-millilitre à un millilitre de milieu M9, puis déposer cinq microlitres de nématodes concentrés sur une plaque.

Compter le nombre d'animaux sur la plaque et ajuster la solution concentrée de nématodes. TE 30 vers pour chaque trois à 10 microlitres. Enfin, déposer environ 30 L d'animaux d'un stade identique sur les bactéries dans chaque puits de la préparation.

Une plaque de 24 puits contenant plus de 30 animaux par puits peut entraîner une privation alimentaire. Une fois les gouttes sèches, ce qui prend quelques minutes, fixer le couvercle à l’aide d’un élastique, puis incuber les animaux retournés à la température et pendant la durée requises afin d’évaluer les animaux au stade souhaité. Une fois que les nématodes sont prêts à être analysés, vérifier que les contrôles positif et négatif produisent les phénotypes attendus. Ensuite, observer les animaux expérimentaux pour détecter d’éventuelles anomalies du développement.

Ensuite, à l’aide d’un microscope stéréoscopique, monter huit à douze animaux provenant de chaque puits sur des lames Agri PET à 4 % à l’aide d’une goutte de cinq microlitres d’anesthésique. Après avoir appliqué la lame couvre-objet appropriée, observer au moins cinq animaux au microscope composé. Tenir une base de données organisée du gène, du nombre d’animaux observés et des résultats phénotypiques.

Pour chaque expérience d'ARNi, vérifiez tout phénotype obtenu par un autre phénotype secondaire si possible, et en répétant l'expérience ; les expériences répétées peuvent utiliser des bactéries provenant du même alignement. Les alignements plus anciens peuvent entraîner une mauvaise croissance dans les cultures liquides de nuit, et doivent d'abord être réalignés. Certaines cultures bactériennes ne se développeront pas correctement en raison du produit génique exprimé dans leur plasmide.

Dans ce cas, il suffit de concentrer les bactéries avant l'ensemencement. Pour un criblage en cours, il est important de toujours disposer d’un grand nombre d’embryons prêts à être étalés. La souche utilisée pour le criblage doit toujours être nourrie, jamais privée de nourriture, et exempte de contaminants pouvant affecter le phénotype étudié.

Nous avons établi un calendrier d'entretien pour l'alimentation des animaux. Les gènes affectant la localisation de DBL un ont été identifiés par ARNi en utilisant une souche conçue spécifiquement pour cet écran. L'expression normale de la balise GFP dbl un comprend les corps cellulaires de la corde nerveuse ventrale, ainsi qu'une rangée de points chez les animaux nourris avec un AR antisens dirigé contre DBL.

Un ARNm présentait une expression fortement atténuée de DBL un. Ces animaux étaient également de petite taille, comme les animaux dépourvus d'un DBL L un fonctionnel. L'analyse par ARNi a permis d'identifier avec succès de nombreux autres gènes dont les produits influencent la localisation de DBL un, élargissant ainsi notre compréhension du trafic intracellulaire du TGF bêta et fournissant un point de départ pour de nombreuses autres recherches.

Grâce à cette méthode, une seule personne peut raisonnablement préparer et observer deux à quatre séries d'expériences chaque semaine. Par exemple, les animaux préparés le lundi et le mardi peuvent être observés respectivement le jeudi et le vendredi, et de nouveaux animaux peuvent à nouveau être préparés le vendredi et le samedi pour les observations du lundi et du mardi. Observation tout au long de ce criblage.

Il est important de toujours disposer d’un grand nombre d’embryons prêts à être classés par stade, il faut donc entretenir régulièrement la souche utilisée pour le criblage. En outre, il est essentiel de prendre des notes détaillées sur toutes les observations.