Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Questo protocollo è ottimizzato per incapsulare cellule staminali embrionali umane pluripotenti e differenziarle in neuroni dopaminergici in un sistema 3D. In primo luogo, trattare le colonie con un inibitore della roccia o RI e associarle in singole cellule con acuato mescolato con alginato di sodio e fatto passare attraverso il dispositivo di incapsulamento. Continuare il trattamento con IR per tre giorni, trasferire le cellule incapsulate su sei cellule PA e differenziare per 28 giorni.

In definitiva, l'analisi dell'espressione genica e proteica mostra una maggiore efficienza nella generazione di neuroni dopaminergici. Il vantaggio principale di questa particolare tecnica rispetto al protocollo di differenziazione 2D esistente è che cerchiamo di propagare e differenziare queste cellule in un ambiente 3D e che l'ambiente 3D offre l'opportunità che le cellule possano essere propagate in modo ad alta densità. E poi dà anche l'opportunità di avere una migliore interazione cellula-cellula per la differenziazione.

E in terzo luogo, ti dà anche una migliore efficienza di differenziazione lungo la pista. E anche, se posso aggiungere che questa particolare tecnica può essere adattata anche ad altri tipi di cellule, che possiamo propagare in un ambiente 3D. Ora ricordate anche come ad esempio, questa particolare tecnica è stata ottimizzata in base all'utilizzo di un particolare inibitore della roccia che previene l'apoptosi cellulare e previene anche il distacco della cellula dalle piastre di coltura.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà all'inizio poiché questa tecnica non viene tipicamente eseguita nella coltura dei tessuti. La seguente tecnica di incapsulamento è stata ottimizzata sulla base degli studi riassuntivi del Dr.Dean Dr.Chad sull'applicazione del tipo di alginato R inibitore, sulla concentrazione di alginato e sulle impostazioni del dispositivo di incapsulamento. Jamie e Kim, uno studente di dottorato del nostro laboratorio, dimostreranno ora questo protocollo.

Aggiungere 25 millilitri di soluzione sterile di gelatina allo 0,1% a 275 milligrammi di alginato di sodio purificato in un vortice sterile da 50 millilitri per sciogliere parzialmente la polvere di alginato. Quindi posizionare il tubo su un miscelatore orbitale a 10 volte G per una notte. Quindi, aggiungere il 9% di cloruro di sodio sterile alla soluzione di alginato.

Agitare per 30 secondi e poi centrifugare a 95 volte G per cinque minuti. Conservare la soluzione di alginato a quattro gradi Celsius. In primo luogo, in un ambiente buio, pretrattare le cellule staminali embrionali umane con terreni di coltura integrati con 10 micromolari di inibitore di roccia.

Incubare per due ore a 37 gradi Celsius. Ora lava le cellule due volte con DPBS per rimuovere le cellule enzimaticamente. Aggiungere accutane e incubare per 10 minuti.

A 37 gradi Celsius, raccogliere delicatamente le cellule con un raschietto cellulare e trasferirle in una provetta da 15 millilitri. Neutralizzare l'Accutane con un volume uguale di terreno SL. Quindi passare le cellule neutralizzate attraverso un filtro da 40 micron in una provetta da centrifuga fresca da 50 millilitri.

Ora usa un emocitometro per enumerare le cellule. Pellettare le celle mediante centrifugazione, scartare con cura il supinato. Quindi lavare le celle una volta con il preriscaldamento.

0,9% di cloruro di sodio. Centrifuga il tuo guadagno e scarta il supinato. Per incapsulare le cellule staminali embrionali umane, iniziare con Resus sospendendo le cellule con una soluzione di alginato preriscaldato.

Per fare ciò, collegare una siringa da 20 millilitri a un tubo di plastica morbida e aspirare l'alginato nella siringa. Quindi mescolare delicatamente la sospensione cellulare utilizzando la siringa senza creare bolle. Ora aspirare le cellule nella siringa.

Gettare il tubo di plastica e quindi collegare la siringa alla macchina di incapsulamento. Procedere con la configurazione degli strumenti del generatore di microsfere, della pompa a siringa, del misuratore del flusso d'aria e del bagno di precipitazione del cloruro di calcio. Verificare uno spazio di 10 centimetri tra l'estremità della macchina di incapsulamento e il punto di raccolta della piastra di Petri.

Quindi, impostare la pompa a siringa a 10 millilitri all'ora. Portata d'aria a otto litri al minuto e una pressione di 100 kilo pascal. Raccogliere le cellule incapsulate in un bagno di precipitazione preriscaldato per sette minuti.

Quindi trasferirli mediante aspirazione delicata in una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente 20 millilitri di cloruro di sodio allo 0,9%, lasciare che le capsule si depositino sul fondo della provetta, scartare delicatamente il supinato, quindi lavare una volta con cloruro di sodio allo 0,9%. Procedere alla risospensione delle cellule incapsulate in terreno di coltura preriscaldato, integrato con un inibitore di roccia. Trasferire in un pallone di coltura e incubare per tre giorni.

Seminare la linea stromale di topo PA sei cellule in un pallone T 75 rivestito di gelatina allo 0,1% e condizionare il terreno di differenziazione neurale dopaminergica per 24 ore. Trasferire le capsule in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e lasciarle depositare sul fondo della provetta. Scartare il supinato e risospendere le capsule in PA in condizione di differenziazione neurale dopaminergica a sei cellule.

Cultura media. Le cellule staminali embrionali umane incapsulate con il monostrato di sei cellule PA per 21 giorni. Durante il rifornimento del supporto, cambiare.

Solo la metà dei terreni ogni volta continua a coltivare le sei cellule PA nella differenziazione neurale dopaminergica. Mezzo integrato con fattori induttori per una settimana. Per prima cosa aspirare le capsule e trasferirle in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Quando le capsule si sono depositate sul fondo, scartare il supinato. Lavare due volte con DPBS, scartando il supinato. Quindi aggiungere cinque millilitri di soluzione ululante decap e mescolare accuratamente la sospensione.

Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione del pellet, le celle di decapping e il lavaggio due volte con DPBS procedono all'utilizzo delle cellule di decapaggio come coltura monostrato o per l'analisi immediata a valle. In una preparazione tipica, il diametro delle microcapsule in alginato è compreso tra 400 e 500 micron.

Qui, il saggio C-F-D-A-P-I. I risultati determinano le cellule incapsulate vitali verdi all'80%Le analisi di vitalità, proliferazione e apoptosi delle cellule staminali embrionali umane incapsulate in diversi momenti servono a ottimizzare le condizioni di coltura. È interessante notare che gli effetti degli inibitori delle rocce prevengono l'apoptosi indotta dalla dissociazione e mantengono la vitalità cellulare con indicazione di una crescita superiore di cellule staminali embrionali umane incapsulate coltivate in H-F-F-C-M più ri.

Questo esempio applica l'incapsulamento cellulare come piattaforma 3D per differenziare le cellule staminali embrionali umane incapsulate in neuroni dopaminergici. Come previsto, le dimensioni dei corpi embrionali aumentano con il tempo di incapsulamento, le cellule dimostrano una morfologia neuronale progressiva dopo due o tre giorni di coltura con una vitalità superiore al 90%. L'analisi dell'espressione genica indica una sottoregolazione del marcatore pluripotente OCT quattro.

È importante sottolineare che il marcatore neuroprogenitore PAC 6 e il marcatore neuronale dopaminergico th rimangono sovraregolati dopo sette giorni di differenziazione. Ulteriori cellule staminali embrionali umane differenziate indicano una maggiore del 90% di neuroni TH positivi dopo 21 giorni. L'analisi delle perdite occidentali conferma i modelli di espressione favorevoli di TH e PAC six nei sistemi di coltura cellulare 3D rispetto a quelli 2D.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita efficacemente in due ore. Ricordarsi di trattare le cellule con un inibitore della roccia prima e dopo l'incapsulamento. Gli induttori o gli inibitori delle varianti possono personalizzare il protocollo di differenziazione 3D per esperimenti futuri.

Questa particolare tecnica consiste nell'incapsulare le ESL umane e differenziarle in un ambiente 3D o per il potenziale di terapia cellulare per un numero di malattie, in particolare il morbo di Parkinson.