Name: Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Scopri la microincapsulazione di cellule staminali embrionali umane in microcapsule di alginato per la differenziazione in neuroni dopaminergici in un sistema 3D. Questo metodo migliora le interazioni cellulari e l'efficienza differenziativa.

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Questo lavoro è supportato da NHMRC Grant Program # 568969 (PSS) e la Facoltà di Medicina, Università di New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).

Tutte le procedure riportate di seguito vengono eseguite con tecniche asettiche all&#39;interno di una II classe biosicurezza Cabinet. Reagenti e attrezzature usati sono elencati nelle tabelle seguenti. 1. Preparazione del 1,1% alginato (w / v) <ol><li> Aggiungere 0,275 g di alginato di sodio purificato (elevato contenuto di acido glucuronico ≥ 60%, viscosità&gt; 200 mPa s, e endotossina ≤ 100 EU / g) in uno sterile tubo da 50 ml e aggiungere 25 ml di soluzione sterile 0,1% di gelatina preparata in precedenza (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H 2 O e sciolto in autoclave). </li><li> Vortex la provetta per circa 30 secondi per sciogliere parzialmente la polvere di alginato quindi posizionare il tubo in un mixer orbitale a 10 xg per il pernottamento (temperatura ambiente). </li><li> Aggiungere 2,778 ml del 9% sterile di NaCl (4,5 g di NaCl/50 ml Milli-Q H 2 O) a 25 ml di soluzione di alginato. Vortex la provetta per circa 30 secondi, seguito da centrifugazione a 95 xg per 5 min. </li><li> Conservare la soluzione di alginato a 4 °; C per la conservazione a breve termine (1-2 mesi) oppure a -20 ° C per la conservazione a lungo termine (circa un anno). </li></ol> 2. Preparazione di CaCl 2 Bath Precipitazioni <ol><li> Sciogliere 14.7 g di CaCl 2. 2H 2 O e 2,38 g di HEPES in 1 litro di Milli-Q H 2 O. </li><li> Regolare il livello di pH a 7,4. </li><li> Sterilizzare la soluzione con un filtro di 0,22 micron. </li><li> Bagno precipitazione può essere conservato a temperatura ambiente (6-12 mesi). </li></ol> 3. Preparazione della soluzione decapsulating <ol><li> In 500 ml di Phosphate Buffered Saline Dulbecco (D-PBS), aggiungere 50 ml di EDTA 0,5 M e 5 ml di HEPES 1M. </li><li> Sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron o autoclave a 121 ° C per 20 min. </li><li> Conservare la soluzione decapsulating a temperatura ambiente (6-12 mesi). </li></ol> 4. Preparazione del siero di ricambio (SR) Medium <ol><li> Prima di incapsulamento, preparare media SR in anticipo, come dedescritto nella tabella di reagenti e attrezzature specifiche. </li></ol> 5. Preparazione di Inhibitor ROCK (Y-27632) <ol><li> Diluire Y-27.632 in polvere 0,1% albumina sierica umana (HSA) in D-PBS per ottenere una soluzione 5 mM. </li></ol> 6. Preparazione di hESC per l&#39;incapsulamento <ol><li> Pre-trattare le cellule con mezzi di coltura additivato con il 10 pM di inibitore ROCK (RI) per due ore a 37 ° C (riparo dalla luce). </li><li> Dopo il trattamento RI, lavare le cellule con D-PBS due volte e rimuovere le cellule da piastre di coltura enzimaticamente con accutase per 10 min a 37 ° C. </li><li> Raschiare delicatamente le cellule con il raschietto pipetta o cellulare e raccogliere in una provetta da 15 ml. Neutralizzare il accutase con il mezzo SR in rapporto 1:1. </li><li> Per preparare una sospensione di cellule singole, filtrare le cellule neutralizzati usando un filtro 40 um e raccogliere in un nuovo tubo da 50 ml centrifuga. </li><li> Calcolare il numero totale di cellule in soluzione con un emocitometro. </li&gt; <li> Centrifugare la sospensione cellulare 95 xg per 5 minuti e accuratamente scartare il surnatante dopo. Lavare le cellule con pre-riscaldata 0,9% NaCl. Centrifugare 95 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. </li></ol> 7. Incapsulamento delle celle <ol><li> Preparare una siringa da 1 ml collegata a un tubo di plastica morbida 14G x 2 &quot;catetere IV. Questo viene utilizzato per aspirare la sospensione cellulare da caricare al pompa a siringa come mostrato nella Figura 1. </li><li> Risospendere le cellule con preriscaldata soluzione di alginato ad una densità di 1,25 milioni di cellule / ml alginato. Mescolare delicatamente con la siringa ed evitare di creare bolle. </li><li> Impostare il generatore tallone, pompa a siringa e il flussometro come mostrato nella Figura 1. Maggiori dettagli di questi dispositivi sono elencati nella Tabella di reagenti e attrezzature specifiche. </li><li> Con le cellule aspirato nella siringa, scartare il tubo di plastica del catetere IV e collegare la siringa alla macchina incapsulamento. Assicurarsi che vi sia spazio a 10 centimetri essere<html> tra la fine della macchina incapsulamento e il punto di raccolta, come mostrato nella Figura 1. </li><li> Incapsulare le cellule impostando la pompa a siringa a 20 ml / h, portata d&#39;aria a 8 L / min e una pressione di 100 kPa (la dimensione di capsule può essere modificata modificando la portata d&#39;aria). </li><li> Raccogliere le cellule incapsulate in una capsula di Petri (100 x 15 mm) riempita con 20 ml di pre-riscaldato bagno precipitazione per 7 minuti per stabilizzare le capsule. </li><li> Trasferire le cellule incapsulate aspirando piano in provette per centrifuga da 50 ml contenenti 20 ml di 0,9% NaCl. </li><li> Lasciare le capsule a depositarsi nella parte inferiore del tubo poi delicatamente scartare il surnatante. Ripetere il processo di lavaggio con NaCl 0,9%. </li><li> Risospendere le cellule incapsulate in preriscaldata terreno di coltura supplementato con RI (10 pM), il trasferimento in un pallone di coltura e incubate a 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> 8. Differenziazione delle hESC incapsulato in neuroni DA ve_content &quot;&gt; Il hESC incapsulato sono trattati con RI per 3 giorni prima della differenziazione. <ol><li> Seme della linea cellulare topo stromale, PA6 cellule ad una densità di 1,0 x 10 4 per cm 2 in 0,1% di gelatina rivestita T75 pallone e le condizioni PA6 cellule in mezzo differenziamento DA neurale (Tabella Materials) 24 ore prima della differenziazione. </li><li> Trasferire le capsule ad una provetta da centrifuga da 50 ml e consentire loro di depositarsi nella parte inferiore del tubo. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere le capsule in PA6 cella climatizzata di media differenziazione DA neurale. </li><li> Cultura del hESC incapsulato con il monostrato cellulare PA6 (9 x 10 6 hESC per 7,5 x 10 5 cellule PA6) per 28 giorni con un cambiamento dei media il giorno 4 e ogni altro giorno successivo (cambiare solo la metà del terreno di volta in volta). </li><li> Dopo 3 settimane in coltura con cellule PA6, integrare il mezzo DA differenziamento neurale con 100 ng / ml SHH e 100 ng / ml FGF8a per la settimana rimanente. </li&gt; </ol> 9. Decapsulation di hESC Encapsulated <ol><li> Aspirare le capsule in una provetta da centrifuga da 15 ml e consentire loro di depositano sul fondo della provetta. Poi scartare il surnatante con cura. </li><li> Lavare le capsule con D-PBS due volte. Lasciare le capsule si depositano sul fondo della provetta quindi rimuovere il supernatante. </li><li> Aggiungere 5 ml di soluzione decapsulating alle capsule. Mescolare la sospensione accuratamente tramite aspirazione prima di incubazione a temperatura ambiente per 4-5 min. </li><li> Centrifugare le cellule decapsulati a 95 xg per 3 min e scartare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet di cellule con D-PBS seguita da centrifugazione a 95 xg per 3 min. Ripeti. </li><li> Le cellule decapsulate possono essere ulteriormente coltivate come monostrato o utilizzati per l&#39;analisi a valle. </li></ol> 10. Risultati rappresentativi Il diametro delle microcapsule è alginato di 400-500 micron. Il numero delle cellule all&#39;interno della capsula era estimated calcolando il numero totale di cellule diviso per il numero totale di capsule per corsa. Pertanto, a circa 5,0 x 10 4 cellule per capsula è stato stimato. Da questo, si presume che il numero massimo di cellule della capsula può contenere è di circa 1,0 x 10 5. La redditività di hESC incapsulato è&gt; 80% (Figura 2) come determinato utilizzando con diacetato carbossifluoresceina succinimidly estere (CFDA) / ioduro di propidio (PI) test. Abbiamo ottimizzato le condizioni di incapsulamento hESC diminuendo la concentrazione di alginato dal 2,2% al 1,1% e modificando il bagno precipitazione da cloruro di bario cloruro di calcio. Da queste condizioni, abbiamo dimostrato che solo le cellule che sono state incapsulate con alginato di calcio 1,1% potrebbe sopravvivere, proliferare e formare EBs in vitro 1. Per ottimizzare ulteriormente la condizione, gli effetti dei mezzi di coltura e RI, Y-27.632 sono stati esaminati. I dati presentati in Figura 2 e 3 dimostrano che prevente RId dissociazione apoptosi indotta e mantenuta la vitalità cellulare e la formazione di cluster promosso 1,6. Inoltre, la vitalità di hESC coltivate in incapsulato HFF-CM RI + era significativamente più alta rispetto agli altri gruppi senza supplementazione RI, ma questo non era significativamente diversa da incapsulato hESC coltivate in RI SR +. Analogamente, la proliferazione cellulare mediante saggio BrdU aumentata dal 25% al ​​75% come singole cellule sviluppate in cluster (Figura 3). Apoptosi da TUNEL rivelato che le singole cellule in microcapsule coltivate in mezzo SR erano apoptotico (dati non mostrati), mentre i cluster recuperati dalla HFF-CM erano negative per lo più TUNEL. In una certa misura, HFF-CM supplementate con bFGF anche promosso la sopravvivenza e la proliferazione delle hESC incapsulati in assenza di Y-27.632. Tuttavia, il trattamento con Y-27.632 prima (2 ore) e dopo l&#39;incapsulamento (per altri 4 giorni) marcatamente migliorata viabilità, la proliferazione e la formazione dei cluster hESC incapsulatoin microcapsule 1,1% di calcio alginato. In precedenza abbiamo dimostrato che hESC incapsulato può essere successo differenziate per endoderma definitivo 1. Qui, abbiamo esaminato l&#39;applicazione di incapsulamento delle cellule come una piattaforma 3D per differenziare hESC incapsulato in neuroni DA. hESC, che formavano corpi embrionali (EB) in capsule erano diretti differenziata e decapsulation alle condizioni descritte hanno mostrato una progressiva morfologia neuronale (Figura 4) dopo 2-3 giorni di coltura con oltre il 90% vitalità. Analisi di espressione genica ha mostrato una down-regulation dei marker pluripotenti, OCT4 mentre marker neuroprogenitor, PAX6 e marker DA neuronale, TH sono up-regolati dopo 7 giorni di differenziazione (Figura 5A). Colorazione immunofluorescenza ha rivelato che hESC differenziata erano PAX6-positivi (&gt; 80%), ma OCT4-negativi al giorno 7. Ulteriori hESC differenziato mostrato TH-positivi (&gt; 90%) neuroni dopo 21 giorni (Figura 5B). Western blot ha dimostratoun up-regolazione dell&#39;espressione dei TH dal giorno 14 (Figura 5C), mentre PAX6 espressione era down-regolato dopo giorno 21. In confronto, le cellule coltivate in ambiente bidimensionale (2D) in condizioni analoghe (RI esempio pretrattamento per 2 ore e RI post-trattamento per 3 giorni prima differenziazione) mantenuta un&#39;alta percentuale di cellule positive PAX6-(&gt; 80 %) per tutto il periodo di differenziazione e non erano così efficienti nella differenziazione di cellule TH-positive (&lt;60%) come in ambiente 3D fornito da incapsulamento (Figura 5A e C).

<ol><li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li>
<li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li>
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<li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li>
<li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li>
<li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li>
<li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Diversi studi che utilizzano cellule staminali embrionali di topo e hESC hanno dimostrato i benefici del sistema di coltura 3D in biomateriali e ingegneria dei tessuti 2,3. Abbiamo usato microcapsule di alginato di calcio come una piattaforma adatta 3D per studiare la propagazione hESC e la differenziazione rispetto a quanto hESC alginato di bario hanno mostrato significativa redditività superiore quando incapsulati in alginato di calcio di alginato di bario. Questo sistema consente inoltre una coltura ad alt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Note </td></tr><tr><td> Alginato (Pronova UP MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> elevato contenuto di acido glucuronico ≥ 60%, viscosità&gt; 200 mPa s, e endotossina &lt;100 EU / g </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% NaCl </td><td> Baxter Healthcare </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> Tipo J1 tallone generatore </td><td> Nisco engineering Inc </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-Phaser pompa siringa </td><td> New Era Pump Systems Inc </td><td> Modello NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-Flow Flussimetro Medical </td><td> Gascon Sistemi</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27.632 </td><td> Merck </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina sierica umana </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G x 2 &quot;catetere IV </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> Knockout-DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> Per SR medio (basale) </td></tr><tr><td> -I Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> Per mezzo SR (2 mM) </td></tr><tr><td> Knockout sostituzione Siero </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Per SR mezzo (20%) </td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> Per mezzo SR (2,5 U / ml) </td&gt; </tr><tr><td> Insulin-transferrina-Selenio (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> Per SR media (1x) </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Per mezzo di SR (0,1 mm) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Per mezzo SR (5 mM) </td></tr><tr><td> Glasgow Media minimi essenziali </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> Per mezzo di differenziazione DA neurale (basale) </td></tr><tr><td> Knockout sostituzione Siero </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Per mezzo di differenziazione DA neurale (10%) </td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> Per mezzo di differenziazione DA neurale (1 mM) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Per DA ndifferenziazione media EURAL (0,1 mm) </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Per mezzo di differenziazione DA neurale (0,1 mm) </td></tr><tr><td> Sonic hedgehog (SHH) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> Per differenziazione DA neurale (100 ng / ml) </td></tr><tr><td> Fattore di crescita dei fibroblasti 8a (FGF8a) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 4745-F8-050 </td><td> Per differenziazione DA neurale (100 ng / ml) </td></tr></tbody></table>

microcapsule di alginato come piattaforma 3d per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hesc) per diverse linee

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Cellule staminali embrionali umane (hESC) stanno emergendo come una fonte alternativa per la terapia di sostituzione cellulare dal momento che possono essere espanse in coltura indefinitamente e differenziati a tutti i tipi di cellule nel corpo. Vari tipi di biomateriali sono stati utilizzati anche in colture di cellule staminali per fornire un microambiente che imita la nicchia delle cellule staminali 1-3. Quest&#39;ultimo è importante per promuovere cellula-cellula interazione, proliferazione cellulare, differenziazione e in lignaggi specifici nonché l&#39;organizzazione fornendo un tessuto tridimensionale (3D) ambiente 4 come l&#39;incapsulamento. Il principio della cella incapsulamento implica l&#39;intrappolamento delle cellule viventi all&#39;interno dei confini di membrane semipermeabili in colture 3D 2. Queste membrane per lo scambio di nutrienti, ossigeno e stimoli attraverso le membrane, mentre gli anticorpi e le cellule immunitarie dall&#39;host che sono maggiori delle dimensioni dei pori sono esclusi capsula 5. Qui, si preha inviato un approccio alla cultura e differenziare hESC neuroni DA in un microambiente 3D utilizzando microcapsule di alginato. Abbiamo modificato le condizioni di coltura da 2 a migliorare la redditività di hESC incapsulato. Abbiamo precedentemente dimostrato che l&#39;aggiunta di gp160-Rho-associata coiled-coil chinasi (ROCK) inibitore, Y-27.632 e fetale umano fibroblasti terreno condizionato sostituzione siero (HFF-CM) alla piattaforma 3D significativamente migliorato la redditività di hESC incapsulato in cui le cellule espresso definitive geni marcatori endoderma 1. Abbiamo utilizzato questa piattaforma 3D per la propagazione della differenziazione hESC ed efficiente ai neuroni DA. Analisi di espressione proteica e genica dopo la fase finale di differenziazione neuronale DA mostrato un aumento dell&#39;espressione della tirosina idrossilasi (TH), un marcatore per DA neuroni,&gt; 100 pieghe dopo 2 settimane. Abbiamo ipotizzato che la nostra piattaforma 3D con microcapsule di alginato può essere utile per studiare la proliferazione e la differenziazione direttadi hESC a vari lignaggi. Questo sistema 3D permette anche la separazione di cellule feeder dal hESC durante il processo di differenziazione e ha anche un potenziale di immuno-isolamento durante il trapianto in futuro.

Abbiamo ottimizzato una tecnica di microincapsulazione come una piattaforma efficace 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali per endoderma e dopaminergici (DA) neuroni. Esso fornisce inoltre l&#39;opportunità di immuno-isolamento di cellule dall&#39;host durante il trapianto. Questa piattaforma può essere adattato per altri tipi di cellule.

Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Le cellule staminali embrionali umane (hESC) si stanno rivelando una fonte alternativa promettente per la terapia di sostituzione cellulare, poiché possono essere espanse in coltura...

Questo protocollo è ottimizzato per incapsulare cellule staminali embrionali umane pluripotenti e differenziarle in neuroni dopaminergici in un sistema 3D. In primo luogo, trattare le colonie con inibitore della chinasi ROCK o RI e dissociarle in singole cellule con acuato mescolato con alginato di sodio, quindi farle passare attraverso il dispositivo di incapsulamento. Continuare il trattamento con RI per tre giorni, trasferire le cellule incapsulate su cellule PA6 e differenziarle per 28 giorni.In definitiva, l'analisi dell'espressione genica e proteica mostra una maggiore efficienza nella generazione di neuroni dopaminergici. Il principale vantaggio di questa particolare tecnica rispetto al protocollo di differenziazione 2D esistente è che si cerca di propagare e differenziare queste cellule in un ambiente 3D, il quale fornisce l'opportunità di propagare le cellule in maniera ad alta densità. Inoltre, consente anche una migliore interazione tra cellula e cellula durante il processo di differenziazione.E in terzo luogo, offrirvi anche una maggiore efficienza di differenziazione nel corso del tempo. Inoltre, se posso aggiungere, questa particolare tecnica può essere adattata anche

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Questo video mostra lo sviluppo e la differenziazione delle cellule staminali neurali umane all'interno di un'impalcatura tridimensionale. Un rivestimento di laminina sull'impalcatura favorisce l'adesione cellulare, mentre un mezzo neurale privo di fattore di crescita induce la differenziazione cellulare in cellule progenitrici neurali, che estendono i loro processi all'interno di un'architettura porosa in più direzioni, formando una coltura...

Differenziazione delle cellule staminali neuronali umane in colture 3D utilizzando un'impalcatura porosa

In questo video, viene dimostrato un protocollo graduale per le cellule staminali embrionali umane in organoidi neurali. Il metodo prevede l'induzione della formazione di rosette neuronali, seguita da una maturazione controllata e dalla coltura finale su una membrana idrofobica per ottenere organoidi neurali completamente sviluppati.

Differenziazione e maturazione di cellule staminali embrionali umane in organoidi neurali

Dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura di cellule staminali embrionali umane in vitro con la seconda nanoparticelle generano armoniche. Metodologie di indagine hESC mediante microscopia multi-fotone e la loro differenziazione in gruppi cardiache sono anche presentati.

Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Abbiamo stabilito un metodo per incapsulare cellule staminali pluripotenti (cellule PS) in capsule di idrogel di alginato utilizzando un ugello coassiale.  Ciò impedisce alle cellule di aggregarsi eccessivamente e limita lo stress da taglio sperimentato dalle cellule in coltura in sospensione.  La tecnica è applicabile alla produzione di massa di cellule PS e alla ricerca sulla nicchia delle cellule staminali.

Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità intrinseca di differenziare e di auto-organizzarsi in schemi dei tessuti distinti; anche se questo richiede la presentazione di gradienti spaziali ambientali. Presentiamo stencil micropatterning come metodo semplice e robusto per generare gradienti biochimici e meccanici per controllare modelli differenziazione HPSC.

Stencil micropatterning di cellule staminali umane pluripotenti per Probing spaziale Organizzazione di differenziazione Fates

Questo protocollo descrive un approccio per produrre epatosfere da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un sistema di coltura definito e l'autoassemblaggio delle cellule. Questo protocollo è riproducibile in un certo numero di linee cellulari, conveniente e consente la produzione di epatosfere umane stabili per l'applicazione biomedica.

Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

I ligandi a matrice extracellulare possono essere modellati su idrogel di poliacrilammide per consentire la coltura di cellule staminali embrionali umane in colonie confinate su substrati conformi. Questo metodo può essere combinato con la microscopia a forza di trazione e i saggi biochimici per esaminare l'interazione tra la geometria dei tessuti, le forze generate dalle cellule e le specifiche del destino.

Modellazione della geometria delle colonie di cellule staminali embrionali umane su substrati conformi per controllare la meccanica a livello di tessuto

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).

Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane

Questo articolo descrive l'incapsulamento di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale. Dimostriamo che questa tecnologia di incapsulamento microfluidico consente una formazione efficiente di sferoidi hPSC.

Fabbricazione microfluidica di microcapsule Core-Shell che trasportano sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane

Scopri la microincapsulazione di cellule staminali embrionali umane in microcapsule di alginato per la differenziazione in neuroni dopaminergici in un sistema 3D. Questo metodo migliora le interazioni cellulari e l'efficienza differenziativa.

Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee (Video) | JoVE Journal

Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

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