Valutazione di espressione GFP e sostenibilità Utilizzando la Image-Based Tali Citometro

Questo video mostra una procedura per determinare la vitalità cellulare nelle cellule che esprimono GFP utilizzando il citometro a immagini tally. Le cellule trasdotte GFP vengono colorate utilizzando il kit di vitalità tally dead cell red, che colora tutte le cellule morte di rosso con ioduro di propidio, le cellule vengono pipettate in un vetrino di analisi cellulare tally e caricate nel citometro, che acquisisce e analizza immagini in campo chiaro e di fluorescenza rossa e verde. Vengono quindi generati istogrammi per visualizzare la conta cellulare, le dimensioni delle cellule, l'intensità della fluorescenza PI e l'intensità della fluorescenza GFP rispetto alla citometria a flusso tradizionale.

Tali può fornire dati simili per quanto riguarda la vitalità e l'espressione cellulare. Tuttavia, questa citometria basata su immagini fornisce ulteriori informazioni visive sulla popolazione cellulare esaminata. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la citometria a flusso o la microscopia a fluorescenza è che il citometro a immagini tally fornisce contemporaneamente informazioni quantitative e visive sul campione cellulare.

Inoltre, lo strumento di conteggio è più facile da usare, è meno costoso e ha un ingombro ridotto rispetto a un citometro a flusso o a un microscopio a fluorescenza. Ciò consente ai ricercatori di eseguire rapidamente saggi quantitativi come la vitalità nelle cellule che esprimono GFP sul banco. In questa procedura, le cellule OS U2 a una concentrazione di una volta 10 per le sei cellule per millilitro sono state trasdotte con un costrutto virale GFP a luce cellulare mirata nucleare per sostenere le cellule morte con il trasferimento di ioduro di propidio 100 microlitri della sospensione cellulare in una nuova provetta per microcentrifuga.

Si noti che per il test si raccomanda una concentrazione di una volta da 10 a una volta da 10 a una settima cellula per millilitro, anche se la concentrazione non deve essere esatta. Quindi, aggiungere un microlitro di reagente rosso a cellule morte tally. Quindi agitare brevemente per mescolare, incubare il reagente di colorazione e la miscela cellulare a temperatura ambiente al buio per uno-cinque minuti.

Dopo l'incubazione, procedere immediatamente all'analisi sul citometro basato su immagini di conteggio. Il conteggio utilizza vetrini di analisi cellulare in plastica monouso progettati specificamente per lo strumento. Assicurati sempre di tenere la diapositiva per i bordi per caricare la diapositiva.

Pipettare lentamente 25 microlitri di campione in una delle aree di caricamento del campione a forma di mezzaluna. Qui, le cellule di controllo non trasdotte non colorate vengono caricate nella camera A e le cellule che esprimono GFP colorate vengono caricate nella camera B.To eseguire un saggio di vitalità nelle cellule che esprimono GFP, toccare G-F-P-R-F-P sulla schermata iniziale del citometro. Le opzioni del test appariranno quindi sulla destra: selezionare GFP più vitalità.

Lo strumento chiederà quindi se la serie di campioni deve essere nominata per denominare la serie di campioni. Premi il nome ora. Quindi, utilizzando il touch screen, digitare il nome della serie di campioni e premere salva, il citometro tally avanzerà automaticamente alla schermata di misurazione.

Successivamente, per misurare la fluorescenza dello sfondo, premere la scheda dello sfondo nella metà in basso a destra della schermata di misurazione, come si può vedere qui. L'impostazione predefinita indica che verranno visualizzati nove campi di celle. Ora con il campione di controllo rivolto lontano dallo strumento, inserire il vetrino nella porta di caricamento fino all'arresto.

Non applicare forza sullo schermo di sfondo, toccare premere per inserire un nuovo controllo cellulare non colorato. Il vetrino verrà automaticamente inserito nello strumento e sullo schermo verrà visualizzata un'immagine dal vivo delle cellule. Utilizzando la manopola di messa a fuoco, portare le celle nel piano di visione corretto durante la messa a fuoco.

Far scorrere il pulsante rosso dello zoom su quattro x o 16x. Per visualizzare meglio la popolazione cellulare, le cellule dovrebbero essere uniformemente scure con un alone luminoso attorno a ciascuna. Come mostrato qui, le celle possono essere sottostimate quando la transizione tra lo sfondo e i bordi delle celle è sfocata in modo che i confini delle celle non siano ben definiti.

Le cellule possono essere sovracontate quando hanno centri luminosi e perimetri scuri. Una volta che le cellule sono state messe a fuoco, toccare, premere per eseguire il controllo delle cellule non colorate. Per misurare la fluorescenza di fondo, il citometro acquisirà automaticamente le immagini e visualizzerà le miniature di ciascun campo visivo.

La barra di avanzamento fornisce un aggiornamento continuo dell'analisi. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, il citometro espelle automaticamente il vetrino e fornisce i dati dell'analisi delle immagini acquisite. I dati memorizzati vengono visualizzati nel menu a discesa della scheda in background.

Al campione di controllo in background verrà assegnato lo stesso nome assegnato all'esperimento. Per eseguire il campione trasdotto GFP colorato con PI, rimuovere il vetrino dallo strumento, capovolgerlo e reinserirlo con il campione trasdotto rivolto lontano dallo strumento. Premere la scheda del campione, quindi toccare premere per inserire un nuovo campione.

Quando l'immagine appare sullo schermo, utilizzare la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco le celle. Come prima, quindi toccare premere per eseguire il campione. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, i dati dell'analisi vengono visualizzati nella scheda del campione e il citometro espelle automaticamente il vetrino in modo appropriato.

Smaltire il vetrino di analisi cellulare tally. In quanto rifiuti a rischio biologico, questi vetrini non possono essere riutilizzati. Una volta eseguito il campione, è possibile applicare delle soglie al campione.

Per analizzare popolazioni cellulari specifiche, regoleremo le soglie per determinare la percentuale di cellule vive e morte. Nelle cellule che esprimono GFP nella scheda del campione, il numero e la percentuale di cellule che esprimono GFP vive e di cellule morte che esprimono la vitalità totale della GFP. Vengono visualizzate la dimensione media delle cellule, il numero di cellule contate e la concentrazione delle cellule.

Inoltre, nella parte inferiore dello schermo vengono visualizzati i grafici dell'istogramma che mostrano la dimensione delle cellule, la fluorescenza verde e la fluorescenza rossa. Per impostare il gate della dimensione della cella, toccare la miniatura della dimensione della cella per aprire l'istogramma della dimensione della cella ed escludere eventuali detriti. Spostare le barre di scorrimento blu per escludere sia gli eventi grandi che quelli piccoli.

Tocca applica per includere le celle all'interno dei cancelli. Per aggiungere la fluorescenza GFP all'analisi, toccare la miniatura dell'istogramma GFP. Per aprirlo.

Sposta la barra di scorrimento blu per impostare la soglia appena a destra del picco più scuro. Utilizzare l'esempio di controllo come guida. Ciò consente all'analisi di includere le cellule GFP positive, ma di escludere le cellule autofluorescenti.

L'autofluorescenza è frequentemente osservata quando le molecole biologiche all'interno delle cellule sono eccelle touch applicare per confermare e tornare alla schermata precedente. I dati visualizzati nella scheda del campione dovrebbero ora riflettere i gate e la soglia impostati per entrambi i canali di fluorescenza. Successivamente, per separare le cellule di colorazione PI dall'autofluorescenza o da qualsiasi sfondo presente nel campione, premere la miniatura dell'istogramma PI per aprirlo di nuovo.

Il picco del campione di controllo verrà visualizzato come un picco grigio sull'istogramma. Il picco rosso è la fluorescenza del campione. La fluorescenza di fondo viene visualizzata come un picco più vicino al valore RFU zero su questo strumento.

Per eliminare la fluorescenza di fondo nel canale PI, spostare la barra di scorrimento blu per regolare la soglia. Per escludere questo picco, utilizzare il picco grigio dal campione di controllo come riferimento. Quando la soglia nel canale PI è impostata in modo appropriato, toccare applica per confermare e tornare alla schermata precedente, lo strumento di conteggio rianalizzerà nuovamente automaticamente i dati e aggiornerà i risultati nella scheda del campione.

Quindi, per confermare visivamente che ogni cella è assegnata correttamente, premere la scheda dello zoom, quindi selezionare un campo visivo acquisito per la revisione premendo la miniatura dell'immagine. Quindi premere la scheda dei livelli. Quindi, premere il pulsante GFP o PI per visualizzare l'immagine acquisita attraverso quel canale.

Premere nuovamente lo stesso pulsante per rimuovere il livello dal display o per sovrapporre i livelli, toccare i pulsanti corrispondenti a ciascun canale per identificare come vengono contate le celle attraverso un particolare canale. Le cellule che sono state contate solo attraverso il canale del campo chiaro, che non esprimono la fluorescenza, saranno cerchiate in blu. Ciò indica che una particolare cellula è costituita da cellule vive che si esprimono nel canale verde.

La GFP sarà cerchiata in cellule verdi che esprimono nel canale rosso. Colorati con pi greco saranno cerchiati in rosso e le cellule morte contate in entrambi. Il canale rosso e verde saranno cerchiati in giallo.

Ciò indica che la cellula esprime GFP ma è anche colorata con pi greco e quindi è morta. Di tanto in tanto sullo schermo apparirà un cerchio nero. Si tratta di oggetti che sono stati identificati ma che sono stati esclusi dall'analisi in base alla dimensione della cella.

Continuare a regolare con precisione la soglia sull'istogramma della fluorescenza utilizzando i passaggi appena descritti fino a quando ogni cellula che esprime la fluorescenza non viene cerchiata con il colore appropriato. Tutti i parametri di analisi vengono salvati automaticamente sullo strumento. Sotto il rubinetto dati.

Il conteggio può memorizzare file di dati da 500 esecuzioni di campioni. Ogni file memorizzato nella scheda dati è disponibile per la rianalisi. Selezionando il file dalla scheda dati, questo verrà riaperto e tutti gli istogrammi e i layer diventeranno attivi per archiviare i dati e generare report.

I dati memorizzati nello strumento possono essere trasferiti a un computer utilizzando un'unità USB. Quattro tipi di cellule rappresentative sono stati trasdotti con una luce cellulare a bersaglio nucleare, un costrutto virale GFP colorato con un kit di vitalità del conteggio utilizzando il reagente rosso a cellule morte e analizzato dal conteggio in un citometro a flusso, come mostrato qui. Entrambi i metodi hanno riportato approssimativamente la stessa percentuale della popolazione per ciascun tipo di cellula che esprimeva GFP, insieme alla percentuale della popolazione totale che era sia vitale che esprimeva GFP.

Questi dati dimostrano che il citometro Tali è in grado di discriminare tra l'espressione totale di GFP in una popolazione e l'espressione di GFP nella popolazione viva. Abbiamo appena dimostrato come utilizzare il citometro basato su immagini tally per valutare l'espressione e la vitalità della fluorescenza nel campione di cellule. Questa tecnologia colma il divario tra gli studi su cellule individuali e quelli su cellule di popolazione.

Utilizzando il citometro a immagini tally, è possibile raccogliere informazioni visive quantitative e qualitative su singole cellule e su popolazioni cellulari più grandi. Utilizzando la stessa procedura, è possibile eseguire diversi altri saggi, tra cui l'apoptosi, l'espressione RFP e la vitalità cellulare Per le cellule non esprilici, le potenziali applicazioni includono la valutazione dell'espressione genica per gli studi sull'efficacia dei farmaci.