Identificazione e caratterizzazione di glicosilazione delle proteine ​​con specifiche endo-e exoglycosidases

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di illustrare l'uso del glicosato per la deglicosilazione enzimatica e l'analisi della glicosilazione legata a n e O su una glicoproteina modello. Ciò si ottiene trattando una glicoproteina con F di PGA o con la miscela di deglicosilazione proteica. Inoltre, la miscela di deglicosilazione proteica è stata integrata con una miscela di exo glico ass aggiuntivo, che a volte aiuta a rimuovere zuccheri altrimenti resistenti.

Illustriamo questo metodo utilizzando un modello di gonadotropina corionica umana ricombinante glicoproteina beta, o HCG beta pagina SDS successiva, seguito dalla colorazione blu di Kumasi e da un metodo di colorazione specifico per lo zucchero. I Pro Q Emerald 300 vengono utilizzati per analizzare il D glicosilato. Si ottengono i risultati del campione di HCG beta, che mostrano che l'HCG beta è eterogeneamente glicosilato e contiene più forme di glico in base alle differenze nella migrazione delle proteine con e senza trattamento con glicosato e al segnale diminuito sulla colorazione ProQ man mano che i glicani vengono successivamente rimossi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi della spettrometria di massa, è che è semplice, utilizza attrezzature di laboratorio comuni ed è buona per il glicobiologo alle prime armi. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo del glico, come ad esempio la mia proteina glicosilata. Per iniziare la deglicosilazione enzimatica, scongelare i tamponi forniti dal kit di deglicosilazione delle proteine.

Mescolare accuratamente i tubi e mantenerli a temperatura ambiente. Mettere le fiale contenenti l'enzima sul ghiaccio, sciogliere il contenuto della fiala di HCG beta in 600 microlitri di acqua distillata e conservare in ghiaccio. Dopo aver preparato un millilitro di un tampone XG seven diluendo il brodo 10 x in acqua distillata, utilizzare 25 microlitri per diluire 0,5 microlitri di p p.

Preparare la miscela di esoglicosato combinando due microlitri, ciascuna delle quattro malattie da esoglico. Quindi, aggiungere HCG beta e 10 x tampone denaturante glicoproteico a sette provette PCR numerate come indicato nel protocollo scritto, tappare le provette e mescolare delicatamente denaturare le proteine nel termociclatore incubando 10 minuti a 94 gradi Celsius, seguiti da una presa di quattro gradi Celsius Dopo aver rimosso le provette dalla centrifuga del termociclatore per rimuovere qualsiasi condensa visibile su ciascuna provetta di reazione, Aggiungere i reagenti rimanenti secondo il protocollo scritto. Chiudere le provette per PCR utilizzando nuovi tappi.

Quindi mescolare le provette picchiettando delicatamente quattro volte dopo aver centrifugato il contenuto, posizionare le provette nel termociclatore incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Successivamente raffreddando i campioni a quattro gradi Celsius. Per configurare la pagina SDS, preparare un nuovo buffer di caricamento SDS che riduce tre volte.

Con DTT, aggiungere 12,5 microlitri del tampone di caricamento SDS tre volte riducente preparato A ciascun campione, chiudere le provette con nuovi tappi e picchiettare delicatamente le provette per mescolare. Incubare le provette in un termociclatore a 94 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddare a quattro gradi Celsius Dopo il carico di incubazione, 30 microlitri di ciascun campione e 10 microlitri del marcatore proteico su un gel di triglicina dal 10 al 20%. Salvataggio del resto di ogni campione.

Elettrolizzare il gel a 130 volt fino a quando il fronte D non si trova vicino alla parte inferiore del gel. Quando il gel ha finito di funzionare, rimuovi il gel dal gesso e mettilo in una piccola scatola di plastica con abbastanza macchia blu kumasi da coprire la macchia di gel. Il gel per un'ora con una leggera agitazione Dopo che il gel è macchiato.

Lavare tre volte per 30 minuti. In 50 millilitri di soluzione di detenzione, registrare le immagini utilizzando un transluminatore a luce bianca o uno scanner. In alternativa, il gel può essere asciugato tra fogli di cellophane.

In un fotogramma, fai scorrere il resto di ciascun campione e un marcatore proteico su un gel di triglicina al 10-20% mentre il gel è in funzione. Sciogliere il reagente smeraldo ProQ con DMF e preparare le soluzioni stock, fix, wash e ossidanti per la macchia seguendo il manuale del prodotto fornito con il kit. Al termine dell'elettroforesi, rimuovere il gel dal calco e metterlo in una scatola di plastica.

Fissare il gel aggiungendo 100 millilitri della soluzione fissa preparata. Lasciare il gel per una notte a temperatura ambiente con una leggera agitazione il giorno successivo. Lavare il gel con 100 millilitri della soluzione di lavaggio preparata per 10-20 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione, ripetendo il lavaggio una seconda volta con una soluzione di lavaggio fresca.

Successivamente, ossidare i carboidrati incubando il gel con leggera agitazione per 30 minuti in 25 millilitri della soluzione ossidante preparata, seguire l'incubazione con due lavaggi aggiuntivi mentre il gel viene lavato. Preparare il colorante fresco ProQ emerald 300 aggiungendo 500 microlitri della soluzione reattiva ProQ Emerald 300 a 25 millilitri di tampone colorante fornito nel kit. Colorare il gel incubando nel colorante preparato in condizioni di oscurità con una leggera agitazione per 90-120 minuti dopo la colorazione del gel.

Ripetere le due fasi di lavaggio come descritto in precedenza. Quindi registra le immagini con un illuminatore trans UV a 300 nanometri. Come passaggio finale, confronta le immagini del gel colorato con kumasi con il gel colorante allo smeraldo ProQ.

I cambiamenti nella migrazione delle proteine dopo la deglicosilazione enzimatica possono essere osservati quando il campione di controllo viene confrontato con il trattamento F del PGA. Per rimuovere gli n glicani e per il trattamento di miscela di deglicosilazione per rimuovere gli n e gli O glicani, non si osserva un'ulteriore riduzione delle dimensioni dopo la digestione con glicosato aggiuntivo. Oltre a un cambiamento di massa, le bande diventano più nitide man mano che i glicani vengono rimossi.

Una banda che corre sotto il marcatore di 17 kilodalton probabilmente rappresenta il polipeptide beta HCG completamente deglicosilato. Le corsie da cinque a sette mostrano le bande corrispondenti al glico. Altre bande potrebbero derivare da deglicosilazione incompleta o da più proteine non identificate presenti nel campione di HCG beta.

Il reagente verde smeraldo ossida e colora tutti i glicani presenti in una molecola proteica. Pertanto, l'intensità del segnale diminuisce man mano che l'HCG beta viene glicosilato enzimaticamente. Il segnale residuo nella corsia tre e quattro indica la presenza di motivi di glicani, che sono resistenti agli enzimi utilizzati.

Il glicosato aggiuntivo viene utilizzato nella corsia quattro. Eliminate qualche residuo di zucchero in più. La migrazione delle proteine è la stessa, ma si può osservare una leggera riduzione dell'intensità nella colorazione.

Le frazioni zuccherine resistenti non erano presenti in tutte le specie proteiche. Alcune bande non sono state rilevate dal verde smeraldo, indicando che erano ampiamente deglicosilate Ulteriori dati supportano la conclusione che HCG beta è eterogeneamente glicosilato. La banda inferiore sulla corsia due è debole sull'immagine verde smeraldo.

Mentre la banda superiore sulla corsia due è luminosa, indicando che molti gruppi GLYCAN sono ancora presenti, questi dati supportano la conclusione che l'HCG beta ricombinante espresso nelle cellule di topo contiene più forme di glico a causa dell'intrinseca eterogeneità della glicosilazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettrometria di massa per rispondere a ulteriori domande come: qual è il tasso di occupazione? Qual è l'entità della glicosilazione o qual è la struttura fine dei glicani?

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il glicosilato per la deglicosilazione enzimatica e l'analisi dei glicani legati agli NNO. Sulle glicoproteine. La scelta del rilevamento può essere difficile perché le regioni di colorazione delle proteine sono utili solo se la deglicosilazione provoca uno spostamento significativo della massa molecolare per altre proteine.

Abbiamo osservato migrazioni anomale dopo la glicosilazione e abbiamo scoperto che qualsiasi cambiamento nella migrazione è la prova che la proteina è stata glicosilata.