L'identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Questa procedura inizia con la coltura del ceppo esca in terreni contenenti aminoacidi normali nel ceppo di controllo SLAC e lisina isotopica pesante e arginina. Quantità uguali di entrambi i ceppi vengono miscelate e lisate mediante macinazione e lisati grezzi di azoto liquido, prima pellettati mediante centrifuga e poi eliminati legandosi a perle di sfero. Il lisato cellulare viene quindi legato alle perle di IgG.

Le proteine legate alle perle di IgG sono alluse dalla proteasi, scisse e precipitate. Il campione è ora pronto per l'analisi mediante spettrometria di massa. Ciao, sono Jesse Chao del Lone Lab del Dipartimento di Biologia Cellulare Ambientale dell'Istituto di Scienze della Vita dell'Università della British Columbia.

Oggi vi mostro una procedura per l'analisi proteomica quantitativa chiamata silak. Combinato con la purificazione per affinità. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i complessi proteici.

Quindi iniziamo In questa procedura, il ceppo esca contiene aminoacidi normali mentre il ceppo di controllo SLAC contiene isotopici pesanti, lisina e arginina. Per iniziare, per prima cosa, coltiva un litro, ciascuna delle varietà di esca e la varietà di controllo separatamente al valore mostrato sullo schermo. Quindi, versare la coltura in provette da centrifuga Nalgene da 500 millilitri.

Bilanciare il carico nelle celle a pellet a 2.580 RCF, decantare il mezzo e risospendere il pellet. Con 50 millilitri di D H2O freddo mentre si trasferiscono le celle a 50 millilitri, provette da centrifuga, centrifugare le provette per pellettare le celle a 3000 RCF. A questo punto, puoi congelare il pellet a meno 80 gradi Celsius.

È importante ricordare di abbinare la coltura del ceppo di controllo alla coltura del ceppo esca in uno a uno in base al peso del pellet secco. Risospendere ogni pellet cellulare in 10 millilitri di tampone NP 40 con un cocktail di inibitori della proteasi da uno a 2000. Mescolare le due colture cellulari travasando direttamente una provetta nell'altra.

Per iniziare a macinare prima le cellule, versare l'azoto liquido nella malta pre-raffreddata e lasciarla evaporare completamente. Quindi, aggiungi due millilitri di celle alla malta. Versare un po' di azoto liquido per congelare le cellule.

Macina le cellule fino a quando le cellule non diventano fini. Polvere. Ripeti il processo fino a quando tutte le celle sono macinate. Assicurati di non permettere alle celle di scongelarsi.

Aggiungere azoto liquido quando necessario. Quindi, trasferisci la polvere in un bicchiere ghiacciato e scongelala a temperatura ambiente. Quando i bordi iniziano a scongelarsi, aggiungere 20 millilitri di tampone NP 40 con un PIC da uno a 200 dopo che si è scongelato.

Trasferire il lisato grezzo in provette Nalgene da 40 millilitri e centrifugare a 16.000 giri/min in un rotore Sovos SA 600 per 30 minuti. Nell'attesa, prelevare 300 microlitri di due perle B degli SRO e lavare le perle in 300 microlitri di tampone NP 40 tre volte. Quindi, risospendere le perle in tamponi da 300 microlitri in modo che si trovino in un impasto uno a uno.

Il passo successivo consiste nel pre-eliminare il lisato cellulare. Per fare questo, per prima cosa, trasferisci il super natin in un nuovo tubo e aggiungi le due perline B di Spheros. Incubare su una piattaforma rotante in una cella frigorifera per 30 minuti.

Durante l'incubazione, prelevare 300 microlitri di IgG SRO sei perle e lavare le perle in 300 microlitri di tampone NP 40 tre volte. Quindi risospendere le perle in tamponi da 300 microlitri in modo che si trovino in un impasto uno a uno. Dopo l'incubazione, pellettare gli SRO.

Due essere perline in. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ricordarsi di conservare un'aliquota del lisato cellulare per il western blotting in un secondo momento.

Quindi aggiungere le perle IgG. Separare il contenuto in due provette per un legame più efficiente, incubare su una piattaforma rotante in una cella frigorifera per due ore. Dopo l'incubazione, raccogliere le perle in una colonna cromatografica a quattro gradi Celsius.

Assicurati di salvare un'aliquota della fazione non vincolata. Lavare le perline con 10 millilitri. Tampone NP 40.

Quindi, lava le perline con tre millilitri. Buffer TEVC. Anche in questo caso, ricordatevi di conservare un'aliquota delle perline.

Questo rifletterà l'efficienza del legame per eluire le perline. Innanzitutto, aggiungi cinque microlitri di A-C-T-E-V a un millilitro di tampone TEVC. Aggiungere il tampone TEVC alle perline e mescolare.

Trasferire il contenuto in due provette EINOR da 1,5 millilitri da una miscelazione più efficiente e incubare su una piattaforma rotante in una cella frigorifera per una notte. Quindi, centrifugare le perline e trasferire l'eluato in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Lavare le perle con ulteriori 0,5 millilitri di tampone TEVC dopo il lavaggio.

Combina gli otto in un unico tubo. Dovresti avere 1,5 millilitri di ELU otto in totale. Risparmia un'aliquota del TEV Elu otto per precipitare.

Regolare le aliquote al 25% di TCA con un TCA del cento per cento. Per fare ciò, separare l'otto LU da 1,5 millilitri in due tubi da 750 microlitri ciascuno. Aggiungere 250 microlitri di 100% TCA al tubo.

La tua soluzione dovrebbe diventare lattiginosa. Quindi, mettilo sul ghiaccio per 30 minuti. Periodicamente agitare la miscela dopo l'incubazione.

Centrifugare alla massima velocità nella centrifuga da tavolo in una cella frigorifera per 30 minuti. Lavare una volta con 500 microlitri di acetone ghiacciato contenente 0,05 acido cloridrico normale. Quindi centrifuga per cinque minuti alla massima velocità a quattro gradi Celsius.

Successivamente, lavare una volta con 500 microlitri di ghiaccio freddo, acetone e centrifugare per cinque minuti a una velocità massima di quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, rimuovere con cura l'acetone e asciugare il pellet per la colorazione dell'argento. Risospendere il pellet in 50 microlitri di una volta il tampone campione SDS.

Se si prevede di utilizzare la proteina precipitata per l'analisi basata sulla spettrometria di massa, si consiglia di precipitare utilizzando l'etanolo. Per fare ciò, aggiungere prima 20 microgrammi di glicogeno, quindi diluire i campioni cinque volte con etanolo al cento per cento e regolare a 50 millimolari di bicarbonato di sodio con un ceppo molare da 2,5 a pH 5,0. Mescolare la soluzione capovolgendo il tubo.

Lasciate riposare per due ore a temperatura ambiente. Infine, dividere il contenuto in due provette di einor. Pellettare la proteina precipitata mediante centrifugazione per 10 minuti a 12.000 GS a temperatura ambiente.

L'aliquota salvata durante la procedura di purificazione deve includere il lisato cellulare pre-chiarito, la frazione legata, la frazione non legata e la frazione elusa. Si consiglia di analizzare il contenuto proteico delle aliquote di cui sopra mediante Western blotting utilizzando l'anticorpo Antit TAP o la colorazione con argento per riflettere l'efficienza di legame ed eluizione dell'esperimento. In questo gel colorante d'argento purificato SCS due tocchi al suo interagente, i partner sono stati visualizzati e confrontati con un controllo non marcato in questo Western blot.

Varie fazioni prese durante la purificazione di SCS two tap sono state analizzate mediante Western blotting utilizzando l'anticorpo Antit tap. Si noti che SCS two tap è migrato a un peso molecolare inferiore dopo l'eluciano mediante scissione della proteasi TEV, e non c'era più S SCS two tap sulle perle IgG dopo l'eluizione. Ciò ha confermato che la purificazione era altamente efficiente.

Ti abbiamo appena mostrato come purificare i complessi proteici mediante purificazione per affinità con le perle di IgG. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di essere sicuri di abbinare la deformazione di base e la deformazione di controllo in base al peso della pelle secca prima di iniziare la procedura di purificazione. Poiché LAC ci fornisce misurazioni unbias e qued dei partner di legame delle proteine, eseguiamo solo la prima fase della purificazione a rubinetto per ridurre al minimo la perdita di campione.

Se si verificano quantità significative di binding non specifici, si consiglia di eseguire l'intero protocollo, che può essere trovato nel manuale del porto di sorgente fredda. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

Ehi, dai, Mark. Ah, vai.