Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di differenziare le cellule staminali embrionali di topo in motoneuroni. Topo di prima coltura, cellule staminali embrionali su fibroblasti embrionali primari di topo e integratore con fattore inibitorio della leucemia. Quindi migliorare il processo di normalizzazione aggiungendo noggin BFG F e FGF otto inducono la specificazione del motoneurone mediante incubazione con acido retinoico e agonista levigato, che è seguito dall'allungamento dell'assone e dalla maturazione del motoneurone.

Infine, utilizzare la microscopia a immunofluorescenza per esaminare le cellule MES differenziate che esprimono una forte fluorescenza GFP La generazione di grandi quantità di motoneuroni ha facilitato la ricerca nelle malattie dei motoneuroni rispetto agli attuali protocolli esistenti. Questo approccio di differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in motoneuroni è più efficiente. Questo metodo può fornire informazioni sull'atrofia muscolare spinale.

Può anche essere applicato ad altre malattie del motoneurone, come la sclerosi laterale amiotrofica: per piastrare, i fibroblasti embrionali primari di topo ricoprono quattro piastre di coltura tissutale da 100 millimetri con otto millilitri di soluzione di gelatina allo 0,1%. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, scartare il liquido in eccesso. Ora diluire un flaconcino di mitomicina C in PMEF attivato in 40 millilitri di piastra di terreno PMEF sulle quattro piastre e coltivare per un massimo di una settimana.

Quindi, scongelare una fiala di cellule MES in un bagno d'acqua a 37 gradi. Lavare le celle con cinque millilitri di terreno E ES in una provetta da 15 millilitri. Dopo aver centrifugato a 800 giri/min per cinque minuti.

Aspirare il surnatante e risospendere le cellule MES in 20 millilitri di terreno ES con fattore inibitorio della leucemia appena aggiunto. Procedere alla rimozione di 10 millilitri di terreno dalle colture PMEF e sostituirli con 10 millilitri della sospensione di tre cellule ES HBG. Monitorare la progressione delle cellule MES nel tempo da piccole colonie a 24 ore a colonie di circa 100 micrometri di diametro a 72 ore dopo la piastra.

Sostituire quotidianamente i terreni per mantenere la proliferazione delle cellule per l'induzione delle cellule MES. Differenziazione in motoneuroni. Le cellule staminali embrionali di topo devono essere prima separate dalle cellule di alimentazione PMEF e poi coltivate in un ambiente di sospensione il giorno dell'induzione.

Per ogni coltura ES da 100 millimetri, preparare un pallone da 50 mm rivestito con gelatina allo 0,1% Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, rimuovere la gelatina in eccesso e lavare tre volte con PBS. Continuate ad aspirare con cura i terreni dalla coltura ES, assicurandovi di non rimuovere le colonie attaccate in modo lasco. Quindi lavare una volta con 10 millilitri di PBS.

Ora, per separare le cellule MES dal PMEF, aggiungere tre millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% e incubare per tre-cinque minuti. A 37 gradi Celsius, verificare che le cellule staminali e il PMEF si siano staccati dalla piastra. Quindi aggiungere 15 millilitri di terreno ES fresco e disgregare le colonie mediante pipettaggio.

Trasferire la sospensione cellulare nel pallone da 50 T rivestito di gelatina preparato, incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius affinché la PFS si attacchi alla superficie gelatinizzata. Ora raccogli le celle MES galleggianti in un tubo da 50 millilitri e pellet per centrificazione. Risospendere le cellule in 10 millilitri di differenziazione neurale.

Effettuare l'enumerazione del terreno utilizzando un emocitometro e quindi la piastra su un piatto di coltura in sospensione da 100 millimetri durante la differenziazione. Il primo giorno, verificare al microscopio che le cellule MES abbiano formato piccoli aggregati galleggianti chiamati corpi embrionali. Poiché l'eventuale PMEF di riserva è attaccato alla capsula, trasferire le celle di sospensione ES e il terreno in una provetta da 15 millilitri, quindi centrifugare a 500 giri/min per tre minuti.

Per raccogliere i corpi embrionali, aspirare con cura il terreno, aggiungere 10 millilitri di differenziazione neurale fresca, il terreno all'ebs pellettato, quindi piastrare le cellule in una nuova coltura batterica per 24 ore durante la differenziazione. Secondo giorno, agitare il piatto di coltura e trasferire il terreno e l'EBS in una provetta da 15 millilitri. Lasciare che l'EBS si depositi per gravità, quindi aspirare con attenzione il fluido e sospendere l'EBS e 10 millilitri di differenziazione dei motoneuroni.

Coltura media EBS in una nuova piastra batterica per cinque giorni di differenziazione. Settimo giorno, verificare che le EBS abbiano un diametro compreso tra 150 e 200 micrometri ed esprimano forti segnali GFP sulla differenziazione. Il quinto giorno, due giorni prima di dissociare l'EBS, posizionare dei vetrini di copertura rotondi da 12 millimetri sul fondo di una piastra da 24 pozzetti.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di 100 microgrammi per millilitro, poli DL ornitina e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Aspirare le piastre di asciugatura all'aria di poli-DL ornitina e i vetrini coprioggetti in una cappa per coltura tissutale. Sciacquare i pozzetti della piastra con acqua distillata doppia tre volte.

Lasciare asciugare all'aria per rivestire i vetrini. Fare una nuova diluizione di due microgrammi per millilitro di laminina di topo in cinque millilitri di ghiaccio freddo un XPBS. Aggiungere 0,5 millilitri per pozzetto e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.

Lavare due volte con PBS sulla differenziazione. Settimo giorno, raccogliete l'EBS in un tubo da 15 millilitri e lasciate che l'EBS si depositi per gravità. Dopo quattro lavaggi con PBS, aggiungere un millilitro di ACU max all'EBS, mescolare delicatamente e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare l'ACU max in eccesso, coprendo l'ebs.

Ora aggiungere tre millilitri di terreno MND e dissociare l'EBS pipettando circa 20 volte utilizzando una micropipetta da un millilitro, quindi incubare per due minuti a temperatura ambiente, passare la sospensione cellulare attraverso un tappo per il trainer cellulare in una provetta da 12 x 75 millimetri. Ripetere questa fase di dissociazione con i grumi e le cellule rimanenti trattenuti dal filtro in modo da arricchire la resa delle singole cellule in una sospensione finale di una singola cellula di sei millilitri. Mescolare delicatamente la sospensione di singole cellule e contare le cellule utilizzando un emocitometro per diluire le cellule in un terreno MND completo a una densità di due volte 10 fino alla quinta cellula per millilitro di piastra.

0,5 millilitri di sospensione cellulare per pozzetto delle piastre da 24 pozzetti preparate contenenti vetrini di copertura rivestiti di poli-DL ornitina laminina. Le cellule differenziate estendono i neuriti lunghi dopo due giorni. In coltura, HBG 3 è una linea cellulare ES derivata da un topo transgenico che esprime EGFP sotto il controllo di un promotore specifico del motoneurone HB nine con un protocollo di differenziazione definito.

Le cellule MES possono essere utilizzate per derivare i motoneuroni. Le cellule MES indifferenziate formano colonie rotonde sulla parte superiore di uno strato di alimentazione di fibreblast. Hanno una debole espressione di GFP.

Queste cellule MES sono state separate dagli strati di alimentazione e coltivate su piastre a basso attaccamento per formare corpi embrionali. Le cellule MES differenziate hanno espresso una forte fluorescenza GFP dopo il settimo giorno. Differenziazione Gli EBS sono stati dissociati e placcati su piastre rivestite di poli-DL ornitina laminina.

Le cellule differenziate estendono lunghi neuriti dai corpi cellulari delle cellule piastrate dopo due giorni in coltura, i motoneuroni derivati dalle cellule MES possono essere caratterizzati mediante colorazione in immunofluorescenza. Queste cellule GFP positive esprimono il neurofilamento marcatore panneuronale e i due marcatori specifici del motoneurone. La palpebra uno e la colina acetil transferasi DPI colorano i nuclei presi insieme.

Il nostro protocollo di differenziazione in due fasi fornisce un modo efficiente per differenziare le cellule MES in motoneuroni spinali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione di come differenziare in modo efficiente le cellule staminali embrionali di topo in motoneuroni. In conclusione, ricordiamo che un'elevata qualità delle cellule staminali embrionali di topo è il parametro più critico per generare in modo efficiente i motoneuroni.