Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare progenitori di interneuroni corticali in precursori di interneuroni post-mitotici per cellule staminali embrionali di topo utilizzando un corpo embrioide modificato in un metodo monostrato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come i sottotipi di interneuroni corticali raggiungono il loro destino individuale durante lo sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una generazione efficiente di progenitori interneuronali che esprimono Nkx2.1, nonché metodi per arricchire i sottogruppi di interneuroni di parvalbumina o somatostatina.

Per iniziare questa procedura, piastrellate le cellule di alimentazione MEF mitoticamente inattive in terreni MEF su piastre trattate con coltura tissutale. Attendere almeno 12 ore affinché si stabiliscano in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius prima di placcare le mESC. Se non viene utilizzato immediatamente, sostituire il supporto MEF ogni tre giorni.

Quindi, aggiungere alle piastre MEF le mESC contenenti il fattore inibitorio della leucemia di topo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Passare le mESC utilizzando la tripsina-EDTA una volta che la piastra diventa confluente al 70-80% e mantenere le mESC su uno strato di alimentazione MEF in terreni mESC per mantenere la pluripotenza.

Prima di iniziare la differenziazione, far passare le cellule almeno una volta su piastre rivestite di gelatina senza MEF per diluirle. Per fare ciò, preparare piastre rivestite di gelatina aggiungendo lo 0,1% di gelatina e PBS con calcio e magnesio a una piastra trattata con coltura tissutale e incubare a 37 gradi Celsius per almeno 1 ora. Piastra da 1,5 a due volte 10 al sesto di cella su ogni piastra di dieci centimetri e lasciale espandere per due giorni prima di iniziare la differenziazione.

Su DD0, dopo che le mESC sono cresciute sulle piastre rivestite di gelatina per due giorni, aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con PBS senza calcio e magnesio. Quindi, aggiungere abbastanza tripsina-EDTA per coprire la superficie delle piastre. E rimetti le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius per quattro minuti.

Dopo quattro minuti, spegnere la tripsina-EDTA utilizzando due volte il suo volume di terreno mESC. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga di dimensioni adeguate e centrifugare le celle a 200 volte g per cinque minuti. Quindi, rimuovere il tubo e aspirare il fluido senza disturbare il pellet.

Risospendere il pellet in un milliletro di terreno KSR-N2. Successivamente, misurare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. Iniziare a far crescere le cellule come corpi embrioidi aggiungendo 75.000 cellule per milliletro in terreno KSR-N2 nelle piastre di coltura tissutale non aderenti.

E incubarli a 37 gradi Celsius. Su DD1, prepararsi per l'atterraggio cellulare rivestendo le piastre trattate con coltura tissutale con poli-L-lisina per almeno un'ora o durante la notte a 37 gradi Celsius. Su DD2, aspirare la poli-L-lisina e rivestire le piastre con laminina per una notte a 37 gradi Celsius.

Su DD3, prima di iniziare la dissociazione dell'EB, aspirare la laminina e lasciare asciugare completamente le piastre in una cappa di coltura tissutale. Successivamente, trasferire gli EB con il terreno in una provetta da 15 millilitri e centrifugare per tre o quattro minuti a 15 volte g o fino a quando gli EB non si sono pellettati. Aspirare il terreno e aggiungere tre millilitri di soluzione di distacco cellulare contenente DNasi.

Quindi, incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Muovere delicatamente il tubo ogni tre minuti per favorire la dissociazione dell'EB. Una volta che gli EB non sono più visibili, o sono trascorsi 15 minuti, aggiungere sei millilitri di KSR-N2 contenente DNasi e centrifugare per cinque minuti a 200 volte g.

Quindi, piastrate le cellule in KSR-N2 contenenti LDN193189, XAV939 e l'inibitore ROCK, Y27632, a 4,5-5 volte dieci per quarto centimetro quadrato. Su DD5, sostituire il supporto con KSR-N2 contenente FGF2, IGF1 e SSH. Successivamente, preparare le piastre per coltura tissutale per la riplaccatura il giorno 8, utilizzando le istruzioni descritte nelle procedure su DD1 e DD2.

Su DD7, sostituire il supporto con KSR-N2 contenente FGF2, IGF1 e SHH. Su DD8, riplaccare le cellule staccandole dalle piastre con tripsina-EDTA per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Estinguere la tripsina-EDTA utilizzando due volte il suo volume con KSR-N2.

E centrifugare a 200 volte g per cinque minuti. Filtrare le celle attraverso un tubo filtrante da 40 micron per rimuovere eventuali grumi. Quindi, riplaccare le cellule a 250.000 cellule per centimetro quadrato in N2-KSR contenente FGF2, IGF1 e Y27632 con SHH.

Su DD10, sostituire il supporto con KSR-N2 contenente SHH. Lavare le cellule una volta con PBS senza calcio e magnesio e aggiungere alle cellule un reagente di dissociazione cellulare preriscaldato, non contenente tripsina, contenente DNasi. Mettili nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 10-30 minuti, o fino a quando le cellule non si saranno staccate.

Quindi, picchiettare delicatamente le piastre ogni cinque minuti per favorire la dissociazione. Su DD5, sostituire il supporto con KSR-N2 contenente FGF2 e IGF1. Successivamente, preparare le piastre per colture tissutali per la riplaccatura su DD8.

Su DD7, sostituire il supporto con KSR-N2 contenente FGF2 e IGF1. Su DD8, riplaccare le cellule con un agonista levigato e aggiungere un inibitore atipico della PKC. Su DD10, sostituire il supporto con KSR-N2 contenente aPKCi.

Su DD11, staccare le celle dalle piastre per FACS. Se le celle non sono state staccate per FACS su DD11, sostituire il supporto su DD12 con KSR-N2 contenente aPKCi. Su DD14, sostituire il supporto con KSR-N2 contenente aPKCi.

E su DD16, cambia il supporto con KSR-N2 contenente aPKCi. Quindi, su DD17, raccogliere le celle positive Nkx-2.1:mCherry. Qui sono mostrate le immagini rappresentative dell'immunocolorazione per Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry e Lhx6:GFP da una coltura di differenziazione al giorno 12.

Si noti che queste immagini sono canali sovrapposti dello stesso campo visivo. Questo grafico mostra la quantificazione della percentuale media di nuclei DAPI positivi che esprimono Nkx2.1 a DD12 in coltura. E questo è un grafico FACS rappresentativo, che dimostra le quattro diverse popolazioni cellulari che possono essere isolate utilizzando la nostra linea mESC dual reporter.

Si noti che mCherry si trova sull'asse x e GFP si trova sull'asse y. Pertanto, la casella in alto a destra rappresenta le celle che sono mCherry-GFP doppio positivo. Ecco l'andamento temporale dell'induzione di Nkx2.1:mCherry e Lhx6:GFP da DD6 a 16, espresso come percentuale di cellule in coltura che esprimono solo mCherry, che esprimono solo GFP o che esprimono co-Cherry-GFP.

Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato entro 17 giorni dall'inizio alla fine, se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare sempre con cellule staminali pleuripotenti, indifferenziate e dall'aspetto sano. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il trapianto in neocorteccia di topo neonatale o adulto, per rispondere a ulteriori domande riguardanti la determinazione del destino dell'interneurone o l'effetto del trapianto di interneuroni sulla funzione del circuito e sul comportamento animale.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze dello sviluppo per esplorare i fattori che guidano la determinazione del destino degli interneuroni nei topi e, per estensione, nei pazienti affetti da disturbi correlati agli interneuroni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come derivare i progenitori che esprimono Nkx2.1 e la loro progenie post-mitotica da cellule staminali embrionali di topo. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.