Sintesi combinatoria di e High-throughput di rilascio di proteine ​​da film polimerico e Biblioteche nanoparticelle

Questo video descrive la sintesi combinatoria di librerie biodegradabili di film di polianidride e nanoparticelle e il rilevamento ad alto rendimento del rilascio di proteine da queste librerie. In primo luogo, un apparato di deposizione automatizzato ad alta produttività utilizzato per depositare una serie di monomeri composizionalmente diversificati in cuvette di vetro. Una reazione di condensazione poli viene eseguita a 180 gradi Celsius e 0,3 tor per 1,5 ore.

Queste condizioni di reazione sono specifiche per la sintesi del polimero polianidride C-P-H-S-A. Utilizzando l'apparato di deposizione automatizzato, il solvente e tutti i componenti per l'incapsulamento vengono depositati nelle cuvette contenenti la libreria di polimeri. La sonicazione può essere somministrata per garantire la completa dissoluzione del polimero e la dispersione uniforme dei componenti aggiuntivi.

Quindi il polimero disciolto viene trasferito in un tubo di solvente non sconsiderato per fabbricare la libreria di nanoparticelle mediante nano precipitazione. Le nanoparticelle vengono recuperate mediante essiccazione sotto vuoto o filtrazione e quindi trasferite in una piastra modificata a 96 pozzetti rilasciati. Infine, la libreria caricata con proteine viene incubata in condizioni fisiologiche e la cinetica di rilascio delle proteine viene valutata utilizzando un metodo di rilevamento dello spazio fluorescente.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la cinetica di rilascio delle proteine in funzione delle proprietà del polimero o delle condizioni dell'ambiente di rilascio. Il vantaggio principale di questo approccio rispetto ad altre tecniche convenzionali un campione alla volta è che siamo in grado di sintetizzare più campioni contemporaneamente. Questi campioni possono quindi essere sottoposti a screening ad alta produttività per verificare la presenza di proteine, polimeri, polimeri cellulari o interazioni tra polimeri ospiti.

Ciò accelera quindi la progettazione razionale e lo sviluppo di questi biomateriali per la somministrazione di farmaci e l'ingegneria tissutale. A dimostrare la procedura sarà La Tricia Peterson, una post-operatoria del mio laboratorio. In questa sezione del video, un apparato di deposizione Hyatt viene utilizzato per depositare una libreria di monomeri composizionalmente variabile dopo la sintesi del polimero.

Questo apparato viene utilizzato per fabbricare una libreria combinatoria di film polimerici o nanoparticelle in bianco o caricati con proteine. La piattaforma automatizzata è composta da due pompe a siringa programmabili e tre attuatori lineari collegati in serie a un computer sul computer. Il software LabVIEW viene utilizzato per indirizzare i comandi alle pompe a siringa e agli attuatori.

Le siringhe a tenuta di gas da 10 cc vengono caricate nelle pompe a siringa con tubi capillari metallici collegati tramite raccordi di blocco dell'esca, che erogano le soluzioni polimeriche in cuvette di vetro. In questa dimostrazione, l'acido seico o SA sarà utilizzato con un sei Biss para oxy heane o CPH per creare una libreria di nanoparticelle che incapsulano l'albumina sierica del Texas Red Boan. Le istruzioni in questo video e i documenti di accompagnamento possono essere adattati per fabbricare e testare un'ampia gamma di librerie di film polimerici e nanoparticelle.

Per sintetizzare le librerie si inizia sciogliendo ogni monomero e cloroformio a una concentrazione finale di 25 milligrammi per millilitro in una fiala di vetro. Quindi, caricare ciascuna soluzione in una siringa a tenuta di gas da 10 cc aspirando la soluzione attraverso l'estremità di blocco dell'esca della siringa. Rimuovere eventuali bolle d'aria.

Quindi, collegare il tubo capillare in acciaio inossidabile con blocco dell'esca resistente ai solventi all'estremità della siringa. Fissare i tubi capillari in morsetti, fissarli a un supporto ad anello. Quindi posizionare l'estremità di entrambi i tubi capillari nel vete di partenza.

Per la deposizione di monomeri. Posizionare le siringhe sulle pompe a siringa programmabili e bloccarle in posizione nel software di visualizzazione del laboratorio. Impostare gli attuatori lineari sulla posizione iniziale nel software.

Avviare la deposizione automatica dei monomeri SA e CPH nelle cuvette di vetro sugli assi x, y e Z. Gli attuatori posizioneranno correttamente i tubi capillari in ciascun Q, controlleranno e pomperanno volumi programmati di ciascun monomero al loro interno, creando una libreria di monomeri varianti composizionali. Dopo deposizione di monomeri.

Trasferire la libreria di monomeri in un forno sottovuoto preriscaldato e incubare a 180 gradi Celsius e 0,3 giri per 1,5 ore per consentire la polimerizzazione per condensazione. Dopo l'incubazione, la fabbricazione della libreria di polimeri è completata. Successivamente vengono generate nanoparticelle polimeriche caricate con proteine.

Vedere il protocollo allegato per la fabbricazione di librerie di film polimerici caricati con proteine per la fabbricazione di una libreria di nanoparticelle caricate con proteine. Aggiungi la proteina in questo caso, l'albumina sierica della bovina rossa del Texas al solvente appropriato, che dovrebbe essere in grado di sciogliere la libreria polimerica. Qui, il cloruro di metilene viene utilizzato a una concentrazione di due milligrammi per millilitro.

Riempire la siringa da 10 cc con il solvente Texas Red BSA contenente e inserirla nella prima pompa siringa. Quindi posizionare una siringa da due cc pulita e vuota nella seconda pompa della siringa, posizionare le provette contenenti 15 millilitri di un solvente non s, in questo caso pentano, nel supporto della provetta adiacente alla piattaforma della fiala. Successivamente, in laboratorio, visualizzare il software per avviare il processo di deposizione automatizzata del solvente selezionando il programma.

Dopo l'avvio del programma, il solvente viene depositato nelle cuvette contenenti la libreria di polimeri, ottenendo una concentrazione di polimero di 20 milligrammi per millilitro. Quando tutto il solvente è stato depositato, lasciarlo sciogliere per uno o cinque minuti. A questo segue una sindacazione opzionale per garantire una dissoluzione completa del polimero e una dispersione uniforme delle proteine.

Successivamente, avviare il programma di trasferimento dei campioni nella vista lab. Ogni campione di polimero disciolto nella libreria viene quindi prelevato nella siringa vuota e dispensato nella provetta corrispondente di solvente non sconsiderato nel supporto del campione. Una volta che ogni campione è stato trasferito, recuperare le nanoparticelle caricate con proteine posizionando la libreria di nanoparticelle in una camera a vuoto a 10 millimetri di mercurio sotto vuoto, o utilizzando la filtrazione sotto vuoto fino a quando il solvente non viene rimosso.

Per studiare il rilascio di BSA incapsulato, iniziare con una piastra in polipropilene profonda 96 saldate che è stata modificata rimuovendo il mezzo pollice superiore di ciascuna parete del pozzetto di ogni altra colonna adiacente nella piastra. La rimozione della parte superiore di ciascun pozzetto tra le colonne A e B, C e DENF e GNH consente il flusso di liquido tra ogni coppia di pozzetti adiacenti quando vengono riempiti fino al trasferimento del volume completo. Standard BSA rossi del Texas che vanno da 1000 a 10 microgrammi per millilitro nella piastra profonda a 96 pozzetti.

Questi saranno utilizzati per calcolare la quantità di proteine e terranno conto anche del quenching del fluorocromo, ricostituiranno la massa desiderata di nanoparticelle nel tampone PBS, quindi soniceranno per disperdere uniformemente le particelle. Quindi, trasferire la libreria di nanoparticelle nella piastra profonda a 96 pozzetti e attendere che i campioni si siano depositati sul fondo della piastra a pozzetti. Successivamente, utilizzando un pipettatore, riempire lentamente tutti i pozzetti adiacenti con tampone PBS fino a un quarto di pollice dalla parte superiore del pozzetto.

Ci dovrebbe essere abbastanza buffer nei pozzi adiacenti in modo che scorra liberamente tra i pozzi. Quindi, sigillare la piastra di rilascio con il coperchio e posizionarla a 37 gradi Celsius sotto agitazione. Per la durata dell'esperimento in punti temporali incrementali, utilizzare uno scanner fluorescente piano da 9.400 Typhoon per scansionare la lastra utilizzando i filtri di eccitazione, laser ed emissione appropriati.

Dopo la scansione, utilizzare il software Image Quant per quantificare la quantità di proteina coniugata fluorocromo rilasciata in ogni rilascio. Ebbene, Texas Red BSA è stato incapsulato in una libreria di nanoparticelle polimeriche sintetizzate da monomeri SA e CPH come descritto in questo video per determinare la cinetica di rilascio delle proteine in funzione della chimica dei polimeri. Le nanoparticelle caricate con proteine sono state incubate a 37 gradi Celsius per un mese, durante il quale sono state ottenute scansioni fluorescenti in punti temporali incrementali per la quantificazione del rilascio di proteine.

Come mostrato qui, questo metodo di produzione idroelettrica è stato utilizzato per determinare la cinetica di rilascio di Texas Red BSA dalla libreria di nanoparticelle di polianidride A-C-P-H-S-A. Sono state osservate tendenze dipendenti dalla chimica con tassi di rilascio crescenti dai prodotti chimici a film Sarich. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando saggi standard di quantificazione delle proteine.

In un esperimento separato, è stato valutato il rilascio di Texas Red BSA dalle librerie di film di polianidride CPT CPH come mostrato qui La cinetica di rilascio di ordine quasi zero è stata osservata con film ricchi di cpeg che rilasciano la proteina più rapidamente con potenziali applicazioni in campo medico come dispositivi di somministrazione di farmaci biodegradabili. Questi risultati indicano che il profilo di rilascio desiderato di un farmaco terapeutico o di un antigene vaccinale può essere controllato modificando la chimica del polimero. Seguendo questa procedura, sono stati sviluppati altri metodi combinatori per studiare aree come la stabilità delle proteine, la tossicità cellulare, l'attivazione cellulare e la biodistribuzione InVivo.

Questi aspetti sono importanti per la progettazione razionale di biomateriali per la somministrazione di farmaci e l'ingegneria tissutale. Non dimenticare di indossare DPI adeguati e di praticare procedure di laboratorio sicure durante l'intero protocollo.