Sintesi combinatoria di e High-throughput di rilascio di proteine ​​da film polimerico e Biblioteche nanoparticelle

Questo video descrive la sintesi combinatoria di librerie di film e nanoparticelle di polianidride biodegradabile e il rilevamento ad alto rendimento del rilascio di proteine da queste librerie. In primo luogo, un apparato automatizzato ad alto rendimento viene utilizzato per depositare un array compositivamente diversificato di monomeri in cuvette di vetro. Una reazione di policondensazione viene eseguita a 180 gradi Celsius e 0,3 tor per 1,5 ore.

Queste condizioni di reazione sono specifiche per la sintesi del polimero anidride poli C-P-H-S-A. Utilizzando l'apparato di deposizione automatica, il solvente e tutti i componenti per l'incapsulamento vengono depositati nelle cuvette contenenti la libreria polimerica. Si può applicare la sonificazione per garantire il completo scioglimento del polimero e una distribuzione uniforme dei componenti aggiuntivi.

Successivamente, il polimero disciolto viene trasferito in un tubo contenente un solvente non solvente per fabbricare la libreria di nanoparticelle mediante nanoprecipitazione. Le nanoparticelle vengono recuperate mediante essiccazione sotto vuoto o filtrazione, e poi trasferite in una piastra modificata a 96 pozzetti con rilascio controllato. Infine, la libreria caricata con proteine viene incubata in condizioni fisiologiche e la cinetica di rilascio delle proteine viene valutata utilizzando un metodo di rilevamento fluorescente nello spazio.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la cinetica di rilascio delle proteine in funzione delle proprietà del polimero o delle condizioni dell'ambiente di rilascio. Il vantaggio principale di questo approccio rispetto ad altre tecniche convenzionali basate su un singolo campione alla volta è che siamo in grado di sintetizzare contemporaneamente più campioni. Questi campioni possono quindi essere sottoposti a screening ad alta produttività per studiare le interazioni tra proteina-polimero-cellula, polimero-ospite o polimero-polimero.

Questo accelera quindi la progettazione e lo sviluppo razionale di questi biomateriali per il rilascio di farmaci e l'ingegneria tissutale. A mostrare la procedura sarà La Tricia Peterson, una borsista post-dottorato del mio laboratorio. In questa sezione del video, un apparato di deposizione Hyatt ad alto rendimento viene utilizzato per depositare una libreria di monomeri a composizione variabile dopo la sintesi del polimero.

Questo apparato viene utilizzato per fabbricare una libreria combinatoria di film polimerici o nanoparticelle vuoti o caricati con proteine. La piattaforma automatizzata è costituita da due pompe per siringhe programmabili e da tre attuatori lineari collegati in serie a un computer. Il software LabVIEW viene utilizzato per inviare comandi alle pompe per siringhe e agli attuatori.

Siringhe gast tight da 10 cc vengono caricate nelle pompe per siringhe con tubi capillari metallici collegati tramite raccordi a baionetta, che dispensano le soluzioni polimeriche in cuvette di vetro. In questa dimostrazione, l'acido seicico o SA verrà utilizzato con uno sei Biss para ossi eptano o CPH per creare una libreria di nanoparticelle contenenti albumina sierica bovina marcata con Texas Red. Le istruzioni riportate in questo video e nei documenti allegati possono essere adattate per fabbricare e testare un'ampia varietà di librerie di film polimerici e nanoparticelle.

Per sintetizzare le librerie, iniziare sciogliendo ciascun monomero e il cloroformio a una concentrazione finale di 25 milligrammi per millilitro in un vial di vetro. Successivamente, caricare ogni soluzione in una siringa ermetica da 10 cc aspirando la soluzione attraverso l'estremità con bloccaggio a baionetta della siringa. Rimuovere eventuali bolle d'aria.

Successivamente, collegare il tubo capillare in acciaio inossidabile con chiusura ermetica resistente al solvente all'estremità della siringa. Fissare i tubi capillari con morsetti e attaccarli a un treppiede. Posizionare quindi l'estremità di entrambi i tubi capillari all'interno del vete iniziale.

Per il deposito del monomero. Posizionare le siringhe sulle pompe per siringhe programmabili e bloccarle nella posizione corretta nel software della vista del laboratorio. Impostare gli attuatori lineari sulla posizione iniziale nel software.

Avviare la deposizione automatizzata dei monomeri SA e CPH nelle cuvette di vetro lungo gli assi x, y e Z. Gli attuatori posizioneranno correttamente i tubi capillari in ciascun Q, e pomperanno volumi programmati di ciascun monomero al loro interno, creando una libreria di monomeri con composizione variabile. Dopo la deposizione dei monomeri.

Trasferire la libreria di monomeri in un forno a vuoto preriscaldato e incubare a 180 gradi Celsius e 0,3 torr per 1,5 ore per consentire la polimerizzazione per condensazione. Al termine dell'incubazione, la fabbricazione della libreria di polimeri è completata. Successivamente, vengono generati nanoparticelle polimeriche caricate con proteine.

Consultare il protocollo allegato per la fabbricazione di una libreria di film polimerici caricati con proteine al fine di produrre una libreria di nanoparticelle cariche di proteine. Aggiungere la proteina, in questo caso albumina sierica bovina marcata con rosso Texas, al solvente appropriato, che deve essere in grado di sciogliere la libreria polimerica. In questo caso, viene utilizzato cloruro di metilene a una concentrazione di due milligrammi per millilitro.

Riempire la siringa da 10 cc con il solvente contenente Texas Red BSA e posizionarla nella prima pompa per siringa. Quindi posizionare una siringa pulita da due cc vuota nella seconda pompa per siringa e inserire i tubi contenenti 15 millilitri di un nonsolvente, in questo caso pentano, nel portatubi adiacente alla piattaforma per provette. Successivamente, nel software di controllo del laboratorio, avviare il processo automatizzato di deposizione del solvente selezionando il programma.

Dopo l'avvio del programma, il solvente viene depositato nelle cuvette contenenti la libreria di polimeri, ottenendo una concentrazione del polimero di 20 milligrammi per millilitro. Una volta che tutto il solvente è stato depositato, lasciarlo agire per la dissoluzione del polimero per uno a cinque minuti. Seguire quindi con una sindacazione opzionale per garantire una completa dissoluzione del polimero e una dispersione uniforme della proteina.

Successivamente, avviare il programma di trasferimento del campione in lab view. Ogni campione di polimero disciolto nella libreria viene quindi aspirato nella siringa vuota e dispensato nel relativo tubo contenente il nons solvente nel portacampioni. Una volta trasferito ciascun campione, recuperare le nanoparticelle caricate con proteine posizionando la libreria di nanoparticelle in una camera a vuoto a 10 millimetri di mercurio di vuoto, oppure utilizzando la filtrazione sotto vuoto fino a rimozione del solvente.

Per studiare il rilascio della BSA incapsulata, iniziare con una piastra in polipropilene da 96 pozzetti profondi che sia stata modificata rimuovendo la metà superiore della parete di ciascun pozzetto di ogni colonna adiacente sulla piastra. La rimozione della parte superiore di ciascun pozzetto tra le colonne A e B, C e D, E e F, nonché G e H permette il flusso di liquido tra ogni coppia di pozzetti adiacenti quando vengono riempiti fino al volume massimo trasferibile. Aggiungere standard di BSA marcati con Texas red in concentrazioni comprese tra 1000 e 10 microgrammi per millilitro nella piastra da 96 pozzetti profondi.

Questi verranno utilizzati per il calcolo della quantità di proteina e terranno conto anche dell'oscuramento del fluorocromo. Ricostruire la massa desiderata di nanoparticelle in tampone PBS, quindi sottoporre a sonica per disperdere uniformemente le particelle. Successivamente, trasferire la libreria di nanoparticelle nella piastra a 96 pozzetti profondi e attendere finché i campioni non si saranno depositati sul fondo della piastra. Poi, utilizzando una pipetta, riempire lentamente tutti i pozzetti adiacenti con tampone PBS fino a un quarto di pollice dal bordo superiore del pozzetto.

Nei pozzetti adiacenti deve essere presente una quantità sufficiente di tampone in modo che possa scorrere liberamente tra i pozzetti. Successivamente, sigillare la piastra di rilascio con il coperchio e posizionarla a 37 gradi Celsius sotto agitazione. Per tutta la durata dell'esperimento, in punti temporali incrementali, utilizzare uno scanner fluorescente piatto Typhoon 9400 per scansionare la piastra usando i filtri di eccitazione, laser ed emissione appropriati.

Dopo la scansione, utilizzare un software di quantificazione dell'immagine per misurare la quantità di proteina coniugata al fluorocromo rilasciata in ciascun campione. In questo caso, il BSA marcato con Texas Red è stato incapsulato in una libreria di nanoparticelle polimeriche sintetizzate a partire dai monomeri SA e CPH, come descritto in questo video, al fine di determinare la cinetica di rilascio della proteina in funzione della chimica del polimero. Le nanoparticelle caricate con la proteina sono state incubate a 37 gradi Celsius per un mese, durante il quale sono state effettuate scansioni fluorescenti in punti temporali incrementali per la quantificazione del rilascio proteico.

Come mostrato qui, questo metodo ad alto rendimento è stato utilizzato per determinare la cinetica di rilascio della BSA marcata con Texas Red da una libreria di nanoparticelle in policandride A-C-P-H-S-A. Sono state osservate tendenze dipendenti dalla chimica, con aumenti dei tassi di rilascio per le chimiche del film di Sarich. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando saggi standard di quantificazione delle proteine.

In un esperimento separato, il rilascio di Texas Red BSA da librerie di film di polianidride CPT CPH è stato valutato come mostrato qui; sono state osservate cinetiche di rilascio prossime a quelle di ordine zero, con i film ricchi di cpeg che rilasciavano la proteina più rapidamente, con possibili applicazioni nel campo medico come dispositivi biodegradabili per il rilascio di farmaci. Questi risultati indicano che il profilo di rilascio desiderato di un farmaco terapeutico o di un antigene vaccinale può essere controllato modificando la chimica del polimero. A seguito di questa procedura, sono stati sviluppati altri metodi combinatori per indagare ambiti come la stabilità delle proteine, la tossicità cellulare, l'attivazione cellulare e la biodistribuzione InVivo.

Questi aspetti sono importanti per la progettazione razionale di biomateriali per il rilascio di farmaci e l'ingegneria tissutale. Non dimenticare di indossare dispositivi di protezione individuale adeguati e di seguire procedure di laboratorio sicure durante tutto il protocollo.