Name: Sintesi combinatoria di e High-throughput di rilascio di proteine da film polimerico e Biblioteche nanoparticelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri la sintesi combinatoria di film polimerici e nanoparticelle biodegradabili per il rilascio controllato di proteine. Questo metodo ad alto rendimento accelera lo sviluppo di biomateriali per il rilascio di farmaci.

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Gli autori riconoscono l&#39;ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) e l&#39;US Army Medical Research e Materiel Command (Grant No W81XWH-10-1-0806) per il sostegno finanziario. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto Grant No. CEE 0552584 e 0851519.

1. Combinatoria Polymer Synthesis Library (Variabile in Polymer Chemistry) - vedere la Figura 1 per l&#39;installazione Robotic <ol><li> Sciogliere ogni monomero nel solvente appropriato (= concentrazione 25 mg / ml) e caricare ciascuna in una siringa a tenuta di gas 10cc. </li><li> Collegare i solventi resistenti tubi capillari blocco esca alla fine di ciascuna siringa. </li><li> Posizionare le siringhe sulle pompe siringa (Nuove pompe a siringa Era programmabili) e bloccare in posizione. </li><li> Impostare gli attuatori lineari (Zaber) alla posizione di partenza. </li><li> Con morsetti di stand anello, posizionare l&#39;estremità dei due tubi capillari nel flaconcino di partenza / e per la deposizione di monomero. </li><li> Avviare il programma LabVIEW, che pompa volumi variabili di ciascun monomero in ogni pozzetto a seconda della composizione del copolimero desiderato. Questo è realizzato nel programma istruendo l&#39;asse Z dell&#39;attuatore per abbassare i tubi capillari nel flaconcino / pozzetto e poi ogni pompa per erogare il volume desiderato. Next, il programma chiede Z-attuatore di ritornare nella posizione iniziale e le X e Y attuatori per spostare la posizione del flacone successivo / pozzetto. Questo viene effettuato fino ciascun pozzetto è il volume desiderato di monomero depositato in esso. </li><li> Seguendo deposizione monomero, la libreria monomero multi-pozzetto o multi-fiala viene trasferito in un forno preriscaldato a vuoto e incubate sotto vuoto per tutta la durata della reazione di polimerizzazione per condensazione. Per CPH: sintesi SA la reazione è condotta a 180 ° C, 0,3 torr, per 1,5 ore, ma queste condizioni di reazione può variare tra i diversi sistemi polimerici. </li></ol> 2. Blank combinatoria e proteine-caricato nanoparticella polimerica e Biblioteca Fabrication Film - vedere la Figura 1 per l&#39;installazione Robotic <ol><li> La siringa nella pompa a siringa prima programmabile è riempito con un solvente (biblioteca vuoto) o un solvente con proteine ​​disperso in esso (proteina-loaded library) mentre la siringa nella seconda siringapompa viene lasciato vuoto. Tubi per fabbricazione nanoparticelle nel portacampioni adiacenti sono riempiti con il non-solvente (rapporto solvente non-solvente è da 1 a 100). Per la fabbricazione di una pellicola vuota piastra multipozzetto viene utilizzato al posto dei tubi nel supporto del campione adiacente. </li><li> Utilizzando il programma LabVIEW, il solvente viene depositato in tutte fiale polimero / pozzetti della biblioteca (= concentrazione 20 mg / ml) e incubate per 1-5 min. Una fase opzionale sonicazione (30 s a 40 Hz) possono essere introdotte per garantire la completa dissoluzione del polimero. </li><li> Successivo, avviando un programma separato LabVIEW, il campione viene prelevato nella siringa vuota, e depositato nel suo corrispondente tubo di ben non solvente (nanoparticelle) o vuoto (film) nel supporto del campione adiacente. </li><li> Questo processo viene eseguito per ogni composizione della biblioteca discreta polimero. </li><li> La libreria di nanoparticelle o film viene poi posto in una camera a vuoto per la rimozione del solvente e non solvente (il libra nanoparticellery può anche essere recuperato mediante filtrazione sotto vuoto). </li></ol> 3. High-throughput di proteine ​​rilascio Cinetica <ol><li> Per indagare alto throughput cinetiche di rilascio di proteine ​​da una libreria polimero, un 96-deep riempirono (2 ml / pozzetto), piastra di polipropilene viene modificato in modo tale che la parte superiore 1/3 della parete bene in colonne adiacenti (ex: A e B, C e D, E e F, G e H) viene rimosso per unire i pozzetti. La proteina-caricati i film devono essere fabbricati o le nanoparticelle trasferiti in questa piastra per eseguire high-throughput rilascio studi di cinetica. Protein-loaded nanoparticelle o film campioni devono essere immessi in un pozzetto delle colonne adiacenti (es: A, C, E e G). Vedere la Figura 4 per i dettagli. </li><li> In seguito al trasferimento delle nanoparticelle al profondo sgorgava 96 piastra di rilascio, le particelle sono autorizzati a stabilirsi. Tampone PBS (0,1 mM, pH 7,4) viene lentamente aggiunto ad ogni pozzetto (colonne A, C, E e G) e quindi ad ogni confinante ben (colonne B, D, F, e H) fino a quando i pozzi sono pieni e il buffer è libero fluire tra pozzetti adiacenti. Per nanoparticelle, questo processo deve essere eseguita con estrema cautela per garantire le particelle rimangono sul fondo del pozzetto (colonne A, C, E e G) e non trasferito al rilascio adiacente pozzo (colonne B, D, F , e H). In alcuni casi, centrifugazione è richiesto di localizzare i campioni nanoparticelle sul fondo del pozzetto (colonne A, C, E e G). </li><li> Successivamente, la piastra di rilascio è sigillato con un coperchio e posto alla temperatura desiderata (cioè 37 ° C) sotto agitazione per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> A tempi incrementali (cioè 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, e 30 giorni), la quantità di rilascio fluorocromo coniugato proteina è quantificato mediante un 9.400 Typhoon Scanner piano fluorescente ( GE Healthcare). La piastra di rilascio viene posto sulla superficie dello scanner, scansione con il laser appropriato eccitazione ed emissione filters, e l&#39;intensità di fluorescenza della proteina rilasciata nel pozzetti rilascio (colonne B, D, F e H) viene quantificato (Quant immagine). Si suggerisce che la proteina standard di concentrazioni note essere inclusi nella piastra pozzo per calcolare la quantità di proteine ​​e contabili per tempra fluorocromo. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Sulla fabbricazione della biblioteca polimero, caratterizzazione è stata effettuata con 1 H NMR, GPC e FTIR per validare questo metodo combinatorio 1,7,8,11. Molecolare gamma di pesi da 10.000-20.000 g / mol, indice varia polidispersità 1,5-3,0, e la composizione chimica ha dimostrato di essere precisi e in accordo con i metodi convenzionali di sintesi polianidride 12-15. Analogamente, le immagini SEM delle librerie nanoparticelle mostrato morfologia di superficie simile, dimensioni e distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle come quella convenzionalmente fabbricate 2. Proteine ​​rilascio kinetics da nanoparticelle polianidride o film viene effettuata in una piastra modificata così come descritto in precedenza 1. I risultati hanno rivelato un rilascio approssimativo di ordine zero, con o senza un burst dipendente dal carico di proteine ​​e chimica dei polimeri (figure 2 e 3) 1,12,14,16. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" /> Figura 1. Combinatoria pellicola polimerica e fabbricazione di apparecchi nanoparticelle. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" /> Figura 2 High-throughput rilascio di Texas Red albumina di siero bovino (TRBSA) da un CPH:. SA biblioteca nanoparticella polimerica. SA-ricchi di composti polimerici rilasciare incapsulato TRBSA più rapidamente, mentre CPH ricchi di composti polimerici rilasciare il più lento. Le barre di errore rappresentano deviazione standardzione e n = 4. Ristampato con il permesso di Petersen et. al. 1. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" /> Figura 3 High-throughput rilascio di Texas Red albumina di siero bovino (TRBSA) da un CPTEG:. CPH biblioteca film polimerico. CPTEG ricchi di composti polimerici rilasciare incapsulato TRBSA più rapidamente, mentre CPH ricchi di composti polimerici rilasciare il più lento. Le barre di errore rappresentano deviazione standard ed n = 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" /> Figura 4. Immagine che mostra due pozzi vicini &quot;prima&quot; e la modifica &quot;dopo&quot; nel profondo-sgorgava 96 lastra in polipropilene. L&#39;immagine &quot;dopo&quot; modifica sulla destra rappresenta anche l&#39;aggiunta di una pellicola di polimero (fondo del pozzo sinistra) con una molecola fluorescente incapsulatoessere rilasciato tra i due pozzetti in una soluzione tampone. La molecola fluorescente rilasciato viene quindi rilevato nella giusta bene.

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
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<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Conoscenza delle necessarie condizioni di sintesi e le temperature di transizione vetrosa (T g s) dei polimeri viene sintetizzati sono essenziali per la fabbricazione library. Se la g T s sono sotto della temperatura ambiente, la fase di fabbricazione nanoparticelle può essere necessario effettuata in un ambiente a temperatura controllata inferiore del g T dei polimeri. Inoltre, si deve usare cautela per garantire che tutte le apparecchiature che viene a contatto con le alte temperature ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Motorizzato XYZ Stage: 3x T-LSM050A, corsa 50 mm per asse </td><td> Zaber Technologies </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 pompa a siringa singola </td><td> New Era pompa Sistemi </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Rimless riutilizzabili in vetro Cultura Tubi </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> Cuvette di vetro </td><td> Strategie scientifici </td><td> G102 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE Siringhe a tenuta di gas, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> U96 DeepWell Piatti 1,3 ml e 2,0 ml </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 278743 </td></tr><tr><td> Well cap stuoie </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 276000 </td></tr><tr><td> Typhoon 9400 </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-79 </td></tr><tr><td> Whatman Grade 50 cerchi 90 millimetri </td><td> Whatman </td><td> 1450-090 </td></tr></tbody></table>

sintesi combinatoria di e high-throughput di rilascio di proteine ​​da film polimerico e biblioteche nanoparticelle

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polianidridi sono una classe di biomateriali con eccellente biocompatibilità e capacità di consegna della droga. Mentre sono stati studiati estesamente con convenzionale-campione-at-a-time tecniche di sintesi, una più recente high throughput approccio è stato sviluppato consentendo la sintesi e la verifica di grandi librerie di polianidridi 1. Ciò faciliterà l&#39;ottimizzazione più efficiente e il processo di progettazione di questi biomateriali per applicazioni di rilascio di farmaci e vaccini. Il metodo in questo lavoro descrive la sintesi combinatoria di film polianidride biodegradabile e le biblioteche delle nanoparticelle e l&#39;high-throughput di rilevamento del rilascio di proteine ​​da queste librerie. In questo metodo roboticamente azionamento (figura 1), attuatori lineari e pompe a siringa sono controllati da LabVIEW, che consente un vivavoce protocollo automatizzato, eliminando errore dell&#39;utente. Inoltre, questo metodo consente la rapida realizzazione di micro-scala librerie di polimeri, rossoucing la dimensione batch mentre conseguente creazione di sistemi polimerici multivariata. Questo approccio combinatorio per sintesi polimerica facilita la sintesi di fino a 15 differenti polimeri in una quantità equivalente di tempo necessario per sintetizzare un polimero convenzionale. Inoltre, la libreria combinatoria polimero possono essere realizzati in forme geometriche vuote o proteina-loaded compresi film o nanoparticelle di dissoluzione della biblioteca polimero in un solvente e precipitazione in un non-solvente (per nanoparticelle) o da essiccazione sotto vuoto (per i film). Una volta caricato un fluorocromo coniugato proteina nelle librerie di polimeri, cinetiche di rilascio di proteine ​​può essere valutata a high-throughput usando un metodo basato sulla fluorescenza di rilevamento (figure 2 e 3) come descritto in precedenza 1. Questa piattaforma combinatoria è stato convalidato con metodi convenzionali 2 e il film polianidride e librerie nanoparticelle sono state caratterizzate con <sup&gt; 1 H NMR e FTIR. Le librerie sono stati sottoposti a screening per la cinetica di rilascio di proteine, la stabilità e antigenicità, tossicità in vitro cellulare, la produzione di citochine, espressione marcatore di superficie, l&#39;adesione, la proliferazione e la differenziazione, e in vivo e biodistribuzione mucoadesione 1-11. Il metodo combinatorio sviluppato qui permette alta produttività sintesi polimerica e fabbricazione di proteine-caricato nanoparticelle e cineteche, che può, a sua volta, essere sottoposti a screening in vitro e in vivo per l&#39;ottimizzazione delle prestazioni biomateriale.

Questo metodo descrive la sintesi combinatoria di film polianidride biodegradabile e le biblioteche delle nanoparticelle e l&#39;high-throughput di rilevamento del rilascio di proteine ​​da queste librerie.

Sintesi combinatoria di e High-throughput di rilascio di proteine ​​da film polimerico e Biblioteche nanoparticelle

Le polianidridi sono una classe di biomateriali caratterizzati da un'eccellente biocompatibilità e capacità di rilascio di farmaci. Sebbene siano state studiate ampiamente con...

Questo video descrive la sintesi combinatoria di librerie di film e nanoparticelle di polianidride biodegradabile e il rilevamento ad alto rendimento del rilascio di proteine da queste librerie. In primo luogo, un apparato automatizzato ad alto rendimento viene utilizzato per depositare un insieme compositivamente diversificato di monomeri in cuvette di vetro. Una reazione di policondensazione viene eseguita a 180 gradi Celsius e 0,3 tor per 1,5 ore.Queste condizioni di reazione sono specifiche per la sintesi del polimero anidride poli C-P-H-S-A. Utilizzando l'apparato di deposizione automatica, il solvente e tutti i componenti per l'incapsulamento vengono depositati nelle cuvette contenenti la libreria polimerica. Si può applicare la sonificazione per garantire il completo scioglimento del polimero e una distribuzione uniforme dei componenti aggiuntivi.Successivamente, il polimero disciolto viene trasferito in un tubo contenente un solvente non solvente per fabbricare la libreria di nanoparticelle mediante nanoprecipitazione. Le nanoparticelle vengono recuperate mediante essiccazione sotto vuoto o filtrazione, e poi trasferite in una piastra modificata da 96 pozzetti. Infine, la libreria caricata con proteine viene incubata in condizioni fisiologiche e la cinetica di rilascio delle proteine viene valutata utilizzando un metodo di rilevamento fluorescente nello spazio.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la cinetica di rilascio delle proteine in funzione delle proprietà del polimero o delle condizioni dell'ambiente di rilascio. Il vantaggio principale di questo approccio rispetto ad altre tecniche convenzionali basate su un singolo campione alla volta è che siamo in grado di sintetizzare contemporaneamente più campioni. Questi campioni possono quindi essere sottoposti a screening ad alta produttività per studiare le interazioni tra proteine, polimeri, cellule e polimeri ospite.Questo accelera quindi la progettazione e lo sviluppo razionale di questi biomateriali per il rilascio di farmaci e l'ingegneria tissutale. La procedura sarà dimostrata da La Tricia Peterson, una ricercatrice post-dottorato del mio laboratorio. In questa sezione del video, un apparato di deposizione Hyatt ad alto rendimento viene utilizzato per depositare una libreria di monomeri a composizione variabile dopo la sintesi del polimero.Questo apparato viene utilizzato per fabbricare una libreria combinatoria di film polimerici o nanoparticelle vuoti oppure caricati con proteine. La piattaforma automatizzata è costituita da due pompe a siringa programmabili e da tre attuatori lineari collegati in serie a un computer. Il software LabVIEW viene utilizzato per inviare comandi alle pompe a siringa e agli attuatori.Siringhe gast tight da 10 cc vengono caricate nelle pompe per siringhe con tubi capillari metallici collegati tramite raccordi a vite, che dispensano le soluzioni polimeriche in cuvette di vetro. In questa dimostrazione, l'acido seicico o SA verrà utilizzato con uno sei Biss para ossi eptano o CPH per creare una libreria di nanoparticelle contenenti albumina sierica bovina marcata con Texas Red. Le istruzioni riportate in questo video e nei documenti allegati possono essere adattate per fabbricare e testare un'ampia varietà di librerie di film polimerici e nanoparticelle.Per sintetizzare le librerie, iniziare sciogliendo ciascun monomero e il cloroformio a una concentrazione finale di 25 milligrammi per millilitro in un vial di vetro. Successivamente, caricare ogni soluzione in una siringa ermetica da 10 cc aspirando la soluzione attraverso l'estremità della siringa con attacco a baionetta. Rimuovere eventuali bolle d'aria.Successivamente, collegare il tubo capillare in acciaio inossidabile con chiusura ermetica resistente al solvente all'estremità della siringa. Fissare i tubi capillari con morsetti e attaccarli a un treppiede. Posizionare quindi l'estremità di entrambi i tubi capillari all'interno del vete iniziale.Per il deposito del monomero. Posizionare le siringhe sulle pompe per siringhe programmabili e bloccarle nella posizione corretta nel software della vista del laboratorio. Impostare gli attuatori lineari nella posizione iniziale nel software.Avviare la deposizione automatizzata dei monomeri SA e CPH nelle cuvette di vetro lungo gli assi x, y e Z. Gli attuatori posizioneranno correttamente i tubi capillari in ciascuna Q, e pomperanno volumi programmati di ciascun monomero al loro interno, creando una libreria di monomeri con composizione variabile. Dopo la deposizione dei monomeri.Trasferire la libreria di monomeri in un forno a vuoto preriscaldato e incubare a 180 gradi Celsius e 0,3 torr per 1,5 ore per consentire la polimerizzazione per condensazione. Al termine dell'incubazione, la fabbricazione della libreria di polimeri è completata. Successivamente, vengono generati nanoparticelle polimeriche caricate con proteine.Vedere il protocollo allegato per la fabbricazione di una libreria di film polimerici caricati con proteine al fine di produrre una libreria di nanoparticelle cariche di proteine. Aggiungere la proteina, in questo caso albumina sierica bovina marcata con Texas red, al solvente appropriato, che deve essere in grado di sciogliere la libreria polimerica. In questo caso, viene utilizzato cloruro di metilene alla concentrazione di due milligrammi per millilitro.Riempire la siringa da 10 cc con il solvente contenente Texas Red BSA e posizionarla nella prima pompa per siringa. Quindi posizionare una siringa pulita da due cc vuota nella seconda pompa per siringa e collocare i tubi contenenti 15 millilitri di un non solvente, in questo caso pentano, nel portatubi adiacente alla piattaforma per provette. Successivamente, nel software di laboratorio, avviare il processo automatizzato di deposizione del solvente selezionando il programma.Dopo l'avvio del programma, il solvente viene depositato nelle cuvette contenenti la libreria di polimeri, ottenendo una concentrazione del polimero di 20 milligrammi per millilitro. Una volta che tutto il solvente è stato depositato, lasciare che il polimero si sciolga per uno a cinque minuti. Seguire quindi con una sindacazione opzionale per garantire una completa dissoluzione del polimero e una dispersione uniforme della proteina.Successivamente, avviare il programma di trasferimento del campione in lab view. Ogni campione di polimero disciolto nella libreria viene quindi aspirato nella siringa vuota e dispensato nel relativo tubo contenente il nons solvente nel portacampioni. Una volta trasferito ciascun campione, recuperare le nanoparticelle caricate con proteine posizionando la libreria di nanoparticelle in una camera a vuoto a 10 millimetri di mercurio di vuoto, oppure utilizzando una filtrazione sotto vuoto fino a rimozione del solvente.Per studiare il rilascio della BSA incapsulata, iniziare con una piastra in polipropilene da 96 pozzetti profondi che sia stata modificata rimuovendo la metà superiore del bordo di ciascun pozzetto in ogni colonna adiacente della piastra. La rimozione della parte superiore di ciascun pozzetto tra le colonne A e B, C e D, E e F, nonché G e H, consente il flusso di liquido tra ogni coppia di pozzetti adiacenti quando vengono riempiti fino al volume massimo trasferibile. Aggiungere standard di BSA coniugata con Texas red in concentrazioni comprese tra 1000 e 10 microgrammi per millilitro nella piastra da 96 pozzetti profondi.Questi verranno utilizzati per il calcolo della quantità di proteina e terranno conto anche dell'oscuramento del fluorocromo. Ricostruire la massa desiderata di nanoparticelle in tampone PBS, quindi sottoporre a sonica per disperdere uniformemente le particelle. Successivamente, trasferire la libreria di nanoparticelle nella piastra a 96 pozzetti profondi e attendere che i campioni si depositino sul fondo della piastra. Poi, utilizzando una pipetta, riempire lentamente tutti i pozzetti adiacenti con tampone PBS fino a un quarto di pollice dal bordo superiore del pozzetto.Nei pozzetti adiacenti deve essere presente una quantità sufficiente di tampone in modo che possa scorrere liberamente tra i pozzetti. Successivamente, sigillare la piastra di rilascio con il coperchio e posizionarla a 37 gradi Celsius sotto agitazione. Per tutta la durata dell'esperimento, in punti temporali incrementali, utilizzare uno scanner fluorescente piatto Typhoon 9400 per scansionare la piastra, usando i filtri di eccitazione, laser ed emissione appropriati.Dopo la scansione, utilizzare un software di quantificazione dell'immagine per misurare la quantità di proteina coniugata al fluorocromo rilasciata in ciascun campione. In questo caso, l'albumina sierica bovina marcata con Texas Red (Texas Red BSA) è stata incapsulata in una libreria di nanoparticelle polimeriche sintetizzate a partire dai monomeri SA e CPH, come descritto in questo video, al fine di determinare la cinetica di rilascio della proteina in funzione della chimica polimerica. Le nanoparticelle caricate con la proteina sono state incubate a 37 gradi Celsius per un mese, durante il quale sono state effettuate scansioni fluorescenti in punti temporali incrementali per la quantificazione del rilascio proteico.Come mostrato qui, questo metodo ad alto rendimento è stato utilizzato per determinare la cinetica di rilascio della BSA marcata con Texas Red da una libreria di nanoparticelle in policandride A-C-P-H-S-A. Sono state osservate tendenze dipendenti dalla chimica, con aumenti dei tassi di rilascio per le chimiche a base di film di Sarich. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando saggi standard di quantificazione delle proteine.In un esperimento separato, il rilascio di Texas Red BSA dalle librerie di film di anidride polimerica CPT CPH è stato valutato come mostrato qui; sono state osservate cinetiche di rilascio prossime a quelle di ordine zero, con i film ricchi di cpeg che rilasciavano la proteina più rapidamente, mostrando potenziali applicazioni nel campo medico come dispositivi biodegradabili per il rilascio di farmaci. Questi risultati indicano che il profilo di rilascio desiderato di un farmaco terapeutico o di un antigene vaccinale può essere controllato modificando la chimica del polimero. A seguito di questa procedura, sono stati sviluppati altri metodi combinatori per indagare ambiti come la stabilità delle proteine, la tossicità cellulare, l'attivazione cellulare e la biodistribuzione InVivo.Questi aspetti sono importanti per la progettazione razionale di biomateriali per il rilascio di farmaci e l'ingegneria tissutale. Non dimenticare di indossare dispositivi di protezione individuale adeguati e di seguire procedure di laboratorio sicure durante tutto il protocollo.

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