Un modello murino della formazione muscolare da stimolazione elettrica neuromuscolare
9 maggio 2012
Un modello murino di stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES), una modalità sicuro ed economico clinica, ai muscoli compartimento anteriore viene descritto. Questo modello ha il vantaggio di modificare un dispositivo facilmente disponibile clinica allo scopo di elicitare contrazioni muscolari mirate e specifiche nei topi.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un modello murino di allenamento muscolare mediante stimolazione elettrica neuromuscolare. Questo risultato si ottiene innanzitutto adattando un elettrodo superficiale clinicamente disponibile, progettato per l'uso negli esseri umani, a un elettrodo superficiale utilizzabile nei topi; successivamente si anestetizza e posiziona l'animale per la stimolazione. Quindi si posiziona l'elettrodo superficiale direttamente sopra il nervo fibulare profondo, appena distale rispetto alla testa della fibula.
L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire il protocollo di stimolazione dei muscoli flessori anteriori. In definitiva, l'analisi istologica mostra un aumento della vascolarizzazione del muscolo scheletrico e i test contrattili in situ mostrano un incremento della forza tetanica massima. Ciao, mi chiamo Fabrizio.
Sono professore assistente presso il Dipartimento di Medicina Fisica e Riabilitativa dell'Università di Pittsburgh e direttore del Cellular Rehabilitation Laboratory. Oggi vi mostreremo un modello di allenamento muscolare basato sul rispecchiamento, utilizzando una stimolazione elettrica neuromuscolare. In questa prima parte della dimostrazione, vi illustreremo come modificare un elettrodo superficiale clinicamente disponibile in un elettrodo utilizzabile per stimolare il muscolo scheletrico nei topi.
Nella seconda parte, mostreremo come implementare questo protocollo di stimolazione elettrica neuromuscolare nei vostri esperimenti e nello sviluppo di modelli animali che riproducono in modo accurato le condizioni cliniche. L'utilizzo del modello clinico è importante perché può aiutarci a rispondere a domande relative alla fisiologia del muscolo scheletrico, ad esempio in che modo l'attivazione muscolare innesta risposte meccanotrasduttive, e in questo caso possiamo analizzarle a livello molecolare, cellulare e tissutale. Ciao, mi chiamo Ricardo Ferrari.
Sono uno studente di dottorato in terapia fisica presso il Dipartimento di Terapia Fisica dell'Università di Pittsburgh. La stimolazione elettrica muscolare è una procedura comune in ambito clinico per aumentare la forza muscolare e migliorare la guarigione muscolare. Tuttavia, rimangono molti interrogativi riguardo ai parametri ottimali da utilizzare.
Questo modello animale potrebbe contribuire allo sviluppo di protocolli specifici di stimolazione elettrica per l'utilizzo in ambito clinico. Per preparare l'elettrodo, iniziare piegando due perni d'oro lunghi sei millimetri ad un angolo di 90 gradi. Successivamente, esporre circa sette centimetri di due fili di rame rimuovendo l'isolamento esterno.
Quindi saldare i fili dei connettori ai due perni d'oro, posizionati a circa 3,5 millimetri di distanza. Successivamente, posizionare un tubo termorestringente sul collegamento tra i fili di rame e i perni d'oro per l'isolamento e la stabilizzazione; riscaldare il tubo termorestringente, assicurandosi che i perni d'oro siano paralleli tra loro, e inserirli attraverso la scheda circuitale in modo che le punte siano allineate. In seguito, incapsulare i perni con più applicazioni di resina epossidica trasparente, lasciando asciugare completamente l'epossidico tra un'applicazione e l'altra; alla fine, carteggiare l'epossidico per esporre le punte dei perni d'oro.
Successivamente, utilizzare un voltmetro per verificare che i cavi non siano in corto circuito. Quindi, utilizzare un tubo di plastica per isolare i perni metallici del connettore elettrico femmina a due vie. Successivamente, collegare i cavi dell'elettrodo al connettore elettrico femmina a due vie.
Tutte le procedure sono state esaminate e approvate dal comitato IACUC dell'Università di Pittsburgh e sono state eseguite in programmi e strutture accreditate PHS Assured e ALAC. Gli animali vengono anestetizzati mediante inalazione di isoflurano. L'animale deve rimanere anestetizzato per tutta la durata della sessione di NMES.
La presenza di anestesia deve essere confermata mediante un test del riflesso estensore alla pressione del dito del piede. Successivamente, posizionare l'animale in posizione laterale. Rasare quindi l'arto posteriore, detergerlo con alcol e pulire l'elettrodo con candeggina al 3%.
Quindi, utilizzando l'acqua, impostare i parametri di stimolazione, inclusa una durata dell'impulso di 150 microsecondi e una frequenza di 50 PP s. Impostare quindi il tempo di stimolazione a cinque secondi, con un incremento di 0,5 secondi e un decremento di 0,5 secondi. Questo permetterà al muscolo di adattarsi gradualmente alla stimolazione ed è più confortevole per l'animale.
Successivamente, impostare il tempo di pausa tra le contrazioni su 10 secondi. Questo valore può essere regolato in base all'effetto desiderato, ma tempi di pausa più brevi determineranno un'iniziale più rapida della fatica muscolare. Poi, sterilizzare l'elettrodo con una soluzione di candeggina al 3% e successivamente con acqua, e applicare del gel conduttivo sull'elettrodo per la stimolazione dei muscoli del compartimento anteriore, inclusi il muscolo tibiale anteriore e il muscolo estensore lungo delle dita; posizionare l'elettrodo superficiale direttamente sopra il nervo perineale comune dell'animale, situato appena a livello distale del condilo femorale laterale.
La posizione dell'elettrodo è confermata quando la stimolazione provoca una completa dorsiflessione della caviglia e una completa estensione delle dita. D'altro canto, la dorsiflessione della zampa senza estensione delle dita suggerisce che solo il muscolo tibiale anteriore sta venendo stimolato. Successivamente, iniziare l'intensità della stimolazione elettrica neuromuscolare a nove milliampere ed eseguire due serie di contrazioni per un totale di 20 contrazioni, con una pausa di cinque minuti tra le serie; durante il periodo di riposo, si effettua la stimolazione dell'arto controlaterale.
Ora posizionare l'animale nella camera di recupero. Dopo quattro settimane di stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES) in topi MDX skid di età compresa tra tre e cinque mesi, la colorazione ematossilina-eosina dei muscoli scheletrici non mostra un aumento del numero di fibre con nucleo centrale rispetto ai controlli non stimolati. Questo suggerisce che l'applicazione della NMES non innesca la cascata di degenerazione e rigenerazione.
L'immunoeistochimica per CD31 come marcatore delle cellule endoteliali rivela che, rispetto ai topi di controllo non sottoposti a stimolazione, quattro settimane di stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES) hanno determinato una significativa angiogenesi nel muscolo trattato. Questa figura mostra l'aumento della forza tetanica massima nei muscoli trattati con NMES rispetto ai muscoli di controllo non trattati. Una volta acquisita padronanza di questa tecnica, il completamento del protocollo richiede circa 15 minuti per animale.
La parte più difficile di questo protocollo consiste nel trovare la posizione corretta per l'elettrodo al fine di ottenere la risposta muscolare desiderata. Grazie per aver guardato. Non esitate a contattare il nostro laboratorio qualora abbiate domande.
Panoramica
Questo articolo descrive un modello murino per l'allenamento muscolare mediante stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES), un metodo clinico sicuro ed economico. Il modello adatta un dispositivo clinico per indurre contrazioni muscolari mirate nei topi, facilitando la ricerca in fisiologia muscolare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Fisiologia
- Riabilitazione
Sfondo
- La stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES) è comunemente utilizzata in ambito clinico per potenziare la forza muscolare e favorire la guarigione.
- La comprensione dell'attivazione muscolare può fornire informazioni sulle risposte meccanotrasduttive.
- Esiste la necessità di protocolli di stimolazione elettrica ottimizzati per le applicazioni cliniche.
- Questo modello mira a colmare il divario tra le pratiche cliniche e la ricerca sperimentale.
Scopo dello studio
- Dimostrare un modello murino per l'allenamento muscolare mediante stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES).
- Modificare un elettrodo superficiale per l'uso nei topi.
- Studiare gli effetti della NMES sulla fisiologia muscolare.
Metodi Utilizzati
- Modifica di un elettrodo clinico per superficie per l'uso nei topi.
- Anestesia e posizionamento dell'animale per la stimolazione.
- Applicazione della stimolazione elettrica neuromuscolare ai muscoli del compartimento anteriore.
- Analisi istologica e test contrattili dopo la stimolazione.
Risultati principali
- Aumento della vascolarizzazione del muscolo scheletrico osservato tramite analisi istologica.
- Potenziamento della forza tetanica massima nei muscoli trattati con NMES rispetto ai controlli.
- Assenza di inizio della cascata di degenerazione-rigenerazione dopo l'applicazione della NMES.
- Angiogenesi significativa nei muscoli trattati rispetto ai controlli.
Conclusioni
- Il modello NMES è efficace per lo studio della fisiologia muscolare nei topi.
- I risultati indicano un potenziale per lo sviluppo di protocolli NMES specifici per l'uso clinico.
- Questo approccio potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali sull'attivazione muscolare e sulla riabilitazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello murino di stimolazione elettrica neuromuscolare fornisce un sistema riproducibile per valutare le risposte adattative del muscolo scheletrico, sostenendo la validazione degli obiettivi nella ricerca sulla fisiologia muscolare e sulla riabilitazione. Permettendo una stimolazione controllata dei muscoli del compartimento anteriore, facilita l'analisi meccanicistica e la riduzione del rischio negli interventi neuromuscolari, nonché una maggiore affidabilità predittiva nei risultati traslazionali. Il modello collega le applicazioni cliniche della stimolazione elettrica neuromuscolare con la scoperta preclinica, offrendo una piattaforma scalabile per lo sviluppo di saggi e l'analisi dei percorsi biologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative all'attivazione muscolare e alle vie di segnalazione meccanotrasduttive.
- Valore operativo: Fornisce un modello standardizzato e riproducibile per la validazione funzionale di bersagli in biologia neuromuscolare.
- Valore strategico: Sostiene la previsione dell'efficacia nella selezione dei bersagli dimostrando adattamenti fisiologici come l'angiogenesi e l'aumento della forza contrattile senza degenerazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti, inclusi il picco di forza tetanica e la densità vascolare, per la valutazione di composti o stimoli.
- Valore operativo: Garantisce la prontezza del saggio attraverso un posizionamento standardizzato degli elettrodi e parametri di stimolazione, migliorando la riproducibilità tra laboratori.
- Valore strategico: Permette uno screening affidabile di composti fornendo un sistema rilevante per la malattia con uscite funzionali misurabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra l'allineamento dei biomarcatori traslazionali attraverso l'angiogenesi e i cambiamenti istologici rilevanti per la riparazione e la funzionalità muscolare.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, riproducendo protocolli clinici di stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES) in un contesto murino.
- Valore strategico: Guida decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, mostrando miglioramenti funzionali indotti dalla NMES senza innescare cascami di degenerazione e rigenerazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, sostenendo un affinamento iterativo degli interventi neuromuscolari basato su esiti fisiologici misurabili.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di attivazione muscolare e la chiarificazione dei percorsi mediante stimolazione controllata di specifiche unità motorie.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso protocolli standardizzati di stimolazione e posizionamento degli elettrodi, consentendo una valutazione costante di composti o stimoli.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni come la forza tetanica massima e la densità vascolare positiva per CD31 che permettono ai gruppi di lavoro di confrontare condizioni di stimolazione e risposte biologiche.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica dimostrando angiogenesi e miglioramenti funzionali che rispecchiano gli esiti clinici della riabilitazione.
- Riutilizzo aziendale: Propone l’elettrodo adattato e il protocollo di stimolazione come piattaforma riutilizzabile per diversi studi in fisiologia muscolare e riabilitazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie ad adattamenti fisiologici documentati, inclusi ipertrofia, angiogenesi e secrezione di fattori di crescita.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante posizionamento fisso degli elettrodi, parametri di stimolazione definiti e risposte misurabili di tipo istologico/contrattile.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella risposta muscolare alla stimolazione elettrica.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta in base al rischio, basata sulla sicurezza dimostrata (nessuna degenerazione) e sull'efficacia (aumento della forza e della vascolarizzazione) nei muscoli trattati.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze richieste: modifica degli elettrodi, manipolazione degli animali e ottimizzazione dei parametri di stimolazione.
- Le attrezzature necessarie includono un dispositivo NMES adattato per uso clinico, un voltmetro per la verifica dei collegamenti e capacità di analisi istologiche e di test contrattili.
- La standardizzazione tra gruppi richiede un accordo su posizionamento degli elettrodi, tempistica della stimolazione e protocolli di misurazione degli esiti.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la regolazione della durata dell'impulso, della frequenza e del tempo di pausa per diversi gruppi muscolari o modelli di malattia.
- I limiti pratici comprendono la difficoltà di posizionare con precisione gli elettrodi per ottenere le contrazioni muscolari desiderate, come indicato nel protocollo.
