Controllo della dimensione, forma e stabilità dei polimeri supramolecolari in acqua

L'obiettivo generale del seguente esperimento è controllare le dimensioni, la forma e la stabilità di nanoparticelle dinamiche supramolecolari in acqua. Questo risultato si ottiene progettando amplificatori dicotici che si autoassemblano o polimerizzano, le cui strutture molecolari sono progettate per presentare interazioni sia attrattive che repulsive. Ciò determina un meccanismo di crescita frustrata che porta alla formazione di nanoparticelle autoassemblate in acqua con una forma sferica controllata.

Come secondo passaggio, viene aumentata la concentrazione di sale nella soluzione acquosa, il che indebolisce le interazioni repulsive codificate nella struttura molecolare del disco amphi. Questo induce una transizione da sfera a bastoncino; indagini spettroscopiche di dicromismo circolare (CD) dipendenti dalla temperatura vengono effettuate per rivelare i meccanismi alla base di tale transizione da sfera a bastoncino. Inoltre, una combinazione di tecniche analitiche come la microscopia elettronica a trasmissione criogenica e la risonanza magnetica nucleare viene utilizzata per misurare e visualizzare la transizione da un tipo di aggregato all'altro. I risultati ottenuti mostrano che la transizione da sfera a bastoncino si manifesta in un potenziamento della cooperatività nella polimerizzazione supramolecolare.

Questo fenomeno ha origine da una transizione da un processo anti-cooperativo in nanoparticelle di dimensioni limitate a un meccanismo completamente cooperativo di nucleazione ed allungamento, che in questo caso porta alla formazione di polimeri supramolecolari molto grandi, ovvero nanostrutture dinamiche a forma di bastoncino. Il principale vantaggio dell'abbinare tecniche spettroscopiche come la spettroscopia CD, la diffrazione a raggi X a piccolo angolo e la risonanza magnetica nucleare con tecniche microscopiche come la criomicroscopia è che consente di misurare e visualizzare le transizioni dei polimeri supramolecolari in acqua. Questi polimeri dinamici possono rispondere a stimoli esterni, come variazioni di temperatura, variazioni di forza ionica o cambiamenti del pH.

La combinazione di questi metodi è ampiamente applicabile e può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della chimica molecolare e dei nanomateriali autoassemblati. Ad esempio, è possibile indagare la correlazione tra le dimensioni degli aggregati formati dall'autoassemblaggio di piccole unità molecolari e i meccanismi sottostanti di formazione. Le implicazioni di questa metodologia si estendono a un'ampia gamma di applicazioni biotecnologiche nanostrutturate.

Il nostro interesse è rivolto in particolare al campo dell'imaging biomedico e allo sviluppo di agenti di contrasto nanostrutturati autorganizzanti, in cui un delicato equilibrio tra stabilità dell'aggregato, elevato contrasto e capacità di eliminazione degli agenti di contrasto autorganizzanti è di fondamentale importanza per il loro successo nell'uso clinico. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di combinare tecniche di caratterizzazione quando abbiamo capito che lievi variazioni nella struttura molecolare dei costituenti autorganizzanti possono portare a differenze fondamentali nel meccanismo di polimerizzazione supramolecolare. A illustrare la procedura sarà Paul Beaumont, esperto e responsabile delle strutture criogeniche 10 presso l'Università Tecnica di Trovan.

Iniziare questo protocollo preparando una soluzione di BTA gadolinio DTPA in un tampone citrato 100 millimolare come descritto nel protocollo scritto. Insieme a questo video, riempire una cuvetta UV Q da un centimetro con la soluzione. Inserire la cuvetta nel portacuvette dello spettrometro circolare D crowism.

Misurare uno spettro di CD da 230 a 350 nanometri. Successivamente, misurare una curva di raffreddamento CD alla banda di intensità massima da 363 a 283 kelvin a una velocità di un kelvin al minuto. Poi, aggiungere lo stesso volume di soluzione tampone di cloruro di sodio due molare alla soluzione tampone di citrato di BTA-DTPA di gadolinio.

Questo aumenterà la forza ionica a un molarità di cloruro di sodio e diluirà i discos alla metà della concentrazione. Vortexare la soluzione con forza ionica aumentata per 40 secondi dopo l'aumento della forza ionica, quindi riacquisire uno spettro di CD da 230 a 350 nanometri. Successivamente, misurare una curva di raffreddamento in CD alla banda di CD con intensità massima da 363 a 283 kelvin a una velocità di un kelvin al minuto.

Esportare i dati grezzi di CD in Origin 8.5. Normalizzare gli spettri definendo l'effetto CD alla temperatura più alta misurata come pari a zero e l'effetto CD alla temperatura più bassa misurata come pari a uno, poiché l'entità dell'effetto CD è proporzionale al grado di aggregazione; le curve di CD normalizzate sono quindi proporzionali al grado di aggregazione. I dati normalizzati vengono adattati utilizzando l'opzione di fitting di curva non lineare in Origin Pro 8.5 con un modello di autoassemblaggio dipendente dalla temperatura.

In questo modello, si distinguono un regime di nucleazione e un regime di allungamento. In primo luogo, effettuare l'adattamento del grado di aggregazione nel regime di allungamento. In questa equazione, T rappresenta la temperatura variabile.

PHI N è l'elicità netta, proporzionale al grado di aggregazione, e HE è l'entalpia molecolare di allungamento. T TE rappresenta la temperatura di allungamento, ovvero la temperatura alla quale l'autoassemblaggio inizia a diventare termodinamicamente favorevole. Il fattore di normalizzazione fiat è introdotto per garantire che Phi N diviso fiat non superi l'unità, come richiesto dal vincolo secondo cui il grado di aggregazione non può eccedere.

L'adattamento con Unity permette di estrarre l'entalpia di allungamento in joule per mole e la temperatura di allungamento in Kelvin che caratterizza l'autoassemblaggio delle molecole per una data concentrazione. Quando si effettua l'adattamento, bisogna rispettare il vincolo per cui soltanto il grado di aggregazione a temperature inferiori a TE deve essere adattato, poiché l'equazione è valida unicamente nel regime di allungamento; dopo aver adattato la prima equazione, l'unico parametro incognito nell'equazione del regime di nucleazione è la costante di attivazione ka, che descrive la cooperatività della polimerizzazione supramolecolare. Per determinare la costante di attivazione, si adatta il grado di aggregazione ottenuto sperimentalmente a temperature superiori a TE nel regime di nucleazione.

Cominciare preparando le soluzioni per la microscopia elettronica come descritto nel testo. Preparare brevemente due tamponi: un tampone citrato 100 millimolare e un tampone citrato 100 millimolare con cinque molarità di cloruro di sodio. Sciogliere il BTA gadolinio DTPA in 0,1 millilitri di ciascuno dei tamponi preparati per ottenere una concentrazione finale di un millimolare. Successivamente, trattare al plasma una griglia al foil di carbonio rivestita di carbonio utilizzando un C Resington 2 0 8 carbon coer funzionante a cinque milliampere per 40 secondi.

La procedura di vetrificazione è un passaggio fondamentale della crio poiché garantisce che uno strato sottile di ISIS lucido prodotto sia adatto all'analisi TAM. La soluzione acquosa viene applicata sulla griglia durante la vetrificazione su un dispositivo automatizzato FEI vitro bot. Questo processo comprende l'applicazione del campione sulla griglia, l'eliminazione del liquido in eccesso per creare un film sottile della soluzione acquosa sulla griglia e la successiva vetrificazione immergendo rapidamente la griglia in etano liquido.

Dopo la vetrificazione, trasferire la griglia trattata in azoto liquido per preservarla, quindi trasferire manualmente la griglia del campione in una cassetta dell'autocaricatore, anch'essa raffreddata con azoto liquido. Il passo successivo consiste nell'inserire la cassetta nel TUE cryo Titan, TEM auto Loader. Il TUE Cryo Titan è dotato di una sorgente a emissione di campo che opera a 300 chilovolt.

La registrazione delle immagini TAM richiede esperienza e una manipolazione rapida. Questo perché il fascio di elettroni ad alta energia danneggia il campione durante l'acquisizione delle immagini. Registrare le immagini utilizzando una telecamera CCD dotata di un filtro energetico posteriore alla colonna. Poiché il gadolinio è fortemente paramagnetico e i segnali protonici verrebbero così notevolmente allargati, è stato utilizzato un diverso disco in cui il gadolinio è stato sostituito con ittrio diamagnetico e una soluzione di BT atrio.

Viene preparato il DTPA. Calcolare quanti milligrammi di BT atrio DTPA, con un peso molecolare di 2.979 grammi per mole, sono necessari per raggiungere una concentrazione obiettivo di un millimolare. Procedere quindi a sciogliere la quantità determinata di BT atrio DTPA in tampone succinato 50 millimolare in D2O, dopo aver trasferito con una pipetta 0,6 millilitri della soluzione risultante in un tubo NMR per wilm, un LABAs.

Inserire il campione in una cella di misura del spettrometro Nova 500 dotato di una sonda I-D-P-F-G da cinque millimetri di Varian. Eseguire gli esperimenti DOI come descritti nel testo, dopo aver registrato uno spettro NMR standard del protone, adattando l'impulso di 90 gradi e ottimizzando i tempi di miscelazione di conseguenza. Si utilizza la sequenza d'impulsi DOI in una singola acquisizione dopo aver determinato l'autodiffusione di HDO nella sonda di riferimento ovarica, e nel campione il coefficiente di diffusione degli aggregati viene determinato, a partire dal quale può essere calcolato il raggio idrodinamico.

Infine, calcolare i raggi idrodinamici RH degli aggregati utilizzando la relazione di Stokes-Einstein per la diffusione di una particella sferica. Il carattere ionico dei complessi periferici di gadolinio DTPA introduce una frustrazione nella crescita unidimensionale dei monomeri a disco, il cui nucleo è progettato per polimerizzare in aggregati allungati simili a bastoncelli. L'equilibrio tra interazioni attrattive e repulsive controlla le dimensioni e la forma degli aggregati.

Una tecnica potente per determinare la dimensione e la forma delle particelle in soluzione è la sorgente di sincrotrone. La diffusione di raggi X a piccolo angolo o sucks. Il BTA gadolinio DTPA è stato sciolto in una soluzione tampone citrato e i profili sucks sono stati registrati a due concentrazioni diverse.

Un coefficiente angolare prossimo a zero nella regione a basso Q indica l'assenza di una forma definita e un comportamento isotropo nell'aggregato, suggerendo la presenza di oggetti sferici. I dati misurati a diverse concentrazioni sono stati analizzati utilizzando un fattore di forma sferico monodisperso omogeneo, ottenendo un raggio calcolato di 3,2 nanometri. Il raggio geometrico calcolato del disco monomerico BTA gadolinio DTPA è di 3,0 nanometri, coerente con la presenza di aggregati con un rapporto dimensionale prossimo a uno, fornendo ulteriore evidenza della forma sferica e delle dimensioni nanometriche degli oggetti autoassemblati.

È stata eseguita una spettroscopia NMR ordinata per diffusione protonica. L'NMR DOI consente di determinare i coefficienti di diffusione degli aggregati supramolecolari dai quali può essere calcolato il loro raggio idrodinamico. Il coefficiente di diffusione dell'amplificato diamagnetico dicotico aggregato in un tampone succinato deuterato è stato determinato essere pari a 0,69 volte 10 alla potenza di meno 10 metri quadrati al secondo tramite la relazione di Stokes-Einstein.

È stato calcolato un raggio idrodinamico di 2,9 nanometri per gli oggetti discreti di forma sferica. Questa dimensione è in ottimo accordo con il valore ottenuto dai dati SOX per il BTA gadolinio DTPA. Uln'ulteriore evidenza di un controllo efficace sulla lunghezza del pacchetto unidimensionale è stata ottenuta da micrografie criogeniche al microscopio elettronico a trasmissione (cryo TEM).

Il complesso di gadolinio BTA-DTPA produce gli oggetti sferici previsti con diametri prossimi a sei nanometri a una concentrazione di un millimolare, il che conferma i risultati ottenuti mediante misurazioni di so e DOI. La formazione di polimeri supramolecolari a forma di bastoncino con elevato rapporto di aspetto è chiaramente osservabile nelle microfotografie criote a elevata forza ionica. La schermatura elettrostatica rappresenta la spiegazione più probabile di questo risultato.

La forma cambia da un aggregato sferico di circa sei nanometri di diametro a bastoncelli allungati con un diametro di sei nanometri e una lunghezza fino a diverse centinaia di nanometri. Qui sono mostrati gli spettri circolari di dicromia (CD) a temperatura ambiente del BTA gadolinio DTPA con concentrazione crescente di sale. La concentrazione del BTA gadolinio DTPA è di otto per 10 alla meno tre millimolare a bassa forza ionica e di quattro per 10 alla meno tre millimolare ad alta forza ionica.

Sebbene venga applicata una concentrazione significativamente più bassa per le misurazioni di CD, l'effetto cotoniero evidente indica la presenza di aggregati integri anche a concentrazioni micromolari. La forma dello spettro di CD cambia all'aumentare della concentrazione di sale, un buon indicatore di interazioni repulsive ridotte alla periferia degli stack e di un impacchettamento migliorato dei decos. Inoltre, le curve di raffreddamento di CD delle stesse soluzioni mostrano differenze distinte nella forma.

La temperatura alla quale inizia l'aggregazione si sposta verso valori più elevati all'aumentare della concentrazione di sale. Diventa inoltre evidente un meccanismo sempre più cooperativo, caratterizzato da un aumento più brusco dell'effetto di CD, mentre la curva di raffreddamento in assenza di cloruro di sodio è meglio descritta da un modello di autoassemblaggio ISO smico indicativo di un processo anti-cooperativo. La curva di raffreddamento a 1,0 molare di cloruro di sodio è tipica di un processo di autoassemblaggio cooperativo e può essere descritta da un modello di nucleazione-allungamento che quantifica i parametri termodinamici dell'autoassemblaggio di BTA gadolinio DTPA a zero e a un molare di cloruro di sodio.

L'utilizzo di un modello cooperativo rivela chiaramente la diminuzione di ka, ovvero la costante adimensionale di attivazione. Valori più bassi di KA indicano un grado maggiore di cooperatività nel processo di autoassemblaggio, che si manifesta nella formazione di polimeri supramolecolari altamente allungati. Come osservato in microscopia elettronica criogenica (cryo-TEM), nel tentativo di applicare le tecniche sperimentali dimostrate, è importante ricordare che soltanto una combinazione di metodi sperimentali consentirà di ottenere una descrizione complessiva significativa dei nanomateriali dinamici in esame.

Dopo aver visionato questo video, dovreste avere una buona comprensione dell'ampia applicabilità del nostro approccio sperimentale combinato e di come possa contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei nanomateriali autoassemblati e dei super poemi.