Polymerase Chain Reaction: protocollo Basic Plus Strategies Risoluzione dei problemi e ottimizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare i passaggi coinvolti nella reazione a catena della polimerasi o PCR, che viene utilizzata per produrre un'ampia fornitura di un segmento specifico di DNA da una piccola quantità di materiale di partenza. Innanzitutto, assemblare i reagenti e i materiali da utilizzare nella reazione PCR, quindi impostare la miscela di reazione, inclusi i quattro desossiribonucleotidi, il modello di DNA, i primer e la DNA polimerasi. Successivamente programmare, le condizioni del ciclo termico ed eseguire la reazione PCR.

A seguito di ciò. Controllare i risultati per determinare se la reazione ha avuto successo. In definitiva, una reazione a catena della polimerasi dovrebbe produrre un amplicone specifico della dimensione del prodotto desiderata.

In generale, le persone che non conoscono questo protocollo avranno un po' di difficoltà nell'impostare i calcoli di ciascuno dei reagenti variabili e talvolta hanno problemi con il pipettaggio, i volumi corretti, specialmente con la polimerasi che contiene glicerolo. Inizia l'esperimento con un secchiello del ghiaccio appena riempito. Indossare guanti per evitare di contaminare la reazione.

Miscela e reagenti. Disporre i componenti della PCR sul ghiaccio per scongelarli completamente. Questi includono i primer DNA stampo, il tampone di reazione DNA polimerasi 10 x con o senza cloruro di magnesio, i deossinucleotidi, l'acqua sterile e il cloruro di magnesio.

Il cloruro di magnesio è necessario se si utilizza il tampone senza cloruro di magnesio. Posizionare una piastra da 96 pozzetti in un secchiello per il ghiaccio come supporto per le provette PCR a parete sottile da 0,2 millilitri. Ora equipaggia il banco di lavoro con provette e tappi per PCR.

Un rack per provette PCR, un pennarello resistente all'etanolo e un set di micro pipettatori. Creare sempre una tabella di reagenti che descriva in dettaglio la miscela di reazione con acqua distillata sterile quantica per ottenere un volume finale di 50 microlitri. Ad esempio, utilizzando cinque microlitri di tampone senza magnesio, un microlitro di NTP DN da 10 millimolari e un magnesio ottimizzato da 4,0 millimolari.

Un microlitro di ogni 20 primer micromolari, 0,5 microlitri di un modello di due nanogrammi per microlitro. E 0,5 microlitri di polimerasi richiederebbero solo 33 microlitri di acqua sterile. Aggiungere cloruro di magnesio se non è presente nel tampone 10 x o se necessario per l'ottimizzazione della PCR.

Procedere all'etichettatura delle provette PCR con un pennarello resistente all'etanolo su ciascuna provetta di reazione. Innanzitutto, aggiungere le quantità calcolate di acqua sterile, quindi aggiungere 10 tampone e 10 millimolari DN NTP. Per questa reazione, stiamo eseguendo una titolazione con cloruro di magnesio.

Poiché la concentrazione di magnesio non sarà costante, il cloruro di magnesio viene aggiunto alle provette PCR singolarmente e il volume viene normalizzato a 10 microlitri con acqua sterile, in modo tale che 40 microlitri della miscela master finale vengano aggiunti a ciascuna provetta PCR. Per completare la reazione da 50 microlitri e il cloruro di magnesio, continuare ad aggiungere il modello di DNA e i primer. Infine, aggiungere da 0,5 a 2,5 unità di DNA polimerasi per reazione da 50 microlitri in un tubo microfuge da 1,8 millilitri.

Preparare una soluzione di miscelazione master sufficiente per i controlli e la perdita di trasferimento della pipetta. Impostare un micropipettatore a circa la metà del volume totale della soluzione e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Per ogni campione di prova, master eloquente, miscelare in provetta PCR.

Ora per il controllo negativo senza DNA stampo, aggiungere tutti i reagenti e utilizzare acqua sterile per compensare il volume di DNA mancante. Quindi, per il controllo positivo, utilizzare un set di DNA stampo e primer che amplificano un frammento noto nelle stesse condizioni dei campioni sperimentali di PCR. I termociclatori per PCR riscaldano e raffreddano rapidamente la miscela di reazione, consentendo la denaturazione indotta dal calore del duplex, l'inginocchiamento del DNAA dei primer ai filamenti più e meno del modello di DNA e l'allungamento del prodotto PCR.

I tempi di ciclo si basano sulle dimensioni del modello e sul contenuto GC del DNA per la formula generale. Inizia con una denaturazione iniziale del modello, quindi avvia da 25 a 35 cicli di un programma di ciclo di temperatura in tre fasi. Il primo passo di questi cicli è la denaturazione del DNA stamp.

Quindi programmare per l'ottimale, un inginocchiamento dei primer a circa cinque gradi Celsius al di sotto della temperatura di fusione apparente dei primer, seguito dalla fase di allungamento per portare la polimerasi al modello di DNA e sintetizzare il prodotto della PCR. Ora inserisci il numero di cicli. Prossimo programma.

Un passo di allungamento esteso per il completamento della sintesi degli ampliconi. Infine, includi una fase di terminazione, raffreddando la miscela a quattro gradi Celsius. Se le condizioni standard della PCR non producono l'amplicone desiderato, è necessaria l'ottimizzazione della PCR per ottenere risultati migliori.

Quindi, se le reazioni non hanno funzionato la prima volta, vuoi provare a risolvere la reazione. E quindi, per prima cosa, si vuole assicurarsi che il problema non sia un errore umano. E questo potrebbe accadere se si verifica un errore di pipettaggio o se, se si dimentica di aggiungere un reagente al test, si utilizza una delle provette.

Successivamente, puoi provare a modificare alcune delle rigidità della condizione in modo da poter modificare la configurazione del termociclatore, oppure puoi modificare la concentrazione di magnesio è un altro metodo alternativo. Puoi anche provare ad aggiungere alcuni additivi al reagente per risolvere i problemi. In alternativa, considerare la PCR con avvio a caldo come una modifica versatile in cui il tempo di denaturazione iniziale aumenta notevolmente.

L'elettroforesi su gel AROS viene quindi utilizzata per risolvere la PCR del gene GAL tre dal DNA genomico di S seia per determinare la concentrazione ottimale di ioni magnesio per questo set di reagenti, si noti che un prodotto PCR della dimensione prevista. 2098 coppie di basi appaiono a partire da una concentrazione di magnesio di 2,5 millimolari con una concentrazione ottimale a quattro millimolari su diversi modelli di DNA L'amplificazione del prodotto PCR desiderato come banda discreta richiede due magnesio millimolare. Riducendo il rigore della reazione a condizioni di amplificazione effettivamente non ottimali si ottiene uno striscio di prodotti non specifici.

Inoltre, con il rigore complessivo della riduzione della reazione, è necessaria una quantità inferiore di ione magnesio per formare un'icona dell'amplicona. Pertanto, l'ottimizzazione della PCR tenendo conto delle variabili può produrre il prodotto discreto desiderato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare e preparare una reazione a catena della polimerasi.

L'obiettivo è comprendere le variabili di ogni PCR e come possono essere manipolate per creare l'amplicone desiderato.