Polymerase Chain Reaction: protocollo Basic Plus Strategies Risoluzione dei problemi e ottimizzazione
22 maggio 2012
PCR è emerso come una tecnica comune in molti laboratori di biologia molecolare. A condizione: ecco un breve resoconto di diversi protocolli convenzionali di PCR. Poiché ogni reazione è un esperimento unico, condizioni ottimali richiesti per generare un prodotto variare. Comprendere le variabili in una reazione permetterà di migliorare notevolmente l'efficienza di risoluzione dei problemi, aumentando così la possibilità di ottenere il risultato desiderato.
L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare i passaggi coinvolti nella reazione a catena della polimerasi, o PCR, utilizzata per produrre una quantità sufficiente di un segmento specifico di DNA a partire da una piccola quantità di materiale iniziale. In primo luogo, assemblare i reagenti e i materiali da utilizzare nella reazione PCR, quindi preparare la miscela di reazione, inclusi i quattro deossiribonucleotidi, il template di DNA, i primer e la DNA polimerasi. Successivamente, impostare le condizioni di termociclaggio ed eseguire la reazione PCR.
Dopo questo, verificare i risultati per determinare se la reazione è stata corretta. In definitiva, una reazione a catena della polimerasi dovrebbe produrre un amplicone specifico della dimensione desiderata del prodotto.
Generalmente, le persone nuove rispetto a questo protocollo incontrano qualche difficoltà nell'impostare i calcoli per ciascuno dei reagenti variabili e talvolta hanno problemi con la pipettatura e i volumi corretti, specialmente con la polimerasi che contiene glicerolo. Iniziare l'esperimento con un secchio del ghiaccio appena riempito. Indossare guanti per evitare di contaminare la reazione.
Miscela e reagenti. Disporre i componenti della PCR sul ghiaccio per farli scongelare completamente. Questi includono il DNA stampo, i primer, il tampone di reazione 10 x con o senza cloruro di magnesio, i deossinucleotidi, l'acqua sterile e il cloruro di magnesio.
Il cloruro di magnesio è necessario se si utilizza il tampone senza cloruro di magnesio. Posizionare una piastra a 96 pozzetti in un contenitore con ghiaccio come supporto per le provette PCR da 0,2 millilitri con pareti sottili. Preparare ora il banco di lavoro con provette PCR e tappi.
Un rack per provette PCR, un pennarello resistente all'etanolo e una serie di micropipette. Creare sempre una tabella dei reagenti che specifichi la miscela di reazione con acqua distillata sterile in quantità tale da ottenere un volume finale di 50 microlitri. Ad esempio, utilizzando cinque microlitri di un tampone senza magnesio, un microlitro di DNTP a 10 millimolari e magnesio ottimizzato a 4,0 millimolari.
Un microlitro di ciascun primer a 20 micromolari, 0,5 microlitri di un template a due nanogrammi per microlitro e 0,5 microlitri di polimerasi richiedono soltanto 33 microlitri di acqua sterile. Aggiungere cloruro di magnesio se non è presente nel buffer 10x o se necessario per l'ottimizzazione della PCR.
Procedere etichettando le provette PCR con un pennarello resistente all'etanolo per ogni provetta di reazione. Aggiungere prima le quantità calcolate di acqua sterile, quindi aggiungere il tampone 10x e i DNTP a 10 millimolare. Per questa reazione, stiamo eseguendo una titolazione con cloruro di magnesio.
Poiché la concentrazione di magnesio non sarà costante, il cloruro di magnesio viene aggiunto singolarmente ai tubi PCR e il volume viene portato a 10 microlitri con acqua sterile, in modo che 40 microlitri della miscela maestra finale vengano aggiunti a ciascun tubo PCR. Per completare la reazione da 50 microlitri con il cloruro di magnesio, aggiungere il template di DNA e i primer. Infine, aggiungere da 0,5 a 2,5 unità di DNA polimerasi per ogni reazione da 50 microlitri in un tubo microcentrifuga da 1,8 millilitri.
Preparare una soluzione della miscela madre sufficiente a includere i controlli e a compensare le perdite durante il trasferimento con pipetta. Impostare una micropipetta su circa metà del volume totale della soluzione e mescolare delicatamente aspirando e dispensando. Per ogni campione in esame, aggiungere la miscela madre nel tubo PCR.
Ora, per il controllo negativo senza DNA stampo, aggiungere tutti i reagenti e utilizzare acqua sterile per compensare il volume di DNA mancante. Successivamente, per il controllo positivo, utilizzare un set di DNA stampo e primer che amplifichi un frammento noto nelle stesse condizioni dei campioni sperimentali di PCR. I termociclatori per PCR riscaldano e raffreddano rapidamente la miscela di reazione, consentendo la denaturazione indotta dal calore del DNA a doppio filamento, l'appaiamento dei primer ai filamenti positivo e negativo del DNA stampo e l'allungamento del prodotto di PCR.
I tempi di ciclaggio si basano sulla dimensione del modello e sul contenuto di GC del DNA secondo la formula generale. Iniziare con una denaturazione iniziale del modello, quindi avviare da 25 a 35 cicli di un programma di ciclo termico a tre passaggi. Il primo passaggio di questi cicli serve a denaturare il modello di DNA.
Quindi impostare un'annealing ottimale dei primer di circa cinque gradi Celsius al di sotto della temperatura apparente di fusione dei primer, seguito dal passaggio di allungamento per consentire alla polimerasi di legarsi al template di DNA e sintetizzare il prodotto PCR. Immettere ora il numero di cicli. Passaggio successivo.
Un passaggio esteso di allungamento per completare la sintesi degli ampliconi. Infine, includere un passaggio di terminazione, raffreddando la miscela a quattro gradi Celsius. Se le condizioni standard di PCR non producono l'amplicone desiderato, è necessaria un'ottimizzazione della PCR per ottenere risultati migliori.
Quindi, se le reazioni non hanno funzionato al primo tentativo, è necessario provare a risolvere il problema. Per prima cosa, è importante verificare che il problema non sia dovuto a un errore umano. Ciò può accadere se si commette un errore durante la pipettaggio o se si dimentica di aggiungere un reagente al provetta, a una delle provette di prova.
Successivamente, è possibile provare a modificare alcune delle stringenze della condizione, in modo da cambiare l'impostazione del termociclatore, oppure si può modificare la concentrazione di magnesio, che rappresenta un altro metodo alternativo. È inoltre possibile provare ad aggiungere alcuni additivi al reagente per risolvere i problemi riscontrati. In alternativa, si può considerare la PCR a inizio caldo (hot start PCR) come una modifica versatile, nella quale il tempo di denaturazione iniziale è notevolmente aumentato.
Successivamente, l'elettroforesi su gel AROS viene utilizzata per risolvere la PCR del gene GAL tre dal DNA genomico di S. seia al fine di determinare la concentrazione ottimale di ioni magnesio per questo insieme di reagenti; si osserva un prodotto di PCR della dimensione prevista, 2098 paia di basi, a partire da una concentrazione di magnesio di 2,5 millimolare, con una concentrazione ottimale a 4 millimolari. Su diversi template di DNA, l'amplificazione del prodotto PCR desiderato sotto forma di banda distinta richiede 2 millimolari di magnesio. La riduzione della stringenza della reazione, portando a condizioni di amplificazione efficacemente subottimali, produce una strisciatura di prodotti non specifici.
Inoltre, aumentando la stringenza complessiva della reazione, è necessaria una quantità minore di ioni magnesio per formare un icona di amplificato. Pertanto, ottimizzando la PCR e prestando attenzione alle variabili, è possibile ottenere il prodotto desiderato in modo specifico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare e preparare una reazione a catena della polimerasi.
L'obiettivo è comprendere le variabili di ogni PCR e come possono essere modificate per generare l'amplicone desiderato.
Panoramica
Questo articolo fornisce una guida completa alla tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR), descrivendo i passaggi necessari per amplificare con successo il DNA. Si sottolinea l'importanza della comprensione delle variabili della reazione per la risoluzione dei problemi e l'ottimizzazione dei risultati della PCR.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Molecolare
- Genetica
- Biotecnologia
Sfondo
- La PCR è un metodo ampiamente utilizzato per l'amplificazione del DNA.
- Ogni reazione di PCR è unica e richiede condizioni specifiche.
- Comprendere i componenti e i loro ruoli è fondamentale per il successo.
- I problemi comuni includono errori di pipettaggio e calcoli dei reagenti.
Scopo dello studio
- Illustrare i passaggi necessari per impostare una reazione di PCR.
- Fornire suggerimenti per la risoluzione dei problemi comuni nella PCR.
- Evidenziare l'importanza dell'ottimizzazione delle condizioni di reazione.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dei reagenti e dei materiali per la PCR.
- Impostazione della miscela di reazione con volumi precisi.
- Programmazione delle condizioni di termociclaggio per l'amplificazione del DNA.
- Utilizzo dell'elettroforesi su gel per analizzare i prodotti della PCR.
Risultati principali
- È stata ottenuta un'amplificazione riuscita di segmenti di DNA.
- L'ottimizzazione della concentrazione degli ioni magnesio ha migliorato i risultati.
- Sono state identificate strategie comuni di risoluzione dei problemi.
- È stato dimostrato che la variabilità delle condizioni di reazione influisce sugli esiti.
Conclusioni
- Comprendere i componenti della PCR è essenziale per una diagnosi efficace dei problemi.
- L'ottimizzazione delle condizioni può migliorare significativamente il successo della PCR.
- Esperimenti futuri dovrebbero concentrarsi sul perfezionamento delle tecniche per ottenere risultati migliori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è fondamentale per la scoperta molecolare, in quanto consente l'amplificazione precisa del DNA a partire da una quantità minima di materiale iniziale. Un'allestimento accurato della PCR, insieme alla risoluzione dei problemi e all'ottimizzazione, influisce direttamente sull'affidabilità del saggio, sulla validazione dell'obiettivo e sulla riproducibilità dei flussi di lavoro successivi nel settore biofarmaceutico R&D. La padronanza delle variabili e dei controlli della PCR è essenziale per garantire un'elevata affidabilità predittiva e un processo decisionale adeguato ai rischi nei flussi di scoperta e preclinici.
Applicazioni strategiche nella biofarmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente un'ampificazione rapida di bersagli genetici per la verifica di ipotesi e l'analisi di percorsi molecolari.
- Permette la validazione funzionale dei bersagli garantendo un rilevamento specifico e riproducibile del DNA.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici attraverso la manipolazione controllata di variabili e la risoluzione dei problemi.
- Migliora l'affidabilità predittiva riducendo al minimo l'amplificazione non specifica e gli artefatti sperimentali.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce template di DNA validati per lo sviluppo di saggi successivi e flussi di lavoro di screening.
- Standardizza le condizioni di reazione per garantire riproducibilità e risultati quantitativi tra diversi lotti.
- Consente scalabilità e riutilizzo della piattaforma ottimizzando i componenti della reazione e i parametri di ciclatura.
- Permette una valutazione affidabile dei composti riducendo al minimo i falsi positivi derivanti da prodotti non specifici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori consentendo una rilevazione genetica precisa nei modelli preclinici.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica attraverso protocolli di amplificazione robusti.
- Riduce il rischio biologico ottimizzando e risolvendo problemi relativi a bersagli genetici rilevanti per la malattia.
- Migliora la riduzione del rischio predittivo controllando la variabilità e la specificità delle reazioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La PCR si colloca all'incrocio tra la fase iniziale della scoperta, lo sviluppo di saggi e la ricerca preclinica, fungendo da elemento abilitante fondamentale per l'analisi genetica e la validazione degli obiettivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'amplificazione specifica del DNA.
- Screening: Fornisce template di DNA pronti per il saggio con risultati riproducibili e quantitativi.
- Analisi: Offre letture chiare per confrontare condizioni sperimentali e ottimizzare le variabili.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica supportando l'allineamento dei biomarcatori e la validazione genetica.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile e standardizzata per diversi bersagli genetici e flussi di lavoro.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nei saggi genetici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro di amplificazione del DNA.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale riducendo il rischio di fallimento sperimentale.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione dei bersagli genetici con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione dei reagenti, nella precisione della pipettaggio e nella programmazione dei cicli termici.
- Necessita dell'accesso a termociclatori calibrati, sistemi di elettroforesi su gel e infrastrutture analitiche.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per l'allestimento delle reazioni e per le procedure di risoluzione dei problemi.
- È necessario adattare le strategie di ottimizzazione a diversi template di DNA e a diversi set di primer.
- I limiti pratici includono la possibilità di amplificazione non specifica e la necessità di un'ottimizzazione iterativa.
