Name: Polymerase Chain Reaction: protocollo Basic Plus Strategies Risoluzione dei problemi e ottimizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Impara a eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per l'amplificazione del DNA con risoluzione dei problemi e ottimizzazione delle condizioni. Questo metodo è essenziale per la biologia molecolare.

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Un ringraziamento speciale a Kris Reddi presso la UCLA per la creazione di reagenti e versando gel e Erin Sanders presso la UCLA per l&#39;ispirazione, guida e sostegno e correzione del manoscritto. Vorrei anche ringraziare Giancarlo Costaguta e Gregory S. Payne per l&#39;alimentazione del DNA genomico lievito e primer per amplificare il gene GAL3. Vorrei anche ringraziare Shah Bhairav ​​per scattare le foto delle apparecchiature di laboratorio e reagenti usati per fare figure da 2 a 4. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito dal HHMI (HHMI Grant No. 52006944).

<ol><li>Albert, J., Fenyo, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+sensitive%2C+and+specific+detection+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+clinical+specimens+by+polymerase+chain+reaction+with+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 1560-1564 (1990).</li>
<li>Baskaran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+amplification+of+a+mixture+of+deoxyribonucleic+acids+with+varying+GC+content%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content.</a> Genome Res. 6, 633-638 (1996).</li>
<li>Blanchard, M. M., Taillon-Miller, P., Nowotny, P., Nowotny, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+buffer+optimization+with+uniform+temperature+regimen+to+facilitate+automation%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">PCR buffer optimization with uniform temperature regimen to facilitate automation.</a> PCR Methods Appl. 2, 234-240 (1993).</li>
<li>Borer, P. N., Dengler, B., Tinoco, I. Jr, Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+ribonucleic+acid+double-stranded+helices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.</a> J. Mol. Biol. 86, 843-853 (1974).</li>
<li>Breslauer, K. J., Frank, R., Blocker, H., Marky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+DNA+duplex+stability+from+the+base+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Predicting DNA duplex stability from the base sequence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3746-3750 (1986).</li>
<li>Chou, Q., Russell, M., Birch, D. E., Raymond, J., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+pre-PCR+mis-priming+and+primer+dimerization+improves+low-copy-number+amplifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications.</a> Nucleic Acids Res. 20, 1717-1723 (1992).</li>
<li>Coleman, W. B., Tsongalis, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColeman%2C+WB+%22Diagnostics+for+the+clinical+laboration%22">Diagnostics for the clinical laboration</a>. , Humana Press. (2005).</li>
<li>D'Aquila, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+sensitivity+and+specificity+of+PCR+by+pre-amplification+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating.</a> Nucleic Acids Res. 19, 3749(1991).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Touchdown%27+PCR+to+circumvent+spurious+priming+during+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4008(1991).</li>
<li>Erlich, H. A., Gelfand, D., Sninsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the polymerase chain reaction.</a> Science. 252, 1643-1651 (1991).</li>
<li>Frey, U. H., Bachmann, H. S., Peters, J., Siffert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-amplification+of+GC-rich+regions%3A+%27slowdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">PCR-amplification of GC-rich regions: 'slowdown PCR.</a> Nat. Protoc. 3, 1312-1317 (2008).</li>
<li>Haqqi, T. M., Sarkar, G., David, C. S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+amplification+with+PCR+of+a+refractory+segment+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specific amplification with PCR of a refractory segment of genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 16, 11844(1988).</li>
<li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR Protocols: A guide to methods and applications</a>. , Academic Press, Inc. San Diego. (1990).</li>
<li>King, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+N+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 630, Humana Press. (2010).</li>
<li>Kleppe, K., Ohtsuka, E., Kleppe, R., Molineux, I., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+polynucleotides.+XCVI.+Repair+replications+of+short+synthetic+DNA%27s+as+catalyzed+by+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.</a> J. Mol. Biol. 56, 341-361 (1971).</li>
<li>Korbie, D. J., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touchdown+PCR+for+increased+specificity+and+sensitivity+in+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.</a> Nat. Protoc. 3, 1452-1456 (2008).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Appendix 3, 1-14 (2001).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, Appendix 4J(2002).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Kwok, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+immunodeficiency+virus+sequences+by+using+in+vitro+enzymatic+amplification+and+oligomer+cleavage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection.</a> J. Virol. 61, 1690-1694 (1987).</li>
<li>McConlogue, L., Brow, M. A., Innis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-independent+DNA+amplification+by+PCR+using+7-deaza-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-independent DNA amplification by PCR using 7-deaza-2'-deoxyguanosine.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9869(1988).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unusual+origin+of+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">The unusual origin of the polymerase chain reaction.</a> Sci. Am. 262, 56-65 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+amplification+for+DNA+analysis+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biol.+Clin.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.</a> Ann. Biol. Clin. (Paris). 48, 579-582 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction+in+an+anemic+mode%3A+how+to+avoid+cold+oligodeoxyribonuclear+fusion%29%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion).</a> PCR Methods Appl. 1, 1-4 (1991).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Paabo, S., Gifford, J. A., Wilson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+sequences+from+a+7000-year+old+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9775-9787 (1988).</li>
<li>Rees, W. A., Yager, T. D., Korte, J., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+can+eliminate+the+base+pair+composition+dependence+of+DNA+melting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting.</a> Biochemistry. 32, 137-144 (1993).</li>
<li>Roux, K. H., Hecker, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optimization+using+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One-step optimization using touchdown and stepdown PCR.</a> Methods Mol. Biol. 67, 39-45 (1997).</li>
<li>Rychlik, W., Spencer, W. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239, 487-491 (1988).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Sambrook, J. A. R., David, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+JAR+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual</a>. 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Sarkar, G., Kapelner, S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formamide+can+dramatically+improve+the+specificity+of+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formamide can dramatically improve the specificity of PCR.</a> Nucleic Acids Res. 18, 7465(1990).</li>
<li>Smit, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+codon+12+mutations+occur+very+frequently+in+pancreatic+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS codon 12 mutations occur very frequently in pancreatic adenocarcinomas.</a> Nucleic Acids Res. 16, 7773-7782 (1988).</li>
<li>Wilson, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+facilitation+of+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 3741-3751 (1997).</li>
<li>Wu, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+R+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 218, Academic Press, Inc. San Diego. (1993).</li>
</ol>

Non ho nulla da rivelare.

PCR è diventato uno strumento indispensabile nell&#39;arsenale scienze biologiche. PCR ha alterato il corso della scienza che permette ai biologi di cedere il potere in genomi, e fare i geni ibridi caratterizzati da nuove funzioni, permettendo specifica e accurata sperimentazione clinica, ottenendo informazioni sui genomi e sulle diversità, così come geni semplicemente clonazione per ulteriori analisi biochimiche. Applicazione PCR è limitata solo dalla fantasia dello scienziato che esercita il suo potere. Ci sono molti libri e articoli che descrivono nuovi usi specializzati di PCR, e molti altri saranno sviluppati nel corso della prossima generazione di scienze biologiche. Tuttavia, a prescindere degli approcci previsti, il quadro fondamentale è rimasta la stessa. PCR, in tutta la sua grandezza, è un&#39;applicazione in vitro per generare grandi quantità di uno specifico segmento di DNA. Progettazione di un esperimento di PCR richiede pensiero e pazienza. I risultati mostrati nella Figura 3 esemplificano una delle principali challenges quando si progetta una strategia di ottimizzazione per la PCR. Cioè, come un parametro di PCR viene modificato, esso può influire altro. Ad esempio, se la prima PCR è stata effettuata a livello sub-ottimale temperatura di annealing (58 ° C) con un ottimale Mg 2 + concentrazione di 2,0 mM, allora il risultato produrrebbe una macchia, come visibile in figura 3c. Un tentativo di risolvere il striscio potrebbe comportare la creazione di condizioni di PCR con reazioni contenenti 2,0 mM MgCl 2 e la regolazione della temperatura di annealing a 61 ° C. Tuttavia, come si vede in figura 3a, ciò non produrrebbe alcun prodotto. Di conseguenza, è consigliabile per titolare reagenti, invece di aggiungere una concentrazione a una singola reazione, quando la risoluzione falsi risultati. Inoltre, le regolazioni più comuni che sono necessarie per ottimizzare un esperimento PCR sono per cambiare la concentrazione di Mg 2 + e di correggere le temperature di ricottura. Tuttavia, se tali modifiche non ridurre o abolire i risultati aberranti, la titolazione di additives e / o modificare i protocolli di ciclismo condizioni descritte nelle tabelle 2-6 può alleviare il problema. Se tutto il resto fallisce, ridisegnare i primer e provare, riprovare.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Taq Polymeras </td><td> Sigma </td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Qiagen </td><td> 201225 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml parete sottile Tubi tubi PCR </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml sottili parete del tubo caps </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> TE Buffer: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA sale disodico diidrato </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCl </td><td> Sigma </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> Phage Primer personalizzato </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td> Phage Primer personalizzato </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td> Lievito Primer personalizzato </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> SacI-Gal3 (-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td> Lievito Primer personalizzato </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> Gal3 (1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG </td></tr><tr><td> Thermal Cycler </td><td> Bio Rad </td><td> 170-9703 </td><td> Il mio Cycler </td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> ISC BioExpress </td><td> E-3120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gel elettroforesi </td><td> Hoeffer Scientific Instruments </td><td> Modello HE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1 kb DNA Ladder </td><td> New England BioLabs </td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td> Bio Rad Power Pack </td><td> Bio Rad </td><td> 164-5050 </td><td> PowerPac di base </td></tr><tr><td> Gel Doc sistema </td><td> Fotodyne Incorporated </td><td colspan="2"> FOTO / Analyst Investigator FX Workstation </td></tr></tbody></table>

polymerase chain reaction: protocollo basic plus strategies risoluzione dei problemi e ottimizzazione

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

Nelle scienze biologiche ci sono stati progressi tecnologici che catapulteranno la disciplina in età d&#39;oro della scoperta. Ad esempio, il campo della microbiologia è stato trasformato con l&#39;avvento di microscopio Anton van Leeuwenhoek, che ha permesso agli scienziati di visualizzare procarioti per la prima volta. Lo sviluppo della reazione a catena della polimerasi (PCR) è una di quelle innovazioni che hanno cambiato il corso della scienza molecolare con il suo impatto si estende innumerevoli sottodiscipline in biologia. Il processo teorico è stato delineato dal Keppe e collaboratori nel 1971, tuttavia, è stato altri 14 anni fino a quando la procedura completa PCR è stata descritta e sperimentale applicata da Kary Mullis mentre al Cetus Corporation nel 1985. Automazione e perfezionamento di questa tecnica progredito con l&#39;introduzione di un DNA polimerasi termica stabile dal Thermus aquaticus batterio, di conseguenza il nome DNA polimerasi Taq. PCR è un powetecnica di amplificazione rful che può generare un ampio rifornimento di uno specifico segmento di DNA (cioè, un amplicone) da solo una piccola quantità di materiale di partenza (cioè, DNA templato o sequenza bersaglio). Anche se semplice e generalmente senza problemi, ci sono delle trappole che complicano la reazione di produzione di falsi risultati. Quando PCR non si può portare a molti prodotti non specifici di DNA di varie dimensioni che appaiono come una scala o di striscio di bande su gel di agarosio. Talvolta sono prodotti formare affatto. Un altro potenziale problema si verifica quando le mutazioni vengono involontariamente introdotti negli ampliconi, risultante in una popolazione eterogenea di prodotti di PCR. Guasti di PCR può diventare frustrante se non la pazienza e la risoluzione dei problemi attenta sono impiegati per risolvere e risolvere il problema (s). Questo protocollo illustra i principi fondamentali della PCR, fornisce una metodologia che comporta l&#39;amplificazione di sequenze bersaglio maggior parte, e presenta le strategie per ottimizzare una reazione. Seguendo questa guida PCR, students dovrebbe essere in grado di: <ul><li> Impostare le reazioni e le condizioni termiche in bicicletta per un esperimento di PCR convenzionale </li><li> Comprendere la funzione dei vari componenti della reazione e il loro effetto complessivo su un esperimento di PCR </li><li> Progettare e ottimizzare un esperimento di PCR per qualsiasi modello di DNA </li><li> Risoluzione dei problemi falliti esperimenti di PCR </li></ul>

PCR è emerso come una tecnica comune in molti laboratori di biologia molecolare. A condizione: ecco un breve resoconto di diversi protocolli convenzionali di PCR. Poiché ogni reazione è un esperimento unico, condizioni ottimali richiesti per generare un prodotto variare. Comprendere le variabili in una reazione permetterà di migliorare notevolmente l&#39;efficienza di risoluzione dei problemi, aumentando così la possibilità di ottenere il risultato desiderato.

Polymerase Chain Reaction: protocollo Basic Plus Strategies Risoluzione dei problemi e ottimizzazione

Nelle scienze biologiche si sono verificati progressi tecnologici che hanno catapultato la disciplina in ere d'oro della scoperta. Per esempio, il campo di...

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare i passaggi coinvolti nella reazione a catena della polimerasi, o PCR, utilizzata per produrre una quantità sufficiente di un segmento specifico di DNA a partire da una piccola quantità di materiale iniziale. In primo luogo, assemblare i reagenti e i materiali da utilizzare nella reazione PCR, quindi preparare la miscela di reazione, inclusi i quattro deossiribonucleotidi, il template di DNA, i primer e la DNA polimerasi. Successivamente, impostare le condizioni di termociclaggio ed eseguire la reazione PCR.Dopo questo, verificare i risultati per determinare se la reazione è stata corretta. In definitiva, una reazione a catena della polimerasi dovrebbe produrre un amplicone specifico della dimensione desiderata del prodotto.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo protocollo incontrano qualche difficoltà nell'impostare i calcoli per ciascuno dei reagenti variabili e talvolta hanno problemi con la pipettatura e i volumi corretti, specialmente con la polimerasi che contiene glicerolo. Iniziare l'esperimento con un secchio del ghiaccio appena riempito. Indossare guanti per evitare di contaminare la reazione.Miscela e reagenti. Disporre i componenti della PCR sul ghiaccio per farli scongelare completamente. Questi includono il DNA stampo, i primer, il tampone di reazione 10 x con o senza cloruro di magnesio, i deossinucleotidi, l'acqua sterile e il cloruro di magnesio.Il cloruro di magnesio è necessario se si utilizza il tampone senza cloruro di magnesio. Posizionare una piastra a 96 pozzetti in un contenitore con ghiaccio come supporto per le provette PCR da 0,2 millilitri con pareti sottili. Preparare ora il banco di lavoro con provette PCR e tappi.Un rack per provette PCR, un pennarello resistente all'etanolo e una serie di micropipette. Creare sempre una tabella dei reagenti che specifichi la miscela di reazione con acqua distillata sterile in quantità tale da ottenere un volume finale di 50 microlitri. Ad esempio, utilizzando cinque microlitri di un tampone senza magnesio, un microlitro di DNTP a 10 millimolari e magnesio ottimizzato a 4,0 millimolari.Un microlitro di ciascun primer a 20 micromolari, 0,5 microlitri di un template a due nanogrammi per microlitro e 0,5 microlitri di polimerasi richiedono soltanto 33 microlitri di acqua sterile. Aggiungere cloruro di magnesio se non è presente nel buffer 10x o se necessario per l'ottimizzazione della PCR.Procedere etichettando le provette PCR con un pennarello resistente all'etanolo per ogni provetta di reazione. Aggiungere prima le quantità calcolate di acqua sterile, quindi aggiungere il tampone 10x e i DNTP a 10 millimolare. Per questa reazione, stiamo eseguendo una titolazione con cloruro di magnesio.Poiché la concentrazione di magnesio non sarà costante, il cloruro di magnesio viene aggiunto singolarmente ai tubi PCR e il volume viene portato a 10 microlitri con acqua sterile, in modo che 40 microlitri della miscela maestra finale vengano aggiunti a ciascun tubo PCR. Per completare la reazione da 50 microlitri con il cloruro di magnesio, aggiungere il template di DNA e i primer. Infine, aggiungere da 0,5 a 2,5 unità di DNA polimerasi per ogni reazione da 50 microlitri in un tubo microcentrifuga da 1,8 millilitri.Preparare una soluzione della miscela madre sufficiente a includere i controlli e a compensare le perdite durante il trasferimento con pipetta. Impostare una micropipetta su circa metà del volume totale della soluzione e mescolare delicatamente aspirando e dispensando. Per ogni campione in esame, aggiungere la miscela madre nel tubo PCR.Ora, per il controllo negativo senza DNA stampo, aggiungere tutti i reagenti e utilizzare acqua sterile per compensare il volume di DNA mancante. Successivamente, per il controllo positivo, utilizzare un set di DNA stampo e primer che amplifichi un frammento noto nelle stesse condizioni dei campioni sperimentali di PCR. I termociclatori per PCR riscaldano e raffreddano rapidamente la miscela di reazione, consentendo la denaturazione indotta dal calore del DNA a doppio filamento, l'appaiamento dei primer ai filamenti positivo e negativo del DNA stampo e l'allungamento del prodotto di PCR.I tempi di ciclaggio si basano sulla dimensione del modello e sul contenuto di GC del DNA secondo la formula generale. Iniziare con una denaturazione iniziale del modello, quindi avviare da 25 a 35 cicli di un programma di ciclo termico a tre passaggi. Il primo passaggio di questi cicli serve a denaturare il modello di DNA.Quindi impostare un'annealing ottimale dei primer di circa cinque gradi Celsius al di sotto della temperatura apparente di fusione dei primer, seguito dal passaggio di allungamento per consentire alla polimerasi di legarsi al template di DNA e sintetizzare il prodotto PCR. Immettere ora il numero di cicli. Passaggio successivo.Un passaggio esteso di allungamento per completare la sintesi degli ampliconi. Infine, includere un passaggio di terminazione, raffreddando la miscela a quattro gradi Celsius. Se le condizioni standard di PCR non producono l'amplicone desiderato, è necessaria un'ottimizzazione della PCR per ottenere risultati migliori.Quindi, se le reazioni non hanno funzionato al primo tentativo, è necessario provare a risolvere il problema. Per prima cosa, è importante verificare che il problema non sia dovuto a un errore umano. Ciò può accadere se si commette un errore durante la pipettaggio o se si dimentica di aggiungere un reagente al provetta, a una delle provette di prova.Successivamente, è possibile provare a modificare alcune delle stringenze della condizione, in modo da cambiare l'impostazione del termociclatore, oppure si può modificare la concentrazione di magnesio, che rappresenta un altro metodo alternativo. È inoltre possibile provare ad aggiungere alcuni additivi al reagente per risolvere i problemi riscontrati. In alternativa, si può considerare la PCR a inizio caldo (hot start PCR) come una modifica versatile, nella quale il tempo di denaturazione iniziale è notevolmente aumentato.Successivamente, l'elettroforesi su gel AROS viene utilizzata per risolvere la PCR del gene GAL tre dal DNA genomico di S. seia al fine di determinare la concentrazione ottimale di ioni magnesio per questo insieme di reagenti; si osserva un prodotto di PCR della dimensione prevista, 2098 paia di basi, a partire da una concentrazione di magnesio di 2,5 millimolare, con una concentrazione ottimale a 4 millimolari. Su diversi template di DNA, l'amplificazione del prodotto PCR desiderato sotto forma di banda distinta richiede 2 millimolari di magnesio. La riduzione della stringenza della reazione, portando a condizioni di amplificazione efficacemente subottimali, produce una strisciatura di prodotti non specifici.Inoltre, aumentando la stringenza complessiva della reazione, è necessaria una quantità minore di ioni magnesio per formare un icona di amplificato. Pertanto, ottimizzando la PCR e prestando attenzione alle variabili, è possibile ottenere il prodotto desiderato in modo specifico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare e preparare una reazione a catena della polimerasi.L'obiettivo è comprendere le variabili di ogni PCR e come possono essere modificate per generare l'amplicone desiderato.

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