Adattamento 3' amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare le sequenze di trascritti di mRNA dall'estremità a tre primi alle regioni all'interno della regione codificante la proteina utilizzando primer nidificati specifici per il trascritto in due PCR successive e sequenziando i prodotti PCR purificati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo genetico, come la determinazione del segnale di poliadenilazione, il codone di stop e la sequenza della regione non tradotta a tre primi del trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata a qualsiasi trascritto se la sequenza della piccola regione del telaio di lettura aperto è L'implicazione di questa tecnica si estende verso la diagnosi del cancro, perché può rilevare geni di fusione specifici del tumore e varianti di splicing.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo identificato nuovi trascritti con regioni non tradotte a tre prim precedentemente non caratterizzate. Per iniziare il protocollo, scongelare la miscela di cellule di fenolo e guanidina isotiocianato su ghiaccio. Una volta scongelato, aggiungere 100 microlitri di cloroformio alla provetta da microcentrifuga in una cappa per PCR.

Agitare il campione per 10-15 secondi fino a quando la miscela è rosa e opaca. Quindi, incubare il campione su ghiaccio per 15 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare il campione per 15 minuti a 20, 800 g e quattro gradi Celsius.

Rimuovere con cautela la fase acquosa incolore superiore e trasferirla in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, passare alla precipitazione e aggiungere un volume uguale di isopropanolo al campione. Aggiungere un microlitro di co-precipitante al campione per fungere da vettore per l'RNA e per aiutare a visualizzare l'RNA nelle fasi successive.

Incubare i campioni a 80 gradi Celsius per almeno quattro ore. Dopo l'incubazione, trasferire il campione in una centrifuga raffreddata e centrifugare per 35 minuti a 20, 800 g e quattro gradi Celsius. Dopo la rotazione, l'RNA apparirà come una macchia blu sul fondo del tubo.

Rimuovere con cautela l'isopropanolo dal campione. Aggiungere 500 microlitri di etanolo all'80% e risospendere il pellet agitando brevemente per tre secondi. Centrifugare nuovamente il campione.

Rimuovere tutto l'etanolo dal campione e lasciare asciugare il campione all'aria per circa 10 minuti. Una volta che il campione è asciutto, risospenderlo in 35 microlitri di acqua priva di RNasi. Quindi, posizionare il campione su un blocco termico.

Impostare a 65 gradi Celsius per cinque minuti per garantire che l'RNA sia completamente in soluzione. Dopo il riscaldamento, posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio. Per un volume di reazione finale di 50 microlitri, aggiungere quattro microgrammi di RNA totale con aggiunta di acqua a un volume totale di 22 microlitri in una nuova provetta.

Aggiungere due microlitri del primer Oligo dT 25 dalla soluzione di primer da 10 micromolari. Dal kit di trascrizione inversa, aggiungere due microlitri dell'inibitore della RNasi, otto microlitri del tampone di reazione 5x, quattro microlitri di dNTP da 10 millimolari e due microlitri della trascrittasi inversa. Impostare una reazione senza trascrittasi inversa che agisca come un controllo negativo.

Incubare la provetta a 42 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, trasferire il tubo direttamente nel ghiaccio prima di trasportarlo nel blocco riscaldante. Quindi, riscalda il tubo a 75 gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo averlo riscaldato a 75 gradi Celsius, posizionare il tubo sul ghiaccio. Trasferire due microlitri di cDNA in una provetta PCR fresca da 0,5 millilitri. Aggiungere un microlitro di primer in avanti e un microlitro di innesco in senso inverso da una soluzione di primer da 10 millimolari.

Preparare fino a 12,5 microlitri aggiungendo 8,5 microlitri di acqua priva di nucleasi e aggiungere 12,5 microlitri di 2x PCR al gel master mix. Quindi, inserire le condizioni di ciclo termico della PCR elencate sullo schermo ed eseguire la PCR. Dopo la PCR, preparare un gel di agarosio all'1% colorato con bromuro di etidio.

Sciogliere un grammo di agarosio in 100 millilitri di triacetato o tampone TAE in un pallone da 250 millilitri. Far bollire il contenuto nel microonde. Lasciare raffreddare il gel per un minuto e aggiungere 7,5 microlitri di soluzione di bromuro di etidio in una cappa aspirante.

Mescolate bene facendo roteare il pallone. Versare il contenuto in un apparecchio gel orizzontale e lasciare solidificare il gel a temperatura ambiente nella cappa aspirante per almeno 30 minuti. Coprire il gel con 1x tampone TAE e caricare 10 microlitri di prodotto PCR sul gel di agarosio insieme a tre-cinque microlitri della scala del peso molecolare del DNA.

Far funzionare il gel a 175 volt per 10 minuti. Per la prima PCR, trasferire un microlitro di cDNA in una provetta per PCR e aggiungere cinque microlitri di tampone di reazione Pfu 10x. Aggiungere un microlitro del primo primer nidificato in avanti, un microlitro del primer T7 Oligo dT 25 e un microlitro di dNTP da una soluzione da 10 millimolari.

Preparare fino a 49 microlitri di volume totale aggiungendo 40 microlitri di acqua. Aggiungere un microlitro di DNA polimerasi Pfu e mescolare bene. Quindi, eseguire la PCR.

Quindi, prepara la seconda PCR. Trasferire due microlitri di prodotti dalla prima PCR in una nuova provetta per PCR e mescolarla con cinque microlitri di 10x tampone di reazione Pfu ultra two. Aggiungere un microlitro del secondo primer PCR annidato, un microlitro del primer T7 e un microlitro di dNTP.

Aumentare il volume totale di reazione fino a 49 microlitri aggiungendo 39 microlitri di acqua e aggiungere un microlitro di Pfu DNA polimerasi. Eseguire la PCR utilizzando lo stesso profilo PCR della prima configurazione PCR. In alternativa, invece di utilizzare la DNA polimerasi Pfu, è possibile utilizzare una DNA polimerasi chimerica nelle due diverse PCR.

Prendi da cinque a dieci microlitri del secondo prodotto PCR e passalo su un gel di agarosio. Infine, visualizza il risultato su un imager. Questo gel di agarosio mostra due prodotti PCR distinti che utilizzano lo stesso primer diretto ma primer inversi diversi e un prodotto PCR distinto che ha un primer diretto e inverso distinto.

I primer ideali da utilizzare per la reazione basata sulla PCR sono quelli che forniscono un prodotto PCR distinto. I prodotti della seconda reazione PCR con la DNA polimerasi Pfu e la DNA polimerasi chimerica hanno prodotto prodotti PCR delle stesse dimensioni nonostante avessero condizioni di ciclo PCR diverse per il RACE a tre prime. I controlli negativi alla trascrittasi inversa non hanno mostrato alcuna contaminazione genomica dell'RNA utilizzato nella sintesi del cDNA e nelle successive reazioni a valle.

I prodotti PCR purificati con gel sono stati inviati per il sequenziamento. Una sequenza di Sanger rappresentativa da un cromatogramma di sequenza ha identificato la posizione del codone di stop, del segnale di poliadenilazione putativo e del sito, nonché della coda di poli A nel prodotto RACE a tre prime. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di indossare sempre indumenti protettivi e guanti.

Inoltre, utilizzare DNasi e RNasi sterili per le provette dei reagenti e altri prodotti monouso. Non dimenticare che lavorare con fenolo e cloroformio può essere estremamente pericoloso. E precauzioni come l'uso dei reagenti in una cappa e lo smaltimento del materiale in un contenitore per rifiuti designato devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.