Name: Adattamento 3 amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Impara la tecnica 3' RACE per mappare le trascrizioni mRNA nelle linee cellulari tumorali. Questo metodo identifica ORF, codoni di stop e UTR per rilevare geni di fusione specifici del tumore.

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Vorremmo riconoscere Bettine Gibbs per il suo aiuto tecnico.

Indossare un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza in ogni momento durante l'esecuzione di tutte le procedure in questo protocollo. Assicurarsi che i contenitori/provette contenenti il reagente di fenolo e guanidina isotiocianato sono aperti solo in un cappuccio certificata e smaltire i rifiuti di fenolo in un contenitore designato. Utilizzare i reagenti, i suggerimenti e privo di DNasi e RNasi provette sterili.
1. coltura cellulare
<ol><li>Crescere la linea delle cellule HeLa e due sospensioni mantello cella linee cellulari di linfoma, Granta-519 e Jeko-1, in DMEM contenente 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C. Diluire le celle 01:10 e contare utilizzando un contatore di particelle14.</li>
	<li>Per l'estrazione di RNA, piastra 500.000 cellule/pozzetto in un piatto ben 6 (media di 2 mL per pozzetto). Dopo incubazione per 24 h, raccogliere RNA dalle cellule.</li>
</ol>2. estrazione del RNA
<ol><li>Raccolta delle cellule Nota: Fatta eccezione per la fase di centrifugazione, eseguire tutti i passaggi elencati in una cappa di coltura del tessuto per mantenere la sterilità.<ol>
<li>Per cellule in sospensione (Jeko-1 e Granta-519):<ol>
<li>Trasferire le cellule (insieme con 2 mL di terreno) in una provetta da 15 mL e centrifugare a 1.725 x g per 5 min, aspirato i media e lasciare il pellet cellulare nella parte inferiore del tubo.</li>
			<li>Risospendere il pellet cellulare in 50 µ l di tampone fosfato salino (PBS): 1x. Aggiungere 500 µ l di reagente di isotiocianato di fenolo e guanidina monofasica a ciascun campione nel tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Mescolare bene e lasciare a temperatura ambiente (TA) per 5 min mentre invertendo il tubo del microcentrifuge ogni 1 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per le celle aderenti (HeLa):<ol>
<li>Aspirare il terreno di coltura delle cellule da ciascun pozzetto. Aggiungere 1 mL di PBS in ciascun pozzetto per lavare via i detriti.</li>
			<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 500 µ l di reagente di isotiocianato di fenolo e guanidina monofasica ad ogni pozzetto.</li>
			<li>Incubare per 5 minuti con dolce dondolo a RT. Trasferire in una provetta di microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lisi delle cellule<ol>
<li>Congelare il fenolo e guanidina isotiocianato miscela di cella a-20 ° C per 1 h. Nota: Il mix può essere lasciato a-20 ° C durante la notte o fino a quando necessario.</li>
		<li>Scongelare il fenolo e guanidina isotiocianato miscela di cella sul ghiaccio. Aggiungere 100 µ l di cloroformio al tubo del microcentrifuge in una cappa PCR. Vortexare il campione per 10-15 s fino a quando la miscela è rosa e opaco. Incubare il campione in ghiaccio (a 4 ° C) per 15 minuti.</li>
		<li>Centrifugare il campione per 15 min a 20.800 x g e a 4 ° C. Rimuovere con cautela la fase acquosa incolore superiore (~ 200 µ l) e il trasferimento ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Precipitazione di RNA<ol>
<li>Aggiungere un volume equivalente di isopropanolo per ogni campione. Aggiungere 1 µ l di coprecipitant (vedere Tabella materiali) per ogni campione per agire come un elemento portante per il RNA e aiutano a visualizzare il RNA nei passaggi successivi. Incubare il campione a-80 ° C per almeno 4 ore. Per risultati ottimali, incubare per una notte a-80 ° C.</li>
		<li>Trasferire il campione ad una centrifuga refrigerata. Centrifuga per 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; il RNA apparirà come un puntino blu sulla parte inferiore del tubo. Rimuovere con cautela l'isopropanolo dal campione. Aggiungere 500 µ l di etanolo di 80% e risospendere il pellet brevemente nel Vortex per 3 s.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 20.800 x g a RT per 5 min. rimuovere tutto l'etanolo dall'esempio. Lasciate che il campione asciugare all'aria per circa 10 min. Risospendere il campione in 35 µ l di acqua RNAsi-libera. Posto su un blocco di calore (65 ° C) per 5 min garantire che il RNA è completamente in soluzione e collocare immediatamente il tubo sul ghiaccio.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di RNA totale usando uno spettrofotometro come precedentemente descritto, tranne usare 1,5 µ l del campione di RNA invece di 1 µ l15. Facoltativamente, eseguire 1 µ g di RNA totale su un gel di agarosio all'1% per determinare l'integrità del RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. trattamento dnasi
<ol><li>Dopo la quantificazione del RNA, eseguire dnasi trattamento sul RNA totale di degradare qualsiasi DNA genomic. Per ogni campione, è necessario aggiungere i seguenti reagenti dal kit di dnasi RNAsi-libera per fare una reazione totale di 20 µ l della miscela in una provetta da microcentrifuga separati:<ol>
<li>Mescolare 2 µ l di dnasi 10 X tampone di reazione con 4,4 µ g di RNA totale. Portare ad un totale di 14 µ l con acqua.</li>
		<li>Aggiungere 2 µ l di dnasi RNAsi-libera. Incubare a 37 ° C per 30 min in presenza di 2 µ l di inibitore di RNAsi (dal Kit di trascrizione inversa).</li>
		<li>Aggiungere 2 µ l di soluzione bloccante e calore su un blocco di calore per 10 min a 70 ° C per inattivare l'enzima dnasi. Nota: Trattamento della dnasi è facoltativo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. sintesi del cDNA
Per un volume di reazione finale di 50 µ l:
<ol><li>Per un volume di reazione finale di 50 µ l: trasferimento 22 µ l della dnasi trattati RNA in un nuovo tubo, o trasferimento 4 µ g di RNA totale con aggiunta di acqua ad un volume totale di 22 µ l in una nuova provetta. Aggiungere 2 µ l di primer T7 oligo dT25 da 10 µM primer soluzione. La sequenza per il primer di T7 oligo dT25 è 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.</li>
	<li>Dal kit di trascrizione inversa aggiungere 2 µ l dell'inibitore di RNAsi (20 U / µ l), 8 µ l di tampone di reazione di 5x, 4 µ l di 10 mM dNTPs e 2 µ l della trascrittasi inversa (200 U / µ l). Nota: Impostare una reazione senza trascrittasi inversa ad agire come controllo negativo.</li>
	<li>Incubare a 42 ° C per 1 h. trasferimento direttamente al ghiaccio. Riscaldare il tubo a 75 ° C per 5 min e posizionare il tubo sul ghiaccio.</li>
</ol>5. ricerca primer per la trascrizione del Gene di fusione
<ol><li>
Disegno dell'iniettore
	<ol>
<li>Scarica la sequenza del cDNA dal browser genoma Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificare una regione all'interno del ORF della trascrizione destinazione (ANKHD1) a Monte del codone di arresto. Copiare e incollare l'intera regione (fino a 700 nucleotidi) che contengono le sequenze a Monte del codone di stop nella regione voce sequenza del software di progettazione primer (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>Selezionare l'opzione di design personalizzato Visualizza e selezionare 10 per il numero degli iniettori che il sistema deve generare (risultati da restituire) e lasciare tutti gli altri parametri impostati di default.</li>
		<li>Scegliere cinque primer in avanti e due iniettori d'inversione che non si sovrappongono. Ordine di primer e ricostituire con RNAsi/dnasi-libera di acqua ad una concentrazione finale di 10 µM. Maggiori dettagli circa il disegno di primer universali per la PCR sono trattate altrove16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR per identificare potenziali primer per l'utilizzo in successive 3' gara Nota: Per determinare i primer forward finali da utilizzare nella reazione, test i primer progettati impostando combinazioni diverse di forward e reverse primer per PCR regolari in una cappa PCR.<ol>
<li>Trasferire il cDNA (2 µ l) in una provetta PCR fresca 0,5 mL. Aggiungere 1 µ l di primer in avanti e 1 µ l di primer inverso (da una soluzione di primer 10 mM). Fai fino a 12,5 µ l aggiungendo 8,5 µ l di acqua priva di nucleasi. Aggiungere 12,5 µ l di 2x Gel di PCR Master Mix.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti condizioni di ciclismo termiche PCR: 95 ° C per 2 min seguita da 29 cicli di 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min. impostare il ciclo finale a 68 ° C per 7 min.</li>
		<li>Dopo la PCR, è necessario eseguire i prodotti su un gel di agarosio 1% colorato con bromuro di etidio. Dettagli dell'elettroforesi sono come precedentemente descritto con poche modifiche17.<ol>
<li>Sciogliere 1 g di agarosio in 100 mL di tampone Tris-acetato (TAE) in un pallone da 250 mL. Fate bollire in un forno a microonde.</li>
			<li>Lasciare raffreddare per 1 min e aggiungere 7,5 µ l di soluzione di bromuro di etidio (10 mg/mL di brodo) in una cappa aspirante. Miscelare bene agitando la beuta e versare in un apparato di gel orizzontale. Lasciare la RT nella cappa fumi per almeno 30 minuti consentire il gel a solidificare.</li>
			<li>Coprire il gel con 1 tampone di x TAE e caricare 10 µ l di prodotto PCR su gel di agarosio insieme a 3-5 µ l della scala di peso molecolare di DNA. Eseguire a 175 V per 10 min. visualizzare i prodotti che utilizzano un dispositivo di imaging e se è necessaria una ulteriore separazione di prodotti, eseguire il gel per altri 5-10 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selezione degli iniettori annidati per 3' gara
	<ol>
<li>Analizzare i risultati del gel dell'agarosi PCR per selezionare gli iniettori che hanno una banda PCR distinta, forte e unica. Utilizzare il primer 5'-la maggior parte (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') insieme con il primer di25 T7 oligodT nella PCR prima eseguire.</li>
		<li>Selezionare il primer nidificato che si trova a valle del primo iniettore (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') e utilizzarlo con il primer di T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') nel secondo set di reazioni di PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ottimizzazione del 3' gara per mappare il regione 3' UTR utilizzando due diversi enzimi
Nota: C'è stato un aumento nella diversità delle polimerasi del DNA usato per la PCR; Pertanto, abbiamo voluto determinare condizioni standard che possono essere applicate anche quando si utilizzano diversi enzimi per 3' reazioni di PCR di gara. Iniettori d'inversione per qualsiasi trascrizione vengono mantenuti costanti; le uniche modifiche sono nei primer forward nidificati che sono specifici per la trascrizione di destinazione.
<ol><li>
Protocollo 1:3 ' gara utilizzando una DNA polimerasi modificata da Pyrococcus furiosus (Pfu)
	<ol>
<li>Prima PCR<ol>
<li>Trasferire 1 µ l di cDNA in una provetta PCR e aggiungere 5 µ l di tampone di reazione Pfu x 10. Aggiungere 1 µ l di primo iniettore avanti nidificato, 1 µ l di primer T7 oligodT25 e 1 µ l di dNTP (da una soluzione di 10 mM).</li>
			<li>Fai fino a 49 µ l di volume totale aggiungendo 40 µ l di acqua. Aggiungere 1 µ l di Pfu DNA polimerasi e mescolare bene. Eseguire la PCR utilizzando il profilo PCR nella tabella 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Seconda PCR<ol>
<li>Trasferire 2 µ l dei prodotti di PCR prima ad un nuovo tubo PCR e mescolare con 5 µ l di tampone di reazione di Ultra II di Pfux 10. Aggiungere 1 µ l di primer PCR annidato secondo, 1 µ l di primer T7 e 1 µ l di dNTP (soluzione di 10 mM).</li>
			<li>Fai fino a 49 µ l di reazione totale aggiungendo 39 µ l di acqua. Aggiungere 1 µ l di Pfu DNA polimerasi. Eseguire la PCR utilizzando lo stesso profilo PCR come la prima installazione PCR (tabella 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocollo 2:3 ' gara utilizzando una DNA polimerasi chimerica costituito da un dominio di legame del DNA fuso a un Pyrococcus-come correzione di bozze mix master di polimerasi PCR
	<ol>
<li>Prima PCR<ol>
<li>Trasferire 1 µ l di cDNA in una provetta PCR. Aggiungere 1 µ l di primo iniettore nidificato in avanti e 1 µ l di primer T7 oligodT25 . Fai fino a 25 µ l aggiungendo 22 µ l di acqua.</li>
			<li>Aggiungere 25 µ l di Master Mix PCR: 2x e mescolare bene. Utilizzare la PCR ciclismo condizioni descritte nella tabella 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Seconda PCR<ol>
<li>Trasferire 2 µ l dei prodotti di PCR prima ad un nuovo tubo PCR. Aggiungere 1 µ l di primer PCR nidificati secondo insieme con 1 µ l di primer reverse T7.</li>
			<li>Fai fino a 25 µ l aggiungendo 22 µ l di acqua. Aggiungere 25 µ l di 2x PCR Master Mix. Eseguire la PCR utilizzando lo stesso profilo PCR come la prima installazione PCR (tabella 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. verificare il secondo prodotto PCR di 3' gara.
<ol><li>Prendere 5-10 µ l di prodotto di PCR secondo (come prodotto dal primo turno di PCRs se la trascrizione è abbondantemente espresso) ed eseguire su un gel di agarosio. Impostare il gel ed eseguire l'elettroforesi come descritto in precedenza (passaggi 5.2.3.1 a 5.2.3.3). Visualizzare i risultati su un dispositivo di imaging.</li>
</ol>8. sequenziamento e purificazione del prodotto
<ol><li>Purificare i prodotti PCR di gel dalla seconda PCR usando il Gel e sistema di Clean-Up di PCR frammento del DNA secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Eseguire Sanger sequenziamento (in alternativa, inviare il gel purificata campioni di prodotto PCR e primer di sequenziamento appropriato ad un laboratorio di sequenziamento). Analizzare i dati di sequenziamento dopo Sanger sequenziamento.</li>
	<li>Scarica il software di analisi di sequenza (Vedi Tabella materiali) e importare i file di traccia nel software. Utilizzare il QVs individuali di Base pura (valori di qualità) per ottenere la Base chiamata informazioni18. Scarica il cromatogramma con tracce di alta qualità per la visualizzazione. Facoltativo: Il gel prodotto purificato può essere clonato utilizzando un apposito kit di clonazione e i cloni isolati inviati per Sanger sequenziamento.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nonostante l'avvento delle tecnologie di sequenziamento massivo parallelo, su una base di gene di gene, 3' gara rimane ancora il metodo più facile ed economico per identificare la PAS e nucleotidi adiacenti per la coda di poli (a). L'adattamento qui descritto si espande con 3' gara per amplificare sia mappa sequenze che includono una parte di ORF, il codone di arresto e l'intero regione 3' UTR della trascrizione del mRNA di ANKHD1 . Dei principali vantaggi di 3' gara è che con pochi piccoli adattamenti, prodotti...

La formazione dell'estremità 3' è un passo fondamentale nella maturazione di mRNA che comprende il clivaggio del pre-mRNA a valle di un PAS seguita dall'aggiunta di ~ 250 tipo adenine, che compongono la coda di poli (a)1,2. La proteina legante il poli (a) (PABP) si lega alla coda di poli (a), e questo protegge la trascrizione di mRNA da degradazione e facilita la traduzione1.
Le stime attuali suggeriscono che il 70% dei geni umani hanno passaggio multiplo e quindi sono sottoposti ad poliadenilazione alternativa, con conseguente più 3' estremità3. Pertanto, è importante identificare dove la coda di poli (a) si attacca al resto del 3' UTR, nonché a identificare il PAS utilizzato da qualsiasi trascrizione dato. L'avvento di sequenziatori di ultima generazione ha provocato l'identificazione simultanea del 3' UTR e il passaggio di migliaia di geni. Questo aumento della capacità di sequenziamento ha richiesto lo sviluppo di algoritmi bioinformatici per analizzare i dati che coinvolgono poliadenilazione alternativa dell'estremità 3'. Per l'individuazione del de novo o la convalida della PAS e quindi mapping dell'estremità 3' dei singoli geni da dati di sequenziamento su larga scala, 3' gara rimane il metodo di scelta4,5. Le sequenze incluse nei prodotti di cDNA di 3' gara normalmente includono solo una parte del 3' UTR che contiene la coda di poli (a), il luogo di fenditura, la PAS e le sequenze a Monte della PAS. A differenza di PCR, che richiede la progettazione e la scelta del gene specifico primer forward e reverse, 3' gara richiede solo due primers gene nidificati specifici in avanti. Quindi, la PCR richiede una conoscenza più dettagliata della sequenza del nucleotide di una grande regione del gene di essere amplificato4,6. Dato che 3' gara utilizza lo stesso reverse primer che obiettivi il poli (a) di coda per tutte le trascrizioni di poliadenilazione RNA, solo i primer in avanti devono essere gene specifico, così, solo che richiedono la conoscenza di una regione significativamente più piccola del mRNA. In questo modo l'amplificazione delle regioni in cui le sequenze non sono completamente caratterizzato4,7. Questo ha permesso 3' gara per essere utilizzato non solo per determinare l'estremità 3' del gene, ma a anche determinare e caratterizzare grandi regioni a Monte della PAS che formano una parte significativa del 3' UTR. Combinando 5' corsa con modificate 3' gara che comprende porzioni più grandi di 3' UTR e regioni fiancheggianti, è possibile completamente di sequenza o clonare un'intero trascrizione di mRNA dall'estremità 5' alla sua 3' estremità8.
Un esempio di questa applicazione di modificate 3' gara è la recente identificazione di un romanzo di trascrizione del gene CCND1-MRCK fusione da linee cellulari di linfoma a cellule mantellari e malati di cancro. 3' UTR ha consistito di sequenze di geni MRCK sia il CCND1 ed era ricalcitrante a miRNA regolamento9. I due nidificati CCND1 avanti primers specifici erano complementari alla regione immediatamente adiacente e a valle del codone di arresto di CCND1 . Anche se l'intero trascrittoma sequenziazione insieme strumenti bioinformatici specifico può essere utilizzato per rilevare le fusioni del gene entro i 3' UTR10, molti laboratori potrebbero mancare le risorse finanziarie o perizia di bioinformatica per fare uso di questa tecnologia. Quindi, 3' gara è un'alternativa per de novo identificazione e validazione di geni di fusione romanzo che coinvolge il regione 3' UTR. Considerando il drastico aumento del numero di geni di fusione segnalati nonché a leggere attraverso le trascrizioni, 3' gara è diventata un potente strumento nella caratterizzazione genica sequenze11,12. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che diverse sequenze all'interno di 3' UTR, nonché la lunghezza del 3' UTR può influenzare la stabilità di trascrizione mRNA, la localizzazione, la traducibilità e funzione13. Dovuto in parte a un crescente interesse nella mappatura del transcriptome, c'è stato un aumento del numero di differenti polimerasi del DNA in fase di sviluppo per l'utilizzo in laboratorio. È importante determinare quali tipi di modifiche possono essere reso a 3' protocollo di gara in ordine di utilizzare il repertorio disponibile di polimerasi del DNA.
Questo lavoro rapporti adattandosi 3' gara per mappare l'intero regione 3' UTR, la PAS e il sito di clivaggio estremità 3' della trascrizione ANKHD1 utilizzando nidificati Primer all'interno della sezione di ANKHD1 della trascrizione e due diversi DNA polimerasi.

<table><tbody><tr><td>Cellule HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Linea cellulare di cancro cervicale.</td></tr><tr><td>Cellule Jeko-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Linea cellulare di linfoma mantellare.</td></tr><tr><td>Granta-519 cellule</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Linea cellulare di linfoma mantellare.</td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino Sigma</td><td>Aldrich</td><td>F6178</td><td>Siero fetale bovino per coltura cellulare.</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotico e antimicotico.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitante.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>terreni di coltura cellulare a marchio Gibco con GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion Acqua priva di DNasi e RNAsi (non trattata con DEPC).</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione tamponata con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Alcool</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Etanolo</td></tr><tr><td>Soluzione di bromuro di etidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Reagente monofasico fenolo e isotiocianato di guanidina.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&nbsp; contenente colorante di caricamento utilizzato nei saggi PCR rapidi di routine e nella ricerca di primer.</td></tr>Kit per <tr><td>il trattamento</td> della<td>DNasi senza RNasi</td><td>Promega</td><td>M6101</td></tr> <tr><td>dNTP 10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr> RQ101.<tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix con tampone HF</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix contenente una DNA polimerasi chimerica costituita da un dominio di legame del DNA fuso a una polimerasi di correzione di bozze simile a quella del pirococco e altri reagenti.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA polimerasi</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>DNA polimerasi modificata da Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa RevertAid RT</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Utilizzato per la trascrizione inversa dell'mRNA nella sintesi del cDNA. Il kit include&nbsp; Inibitore dell'RNAsi di Ribolock, trascrittasi inversa RevertAid M-MuLV e altri reagenti elencati nel manoscritto.</td></tr><tr><td>Scala 1Kb di dimensioni perfette</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Scala DNA a peso molecolare.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Utilizzato per visualizzare il gel di agarosio colorato con bromuro di etidio.</td></tr><tr><td>Scala a basso peso molecolare</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Scala del DNA a peso molecolare.</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuga</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Bagno a secco</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spettrofotometro.</td></tr><tr><td>Ampio Mini-Sub&nbsp; Cell GT Sistema di elettroforesi orizzontale</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Apparecchiatura-apparecchio per l'elettroforesi per la configurazione del gel</td></tr><tr><td>PowerPac Alimentatore di base</td><td>BioRad</td> 1645050 <td>Alimentatore per l'elettroforesi su gel.</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Gradiente Eppendorf</td><td>950000015</td><td>termociclatore PCR.</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel e PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Kit di clonazione, con One Shot&nbsp; TOP10 Cellule di E. coli chimicamente competenti</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>Stazione di preparazione MyPCR Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Cappa dedicata al lavoro di PCR.</td></tr><tr><td>Cappa Hamilton SafeAire II</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Cappa aspirante.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&nbsp; Particella&nbsp; Contatore</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Contatore di particelle. Per il conteggio delle celle prima della placcatura&nbsp; per l'estrazione dell'RNA.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (tramite ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software per analizzare i dati di sequenziamento Sanger.</td></tr></tbody></table>

adattamento 3' amplificazione veloce di cdna finisce per mappare le trascrizioni in cancro

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Maturazione degli mRNA eucariotico coinvolge 3' fine formazione, che prevede l'aggiunta di una coda di poli (a). Al fine di mappare il 3' estremità di un gene, il tradizionale metodo di scelta è 3' amplificazione veloce delle estremità del cDNA (3' gara). Protocolli per 3' gara richiedono l'attenta progettazione e selezione degli iniettori annidati all'interno di regione 3' non tradotta (3' UTR) del gene target di interesse. Tuttavia, con alcune modifiche il protocollo può essere utilizzato per includere l'intera regione 3' UTR e sequenze all'interno l'open reading frame (ORF), fornendo un quadro più completo del rapporto tra l'ORF e 3' UTR. Ciò è oltre alla identificazione del segnale poliadenilazione (PAS), così come il sito di clivaggio e poliadenilazione fornito dai convenzionali 3' gara. Espanso 3' gara in grado di rilevare insolito 3' UTR, tra cui fusioni del gene all'interno di 3' UTR, e le informazioni di sequenza possono essere utilizzate per prevedere i potenziali siti di legame di miRNA così come AU ricca destabilizzare gli elementi che possono influenzare la stabilità della trascrizione.

Ricerca nidificata Forward Primer:
Il gel di agarosio da La figura 1 Mostra due distinti prodotti di gel PCR (corsie 1 e 2) che utilizzano lo stesso forward primer ma diversi iniettori d'inversione. Lane 3 ha un prodotto PCR distinto e ha un distinto primer forward e reverse. I primer ideali da utilizzare per la reazione di PCR di base sono quelli che danno un prodotto di PCR distinto ...

I due diversi 3' amplificazione veloce delle estremità del cDNA (3' gara) protocolli descritto qui fanno uso di due diversi DNA polimerasi per mappare sequenze che includono un segmento dell'open reading frame (ORF), il codone di arresto e l'intero regione 3' UTR di una trascrizione usando RNA ottenute da linee cellulari tumorali differenti.

Adattamento 3' amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare le sequenze di trascritti di mRNA dall'estremità a tre primi alle regioni all'interno della regione codificante la proteina utilizzando primer nidificati specifici per il trascritto in due PCR successive e sequenziando i prodotti PCR purificati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo genetico, come la determinazione del segnale di poliadenilazione, il codone di stop e la sequenza della regione non tradotta a tre primi del trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata a qualsiasi trascritto se la sequenza della piccola regione del telaio di lettura aperto è L'implicazione di questa tecnica si estende verso la diagnosi del cancro, perché può rilevare geni di fusione specifici del tumore e varianti di splicing.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo identificato nuovi trascritti con regioni non tradotte a tre prim precedentemente non caratterizzate. Per iniziare il protocollo, scongelare la miscela di cellule di fenolo e guanidina isotiocianato su ghiaccio. Una volta scongelato, aggiungere 100 microlitri di cloroformio alla provetta da mi

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