Name: Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Impara a preparare vetrini rivestiti con gelatina fluorescente per analizzare la degradazione della matrice extracellulare mediata dalle invadopodia in singole cellule e gruppi cellulari. Questo metodo consente la quantificazione precisa della proteolisi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di dotazione della West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Ringraziamo Susette Mueller (Georgetown University) e Laura Kelley per la consulenza precoce e assistenza. L&#39;uso dello strumento di imaging Virginia Occidentale Microscopia University (supportato dal Babb Mary Randolph Cancer Center e, sovvenzioni NIH RR16440 P20, P30 e P30 RR032138 GM103488) è riconosciuto con gratitudine.

<ol><li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Life at the leading edge.</a> Cell. 145, 1012-1022 (2011).</li>
<li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27ins%27+and+%27outs%27+of+podosomes+and+invadopodia%3A+characteristics%2C+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li>
<li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degrading+Devices%3A+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+degradation+of+fibronectin+at+sites+of+expression+of+the+transforming+gene+product+pp60src%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src.</a> Nature. 316, 156-158 (1985).</li>
<li>Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interactions+of+cortactin+and+membrane+type+1+matrix+metalloproteinase+at+invadopodia%3A+defining+the+stages+of+invadopodia+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function.</a> Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).</li>
<li>Ayala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+inputs+converge+on+cortactin+to+control+invadopodia+biogenesis+and+extracellular+matrix+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation.</a> J. Cell Sci. , (2008).</li>
<li>Ammer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saracatinib+impairs+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+invasion+by+disrupting+invadopodia+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Sci.+Ther%22%5BJournal%5D)">Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function.</a> J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).</li>
<li>Seals, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Tks5%2FFish+is+required+for+podosome+formation+and+function%2C+and+for+the+protease-driven+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells.</a> Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+invadopodium+formation%3A+the+role+of+the+N-WASP-Arp2%2F3+complex+pathway+and+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin.</a> J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).</li>
<li>Kopp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin+KIF1C+and+microtubule+plus+ends+regulate+podosome+dynamics+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).</li>
<li>Oser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+regulates+cofilin+and+N-WASp+activities+to+control+the+stages+of+invadopodium+assembly+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation.</a> J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Src+requires+a+wild-type+counterpart+to+regulate+invadopodia+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation.</a> J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+is+not+present+in+the+focal+adhesions+formed+between+normal+cultured+fibroblasts+and+their+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).</li>
<li>Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transformation-associated+protease%28s%29+that+degrade+fibronectin+at+cell+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites.</a> J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).</li>
<li>Bharti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src-dependent+phosphorylation+of+ASAP1+regulates+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes.</a> Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).</li>
<li>Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+engagement+of+ADAM12+induces+clusters+of+invadopodia+with+localized+ectodomain+shedding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity.</a> Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).</li>
<li>Scott, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
<li>Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+membrane+proteins+mediates+cellular+invasion+by+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells.</a> J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).</li>
<li>Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+unique+methods+for+measurement+of+extracellular+matrix+degradation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro.</a> Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).</li>
<li>Baldassarre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+participates+in+focal+extracellular+matrix+degradation+by+invasive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells.</a> Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+degradation+assays+for+analyzing+local+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM degradation assays for analyzing local cell invasion.</a> Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).</li>
<li>Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+microtubules%2C+and+vimentin+intermediate+filaments+cooperate+for+elongation+of+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia.</a> J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).</li>
<li>Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+is+an+essential+regulator+of+matrix+metalloproteinase+secretion+and+extracellular+matrix+degradation+in+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia.</a> Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+signaling+pathway+mediated+by+p110alpha+regulates+invadopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation.</a> J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-bundling+protein+fascin+stabilizes+actin+in+invadopodia+and+potentiates+protrusive+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion.</a> Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+and+PIP5-kinase+Ialpha+are+required+for+invadopodia+formation+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells.</a> Cancer Sci. , (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La possibilità di visualizzare le cellule che degradano la matrice extracellulare ha aiutato a scoprire i meccanismi molecolari impiegati nelle prime fasi di invasione cellulare. Lanciato da Wen-Tien Chen nei primi anni 1980 4,14,15, rivestimento proteine ​​fluorescenti marcate extracellulari su vetrini per la successiva analisi al microscopio è emerso come la tecnica principale nella valutazione della funzione invadopodia in una vasta gamma di tipi di cellule. Il protocollo prescritto viene illustrato il met...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / strumento </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> gelatina </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td> Suini pelle </td></tr><tr><td> saccarosio </td><td> Pescatore </td><td> BP220 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto 12 millimetri </td><td> Pescatore </td><td> 50-121-5159 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre da 24 pozzetti </td><td> Pescatore </td><td> 08-772-1 </td><td> BD Falcon </td></tr><tr><td> acido nitrico </td><td> Ricca </td><td> R5326000 </td><td> Soluzione al 20% </td></tr><tr><td> poli-L-lisina </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 19320-B </td><td> 0,1% soluzione </td></tr><tr><td> glutaraldeide </td><td> Sigma </td><td> G7526 </td><td> Soluzione 8% </td></tr><tr><td&gt; Oregon verde 488-coniugato gelatina </td><td> Invitrogen </td><td> G-13186 </td><td></td></tr><tr><td> sodio boroidruro </td><td> Sigma </td><td> 213462 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pescatore </td><td> BP151 </td><td></td></tr><tr><td> rodamina-falloidina </td><td> Invitrogen </td><td> R415 </td><td></td></tr><tr><td> anti-cortactin (clone 4F11) </td><td> Millipore </td><td> 05-180 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo anti-FLAG </td><td> Millipore </td><td> MAB3118 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 di capra anti-IgG di topo </td><td> Invitrogen </td><td> A21235 </td><td></td></tr><tr><td> Prolong antifade Oro </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 microscopio confocale </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> Di dominio pubblico </td><td></td><td> <a href="http://www.macbiophotonics.ca/imagej/" target="_blank">http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</a> </td></tr><tr><td> AutoQuant X2.2 software </td><td> Media Cibernetica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS Elements </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione quantitativa della invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Invasione cellulare nei tessuti locali è un processo importante nello sviluppo e omeostasi. Invasione Malregulated e il movimento delle cellule successiva è caratteristica di molteplici processi patologici, tra cui l&#39;infiammazione, le malattie cardiovascolari e le metastasi delle cellule tumorali 1. Degradazione proteolitica focalizzata di matrice extracellulare (ECM), componenti della membrana basale epiteliale o endoteliale è un passo fondamentale nel dare inizio invasione cellulare. Nelle cellule tumorali, ampia analisi in vitro ha determinato che il degrado ECM si ottiene ventrali actina ricchi di strutture a membrana protrusione chiamati invadopodia 2,3. Forma Invadopodia in stretta apposizione della ECM, dove moderare ripartizione ECM attraverso l&#39;azione di metalloproteinasi della matrice (MMP). La capacità delle cellule tumorali di formare invadopodia correla direttamente con la capacità di invadere stroma locale e componenti associati vascolari 3. _content &quot;&gt; Visualizzazione di invadopodia-mediata degradazione ECM delle cellule mediante microscopia a fluorescenza con colorante marcati con proteine ​​della matrice rivestite su vetro coprioggetti è emerso come la tecnica più diffusa per valutare il grado di proteolisi matrice e cellulari potenziale invasivo 4,5. Qui descriviamo una versione del metodo standard per generare vetrini fluorescenza etichettati utilizzando un comune Oregon verde-488 coniugato gelatina. Questo metodo è facilmente scalata per produrre rapidamente un elevato numero di vetrini coprioggetto rivestiti. Mostriamo alcuni degli artefatti comuni microscopici che spesso si incontrano durante questa procedura e come questi possono essere evitati. Infine, si descrivono metodi standardizzati software prontamente disponibile per consentire la quantificazione della degradazione della matrice gelatinosa etichettati mediata da cellule singole e intere popolazioni cellulari. Le procedure descritte consentono di monitorare accurato e riproducibile invadopodiaattività, e può anche servire come una piattaforma per la valutazione dell&#39;efficacia di espressione della proteina modulante o prove di anti-invasivi composti sulla degradazione della matrice extracellulare in impostazioni singole e multicellulari.

Descriviamo il metodo di prototipo per la produzione di vetrini al microscopio a fluorescenza rivestite con gelatina per la visualizzazione invadopodia-mediata degradazione della matrice. Tecniche di calcolo utilizzando il software disponibile sono presentati per quantificare i livelli risultanti di proteolisi matrice di singole cellule all&#39;interno di una popolazione mista e per gruppi multicellulari che comprende interi campi microscopici.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

L'invasione cellulare nei tessuti locali è un processo fondamentale per lo sviluppo e l'omeostasi. Un'invasione mal regolata e il conseguente movimento cellulare sono...

Questa tecnica standard produce coprioggetti rivestiti di gelatina marcati fluorescentemente, adatti per saggi quantitativi di degradazione della matrice da parte degli invadopodi. Dopo aver etichettato i coprioggetti con gelatina fluorescente, si seminano le cellule e si coltivano per indurre la degradazione della matrice. Successivamente, si fissano e si colorano fluorescentemente le cellule per le proteine marcatori degli invadopodi, si acquisiscono le immagini e si quantifica la degradazione della matrice.I risultati tipici possono quantificare le differenze nella degradazione della matrice mediata dagli inve podia tra cellule con manipolazione differenziale di geni selezionati o trattate con agenti farmacologici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la preparazione di coprioggetti rivestiti di gelatina con fluorescenza omogenea è difficile da ottenere a causa di un rivestimento irregolare della gelatina fluorescente o di un maneggio improprio dei coprioggetti rivestiti di gelatina. Il procedimento sarà illustrato dall'assistente professore di ricerca Karen Martin, dall'associata postdottorato Mandy Ammer e dagli studenti universitari Elise Walk, Karen

quantitative-measurement-invadopodia-mediated-extracellular-matrix

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Modelli di invasione delle cellule tumorali in tre dimensioni della matrice extracellulare meglio riflettere...

Modellazione e imaging 3-Dimensional Invasion cella Collettiva

Questo video descrive la tecnica di utilizzo di una matrice nativa per studiare l'invasione delle cellule tumorali. La tecnica utilizzata in questo test fornisce la capacità di valutare le interazioni tra cellule epiteliali-mesenchimali in un ambiente 3D senza la necessità di una matrice sintetica o estranea.

Saggio di invasione delle cellule tumorali: un metodo 3D in vitro basato su matrice nativa per valutare le interazioni tra cellule epiteliali-mesenchimali

Questo video mostra la microscopia time-lapse quantitativa per valutare la disseminazione di Listeria monocytogenes dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare attraverso le cellule endoteliali. Un idrogel più morbido facilita una più rapida diffusione batterica attraverso le cellule endoteliali rispetto alle controparti più rigide, evidenziando l'influenza della rigidità della matrice sulla disseminazione batterica.

Microscopia quantitativa time-lapse per la valutazione della disseminazione batterica dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare

Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D.

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

Migrazione delle cellule è un fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di fisiologica, come la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie, e dei processi fisiopatologici, come il cancro. Il test di migrazione matrice 3D-collagene è uno strumento versatile per analizzare le proprietà migratorie dei diversi tipi di cellule all'interno di in un ambiente fisiologico simile a 3D.

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare continuamente i processi di adesione cellulare e de-adesione con alta risoluzione temporale in modo non invasivo per impedenza cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci rivelano le dinamiche dei processi di adesione cellulare / de-adesione innescato da modifica della matrice e la loro relazione temporale con gli eventi di segnalazione adesione-dipendente.

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

Questo protocollo descrive come preparare una matrice misti 2D, composta da gelatina e collagene I, e un collega di collagene 3D per studiare gli invasomi lineari. Questi protocolli consentono lo studio della formazione invasiva lineare, l'attività di degradazione della matrice e le capacità di invasione delle cellule primarie e delle linee cellulari del cancro.

Matrici 2D e 3D per studiare formazione e attività lineare invazienti

Molti geni sovraregolati stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali, portando a una prognosi infausta. Determinare quali geni regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è fondamentale. Questo protocollo presenta un metodo per studiare gli effetti dell'aumentata espressione di un gene sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali in tempo reale.

Misurazione quantitativa in tempo reale della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali in seguito alla trasfezione sintetica di mRNA

L'invasione è un importante fenomeno biologico nello sviluppo e nella progressione del cancro. Questo processo è influenzato dalle cellule non neoplastiche e dai componenti del microambiente tumorale. Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un metodo alternativo per analizzare l'invasione delle cellule tumorali in vitro utilizzando colture tridimensionali (3D).

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Impara a preparare vetrini rivestiti con gelatina fluorescente per analizzare la degradazione della matrice extracellulare mediata dalle invadopodia in singole cellule e gruppi cellulari. Questo metodo consente la quantificazione precisa della proteolisi.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Esplora altri video