Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Questa tecnica standard produce coprioggetti rivestiti di gelatina marcati con fluorescenza, adatti per saggi quantitativi di degradazione della matrice da parte degli invadopodi. Dopo aver etichettato i coprioggetti con gelatina fluorescente, seminare le cellule e coltivarle per indurre la degradazione della matrice. Successivamente, fissare le cellule e colorarle con marcatori fluorescenti per le proteine degli invadopodi, acquisire le immagini e quantificare la degradazione della matrice.

I risultati tipici possono quantificare le differenze nella degradazione della matrice mediata dagli inve podia tra cellule con manipolazione differenziale di geni selezionati o trattate con agenti farmacologici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la preparazione di coprivetri rivestiti di gelatina con fluorescenza omogenea è difficile da ottenere a causa di un rivestimento irregolare della gelatina fluorescente o di un maneggio inadeguato dei coprivetri rivestiti di gelatina. Il procedimento sarà illustrato dall'assistente professore di ricerca Karen Martin, dall'associata postdottorato Mandy Ammer e dalle studentesse e studenti universitari Elise Walk, Karen Hayes e Steve Markwell.

Per preparare la soluzione stock di gelatina e saccarosio al 5% non marcata, mescolare la gelatina e il saccarosio in PBS e sciogliere completamente a 37 gradi Celsius. Successivamente, conservare a quattro gradi Celsius. Procedere quindi con la pulizia delle lamelle di vetro.

Distribuire un singolo cover slip in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tessutale in plastica a 24 pozzetti, aggiungendo in ciascun pozzetto 500 microlitri di acido nitrico al 20% e incubare per 30 minuti. Dopo la rimozione della soluzione di acido nitrico, lavare i cover slip tre volte con acqua deionizzata. Successivamente rivestire.

Ogni coprioggetto con 500 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di poliolisina, lisina, e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di polilisina e lavare tre volte con PBS. Il rivestimento con polilisina di tipo L favorisce un rivestimento uniforme e il legame del gelatina marcata sovrastante. Posizionare le piastre a 24 pozzetti sul ghiaccio e aggiungere 500 microlitri di glutaraldeide allo 0,5% appena preparata a ciascuna.

Incubare bene le piastre sul ghiaccio per 15 minuti. Eseguire tre lavaggi con PBS freddo, quindi aspirare ogni traccia di PBS prima del rivestimento con gelatina. Nel frattempo, durante l'incubazione con glutaraldeide, ricostituire la gelatina coniugata con Oregon Green 488.

Secondo il protocollo del produttore, riscaldare a 37 gradi Celsius la soluzione stock di saccarosio e gelatina al 5% non marcata e la gelatina marcata. Successivamente, diluire 500 microlitri di gelatina marcata in quattro millilitri di gelatina non marcata. Pipettare 100 microlitri della miscela diluita di gelatina 488 su ciascun vetrino coprioggetto.

Utilizzare una quantità sufficiente di gelatina per ricoprire il vetrino senza spalmare manualmente. È importante mantenere la miscela diluita di gelatina 488 a 37 gradi durante la procedura di rivestimento per evitare una solidificazione prematura. Inoltre, a partire da questo passaggio, mantenere i vetrini al buio il più possibile per evitare un potenziale sbiancamento fotoindotto.

Dopo aver ricoperto tutti i vetrini in una singola piastra, inclinare la piastra e rimuovere il gelatina in eccesso da ogni pozzetto mediante aspirazione sotto vuoto. Quindi incubare i vetrini ricoperti al buio per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato i vetrini tre volte con PBS, aggiungere 500 microlitri di boroidruro di sodio, idruro di sodio, boroidruro di sodio.

L'idrure è effervescente e piccole bolle saranno visibili su e intorno a ogni coprioggetto; incubare per 15 minuti a temperatura ambiente per ridurre e inattivare il glutaraldeide residuo. Rimuovere la soluzione di boroidrato di sodio mediante aspirazione sotto vuoto con un rapido movimento circolare lungo il bordo esterno di ciascun pozzetto, facendo attenzione a non aspirare eventuali coprioggetti staccatisi dal fondo della piastra per coltura cellulare durante il trattamento con boroidrato di sodio. Dopo tre lavaggi con PBS, incubare i coprioggetti in etanolo al 70% per 30 minuti a temperatura ambiente.

Utilizzando una tecnica sterile, trasferire la piastrina contenente le piastre in una cappa a flusso laminare di tipo due per colture cellulari B e risciacquare la piastrina tre volte con PBS sterile mediante un ago sterile e pinzette. Trasferire con attenzione le piastrine in una nuova piastra a 24 pozzetti vuota per l'equilibrazione. Le piastrine devono essere equilibrate con il mezzo di coltura specifico per il tipo cellulare in esame.

Ora seminare le cellule direttamente sui coverslip dopo un tempo di incubazione appropriato. Processare i campioni per l'immunofluorescenza al fine di montarli. Applicare una goccia di prolungato oro anti-fade o di un reagente simile su un vetrino e posizionare con attenzione il coverslip capovolto, quindi acquisire le immagini per l'analisi.

Questa analisi fornisce l'area normalizzata di degradazione della matrice in relazione all'area delle cellule o al numero di cellule. È utile per analizzare interi campi microscopici in cui sono presenti molteplici cellule trattate collettivamente con fattori di crescita irna o agenti terapeutici. Per questa analisi, si raccolgono immagini a ingrandimento inferiore, sufficiente per acquisire in modo efficiente informazioni sulle popolazioni cellulari.

Aprire l'immagine in ImageJ. Verificare le informazioni sulla scala e selezionare le misurazioni. Scegliere l'area e impostare le opzioni di soglia. Calcolare l'area di degradazione utilizzando l'immagine della gelatina fluorescente, correggendo l'illuminazione non uniforme sulla gelatina sottraendo la soglia del fondo, e impostare i valori di intensità dei pixel superiore e inferiore nell'immagine.

Nelle immagini successive, utilizzare il pulsante impostazione nella finestra della soglia per applicare la stessa soglia a tutte le immagini come metodo oggettivo per selezionare l'area di degradazione. Utilizzare la funzione analisi delle particelle per misurare la soglia nelle aree di degradazione della matrice.

Scegliere una dimensione delle particelle maggiore di zero per rimuovere il rumore dalla selezione. Mostrare i contorni per identificare le regioni di interesse. Quindi selezionare visualizza risultati e riepilogo per mostrare le misurazioni, se il disegno ha delimitato in modo specifico tutte le aree di degrado.

Copiare la misurazione dell'area totale in un foglio di calcolo; se sono stati selezionati altri oggetti, come detriti, registrare soltanto le aree delle regioni di interesse rilevanti. Successivamente, per calcolare l'area cellulare, aprire il file e applicare la soglia all'immagine colorata regolando i valori di intensità dei pixel superiore e inferiore in modo che i bordi delle cellule vengano selezionati nelle immagini successive. Utilizzare il pulsante "Imposta" nella finestra della soglia per applicare la stessa soglia a tutte le immagini.

Come metodo oggettivo per selezionare l'area cellulare. Utilizzare la funzione "analisi delle particelle" per misurare la soglia dell'area delle cellule. Scegliere una dimensione delle particelle maggiore di zero per eliminare il rumore dalla selezione.

Mostrare i contorni per identificare le regioni da analizzare, verificare i risultati visualizzati e riassumere per mostrare le misurazioni delle aree. Non selezionare. Includere i fori se sono presenti spazi tra le cellule e un aggregato.

Ora scegliere. Copiare i risultati delle aree per le regioni di interesse rilevanti in un foglio di calcolo e calcolare l'area di degradazione della gelatina per l'area totale delle cellule. Un approccio alternativo consiste nel normalizzare l'area di degradazione al numero di cellule, determinato contando i nuclei colorati con DAP e.

Questo è importante se le manipolazioni alterano l'area media della cellula. Per questo approccio, utilizzare il plugin di conteggio dei nuclei per contare automaticamente i nuclei. Regolare le opzioni per ottimizzare le immagini. Se i nuclei si sovrappongono in modo esteso, il conteggio automatico potrebbe non fornire un'enumerazione accurata in questo caso.

Il conteggio manuale può essere facilitato mediante l'utilizzo del plugin per il conteggio delle cellule se eseguito correttamente. Le lamelle sono ricoperte uniformemente con gelatina coniugata con Oregon Green 488. Diversi artefatti possono verificarsi durante il rivestimento e la lavorazione delle lamelle ricoperte di gelatina.

Ad esempio, un rivestimento irregolare è causato da una copertura inadeguata del vetrino durante il processo di rivestimento, dovuta a una miscelazione insufficiente, alla stesura manuale o alla solidificazione parziale della miscela di gelatina. I graffi indicano la rimozione della matrice rivestita mediante incisione con aghi o pinze durante la manipolazione. L'essiccazione della superficie del vetrino durante periodi prolungati di conservazione può provocare un aspetto a selciato. Quest'area riflette lo sbiancamento fotochimico della superficie fluorescente di gelatina durante l'acquisizione delle immagini, causato da un'esposizione prolungata o da una luce di elevata intensità.

Si noti come un'ampolla ben preparata presenti una fluorescenza omogenea quando osservata al microscopio. Le matrici sottili ottenute durante questa procedura forniscono un metodo sensibile per valutare la capacità delle cellule di degradare la matrice extracellulare. Ad esempio.

Queste immagini mostrano l'attività di degradazione della matrice del podio invasa da una cellula tumorale del carcinoma della testa e del collo OSC 19. Le cellule sono state seminate su un'ampolla di copertura in gelatina coniugata con Oregon Green 488 e analizzate mediante microscopia fluorescente, come mostrato nelle immagini 2D e 3D. Le cellule OSC 19 seminate su ampolle di copertura in gelatina coniugata con Oregon Green 488 sono state marcate con fitina coniugata a R domine e con anticorpi anti cort actina, visualizzati mediante un anticorpo secondario ANOR 647 e colorate artificialmente in verde per evidenziare l'invasione.

I podi sono evidenti nell'immagine sovrapposta come concentrazioni focali citoplasmatiche di actina F e cortanina che si sovrappongono alle aree di rimozione della gelatina. La visualizzazione mostra come i podi invasivi penetrino nel sottovolume ECMA, creato per evidenziare un margine all'interno della cellula in cui sono presenti i podi invasivi. La vista del margine dorsale dimostra i podi invasivi inseriti nella gelatina sottostante.

La vista del margine ventrale mostra protrusioni nei podia di Veda e aree di degradazione della gelatina al di sotto del coprioggetto come regioni rosse presenti sulla matrice verde. Queste immagini mostrano alcuni dei passaggi importanti per la quantificazione della degradazione normalizzata della matrice di gelatina da parte delle cellule all'interno di un'intera immagine microscopica. Tutte le immagini fluorescenti sono state convertite in scala di grigi per visualizzare meglio la soglia rossa e le delimitazioni delle regioni di interesse.

Questa immagine di gelatina coniugata con Oregon Green 488 mostra le aree scure in cui è avvenuta la degradazione. Mediante la sogliatura, l'immagine della gelatina evidenzia le aree di degradazione, a partire dalle quali vengono misurate le regioni di interesse selezionate in base all'estensione della degradazione. Questa immagine mostra la rumina, il foid e la colorazione dell'actina F, come previsto.

La soglia nell'immagine dell'actina evidenzia l'area totale della cellula da cui vengono selezionate le aree cellulari da misurare. Analogamente, la tecnica può essere applicata per analizzare immagini di nuclei cellulari colorati con DAPI. Questo pannello illustra alcuni passaggi chiave coinvolti nella quantificazione della degradazione della gelatina fluorescente da parte di singole cellule all'interno di una popolazione cellulare mista.

Questa semplice quantificazione riguarda una singola cellula OSC 19 transfettata che sovraesprime la cortactina ricombinante fusa al marcatore epitopico flag. Si noti come la degradazione della matrice da parte delle cellule transfettate possa essere analizzata anche all'interno di una popolazione mista di cellule transfettate e non transfettate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare diverse cose.

Prima di tutto, assicurarsi che i marcatori fluorescenti delle cellule non si sovrappongano al colore della gelatina fluorescente. Durante l'acquisizione delle immagini, è importante scegliere i campi in base alla presenza di cellule. Non cercare preferenzialmente aree di degradazione, poiché ciò potrebbe introdurre un bias nei dati a causa della variabilità tra linee cellulari e delle risposte a diversi agenti terapeutici.

Fattori come il numero di sedi e il tempo di degradazione, nonché la scelta della proteina per l'etichettatura immunofluorescente, devono essere ottimizzati in base al particolare esperimento. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare coprioggetti uniformemente rivestiti con gelatina fluorescente per saggi di degradazione mediata da beta podia, nonché dei metodi per la quantificazione della degradazione della matrice.