Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Lo scopo di questa procedura è quello di visualizzare le risposte delle cellule immunitarie alle tossine batteriche. In primo luogo, la tossina viene espressa e purificata da celle d'oro BL 21. Una volta confermata l'attività e la concentrazione della tossina, la tossina viene consegnata alle cellule immunitarie.

Utilizzando un micro iniettore e la microscopia su cellule vive ad alta velocità, viene eseguita. L'analisi delle immagini risultanti rivela la cinetica in tempo reale delle risposte delle cellule immunitarie alla tossina. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come il meccanismo di attivazione dell'inflammasoma.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle risposte delle cellule immunitarie mediate dalle tossine, può essere applicato anche ad altri stimoli, compresi i trattori chemiotattici. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta studiando l'interazione dei batteri con le cellule immunitarie in coltura e osservando interazioni altamente variabili tra i batteri e le cellule immunitarie. Iniziare la purificazione della streptolisina O o SLO con una coltura di cellule d'oro BL 21 contenenti PAG tre SLO.

Il suo plasmide è cresciuto fino a un OD di circa 0,6. Per indurre l'espressione proteica, aggiungere cinque millilitri del 20% di OS alla coltura e agitare a 2 25 giri/min a temperatura ambiente per tre ore. Quindi, trasferisci i batteri in una bottiglia da centrifuga da 500 millilitri.

Quindi centrifugare la coltura a 12.000 volte G per 12 minuti a quattro gradi Celsius dopo la centrifuga. Il supinato immagazzina il pellet a meno 80 gradi Celsius durante la notte o più a lungo se necessario. Per purificare lo SLO espresso, aggiungere 10 millilitri di tampone di lavaggio ly integrato con lisozima Triton X 100 e fenil metilsulfuril fluoruro alla pipetta di pellet congelata su e giù per circa 15 minuti.

Per Resus, sospendere il pellet mantenendo il campione sul ghiaccio. Trasferire il pellet risospeso in un tubo di polipropilene a fondo tondo di quercia da 50 millilitri. Sonicare il lisato utilizzando una sonda sonicare al 40% di uscita cinque volte per 30 secondi ciascuna a intervalli di 30 secondi con 30 secondi sul ghiaccio tra l'uno e l'altro.

Quindi far girare il lisato sonicato a 39.000 volte G per 20 minuti di quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, aggiungere il supinato batterico a un millilitro di nichel NTA aros lavato. Incubare l'aros di nichel NTA e il lisato insieme per 2,5 ore a quattro gradi Celsius agitando delicatamente Dopo l'incubazione.

Pellettare le perline girando a 400 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Si noti che tutti gli ulteriori lavaggi e l'eluizione vengono eseguiti con queste impostazioni di centrifugazione e meno diversamente indicato. Dopo la centrifugazione.

Combina 30 microlitri di supinato con 10 microlitri di tampone per campioni SDS quattro volte in una provetta per microcentrifuga e conservalo sul ghiaccio per l'analisi della purezza. Quindi scartare il resto dell'agente supino e lavare le perle quattro volte in un tampone per il lavaggio dei pidocchi. E una volta che si è interessati la centrifugazione del tampone salino tra ogni lavaggio Da questo punto in poi, assicurarsi di mantenere sempre il campione in ghiaccio.

La SLO è una proteina molto sensibile ai redox e perde rapidamente la sua attività se riscaldata fino a 37 gradi centigradi, anche se per un breve periodo di tempo. Per eluire la proteina SLO, aggiungere un millilitro di tampone di eluizione e cinque microlitri di DTT molare alle microsfere, incubare su ghiaccio per 10 minuti. Quindi centrifugare e raccogliere il supinato in una provetta fuge etichettata con il numero eluciano.

Ripetere questo processo tre volte, quindi per esaurire l'endotossina dalla proteina SLO, aggiungere 200 microlitri di perle agro coniugate di polietilene lavate, sospendere il tampone di sale res al campione e agitare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Quindi centrifugare a 10.000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, raccogliere il surnatante in nuove provette da microcentrifuga etichettate.

Combinare 30 microlitri di ciascuna eluizione con 10 microlitri, quattro volte il tampone per campioni SDS. Per l'analisi delle pagine SDS, archiviare le soluzioni SLO su ice. Determinare le concentrazioni proteiche e l'attività emolitica se soddisfacenti, estrarre lo SLOE in quat da cinque a 10 microlitri, quindi congelare su ghiaccio secco e conservare a meno 80 gradi Celsius.

Quindi determinare la lisi specifica. Reese. Sospendere due volte le celle da testare. Centrare le sei cellule per millilitro nel tampone RB con 20 microgrammi per millilitro.

Ioduro di propidio. Qui vengono testate le cellule T 27 A. Aggiungere 100 microlitri di cellule a ciascun pozzetto di una piastra inferiore a V da 96 pozzetti in provette per microcentrifuga separate.

Diluire in serie SLO a due volte la concentrazione finale nel tampone rb. Quindi aggiungere 100 microlitri di tossina o 100 microlitri di tampone RB alle cellule e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Le concentrazioni finali tipiche variano da 2000 unità per millilitro a 31,25 unità per millilitro.

Esegui le cellule su un citometro a flusso e raccogli i dati con filtri per fi, cetrina o pe. Uno spostamento di un log rappresenta le celle transitoriamente permeabili, mentre uno spostamento di tre log indica le celle morte. Calcolare la lisi specifica delle cellule sottraendo la percentuale di cellule morte nel controllo dall'esperimento utilizzando l'equazione mostrata qui un giorno prima della piastra degli esperimenti, due volte centrare i cinque macrofagi su un vetro rivestito di collagene.

Piatti inferiori da 35 millimetri. Il microscopio utilizzato per la somministrazione delle tossine deve essere dotato di uno stadio invertito, di uno stadio riscaldato, di cubi con filtro di emissione di eccitazione appropriati e, se disponibile, di una lente di Bertand. La parte più difficile di questa procedura è portare l'ago intatto fino alle cellule.

Per garantire il successo, utilizziamo una lente Bertrand, che viene normalmente utilizzata per l'allineamento, per visualizzare l'ago mentre lo portiamo attraverso i piani focali. Il microscopio deve essere collegato a un micro iniettore e deve essere controllato da un computer con memoria sufficiente per raccogliere e memorizzare i dati, accendere il microscopio e il micro iniettore e lasciare che il tempo del tavolino riscaldato si riscaldi a 37 gradi Celsius in attesa che il tavolino si riscaldi. Etichettare le celle per 30 minuti con colorante a 37 gradi Celsius.

A seconda del test, l'etichettatura può essere eseguita con cinque microlitri, quattro o 2:00 AM in un millilitro, HBSS o due microlitri di calcio am in un millilitro di terreno pieno, qui vengono utilizzati quattro o due. Rimuovere il terreno cellulare e lavare le cellule una volta con PBS. Aspirare il PBS e sostituirlo con un millilitro di RPMI integrato con due millimoli di cloruro di calcio.

Monta la parabola sul microscopio, metti a fuoco le cellule con il campo chiaro, quindi regola per mettere a fuoco leggermente sopra le cellule. Quindi, combina un microlitro di tossina SLO quattro microlitri, 10 milligrammi per millilitro, DEXTRA 5 55 e sei microlitri di acqua. Quindi centrifugare 20.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Il destrano viene utilizzato per verificare che la punta del femto non sia ostruita. Utilizzare un micro caricatore per caricare due microlitri di tossina diluita nella punta del femto dalla parte posteriore. Caricare la punta del femto sul microiniettore.

Quindi regolare l'angolo dell'iniettore in modo che la punta si trovi sopra il centro delle celle con spazio per muoversi in tutte le direzioni, deselezionare le impostazioni precedenti per il limite Z che limita il livello di abbassamento della punta del micro iniettore. Impostare il micro iniettore in modo che inietti per 0,5 secondi a 120 PSI con una contropressione di 20 PSI. Quindi abbassare la punta fino a quando non entra nel mezzo.

Utilizzando la lente Bertrand. Centrare la punta e seguire la punta man mano che viene abbassata più vicino alle celle. Una volta che l'ago esce dalla messa a fuoco, torna all'ottica normale.

L'ombra dell'ago dovrebbe essere evidente sul campo. Metti a fuoco sopra le cellule e abbassa l'ago finché non è a fuoco. Quindi metti a fuoco le cellule e porta con cura l'ago adiacente a una cellula.

Dopo aver impostato il limite Z per l'iniezione, iniziare l'imaging e iniettare la tossina. Quindi solleva l'ago e spostati in una nuova regione di cellule. Iniettare altra tossina e continuare l'imaging dopo l'iniezione.

Spostare l'ago nella posizione iniziale per evitare perdite indesiderate di tossine dall'ago utilizzando il metodo descritto in questo video, da 10 a sette, da 10 a otto unità per millilitro. Lo SLO si ottiene tipicamente con una concentrazione proteica di quattro milligrammi per millilitro. Questo gel della pagina SDS mostra i campioni batterici prima e dopo lo stato di induzione della tossina dopo la purificazione, e ciascuna delle tre colorazioni blu kamasi ellucians rivela che lo SLO indotto è stato purificato con successo.

SLO è la banda a 69 kilodalton per determinare la quantità di tossina necessaria per la lisi di due cellule T 27 A o D. Le cellule sono state sottoposte a varie concentrazioni di SLO per cinque minuti a 37 gradi Celsius in presenza di ioduro di propidio ed esaminate mediante citometria a flusso. La lisi specifica è stata determinata come dimostrato come mostrato qui.

250 unità per millilitro. SLO fornisce il 50% di lisi di entrambe le cellule T 27 A e D due. Una dose di lisi sublitica del 10% di tossina sarebbe di 62,5 unità per millilitro.

Questi valori sono importanti per l'attività della tossina di riferimento per valutare la morte cellulare in seguito all'esposizione alla tossina. I fibroblasti dermici umani sono stati incubati con calcio e aterio omodimero utilizzando un kit vivo morto di Life Technologies. A seguito di esposizione localizzata alla tossina batterica, l'antro lisina O.In questa immagine, il calcio è mostrato in verde e il bromuro di aterio nelle regioni rosse vicine al microbioma, mostrano la morte cellulare caratterizzata dalla perdita di calcio e dall'assorbimento dell'omodimero, mentre le regioni più lontane dalla punta non mostreranno danni.

La micro-somministrazione della tossina consente anche l'esame di eventi in tempo reale come il flusso di calcio. Questi dc umani caricati con 4:02 AM sono stati esposti a SLO a una velocità di flusso costante con simultaneo spostamento di immagini dal vivo dal verde al blu. Lo pseudo colore indica un aumento dei livelli di calcio citosolico.

SLO induce un rapido aumento del calcio citosolico, che si propaga attraverso la regione della piastra a causa della consegna localizzata. Tuttavia, solo le cellule vicine alla punta del micro iniettore incontrano la tossina del reattore. Ciò dimostra sia una reazione cellulare alla tossina che l'area spazialmente ristretta di rilascio della tossina per risolvere gli eventi nella dimensione zdi.

La micro-somministrazione è stata combinata con la microscopia confocale 3D ad alta velocità. Questa serie di immagini mostra le cellule dendritiche dopo l'iniezione di tossine. Sono stati pre-incubati con anti CD 11 C coniugato a un PC mostrato in verde per etichettare la membrana plasmatica.

Come si può vedere qui, le microvescicole vengono rilasciate dopo la somministrazione di tossine. Come parte del processo di riparazione cellulare, le molecole di tossina sono concentrate sulle bolle, che vengono eliminate per eliminare la tossina. Una volta padroneggiata, la microscopia può essere eseguita in 45 minuti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la tossina fredda prima di mescolarla con le cellule e di testare l'attività emolitica. Buono. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la cinetica in tempo reale delle risposte delle cellule immunitarie alle tossine batteriche utilizzando la microscopia cellulare viva.