Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Lo scopo di questa procedura è visualizzare le risposte delle cellule immunitarie alle tossine batteriche. In primo luogo, la tossina viene espressa e purificata da cellule BL 21 gold. Una volta confermata l'attività e la concentrazione della tossina, quest'ultima viene somministrata alle cellule immunitarie.

Viene eseguita un'iniezione microscopica e una microscopia in tempo reale su cellule vive ad alta velocità. L'analisi delle immagini ottenute rivela la cinetica in tempo reale delle risposte delle cellule immunitarie alla tossina. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come il meccanismo di attivazione dell'inflammasoma.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle risposte delle cellule immunitarie mediate da tossine, può essere applicato anche ad altri stimoli, inclusi gli agenti chemiotattici. Abbiamo concepito per la prima volta questo metodo studiando l'interazione tra batteri e cellule immunitarie coltivate, osservando interazioni altamente variabili tra i batteri e le cellule immunitarie. Iniziare la purificazione della streptolisina O o SLO con una coltura di cellule BL 21 gold contenenti PAG tre SLO.

Il suo plasmide coltivato fino a un OD di circa 0,6. Per indurre l'espressione proteica, aggiungere cinque millilitri di 20% di OSes alla coltura e agitare a 225 giri al minuto a temperatura ambiente per tre ore. Successivamente, trasferire i batteri in un bocciale da centrifuga da 500 millilitri.

Quindi centrifugare la coltura a 12.000 ×g per 12 minuti a 4 gradi Celsius; dopo la centrifugazione, decantare. Conservare il pellet supinato a meno 80 gradi Celsius durante la notte o più a lungo, se necessario. Per purificare la SLO espressa, aggiungere 10 millilitri di buffer di lavaggio lisozima, integrato con Triton X-100, lisozima e fluoruro di fenilmetilsulfonile, al pellet congelato, quindi pipettare su e giù per circa 15 minuti.

Per la risospensione, risospendere il pellet mantenendo il campione sul ghiaccio. Trasferire il pellet risospeso in un tubo rotondo in polipropilene da 50 millilitri di tipo Oak Ridge. Sonicare il lisato utilizzando un sonicator a sonda al 40% di potenza, per cinque volte, 30 secondi ciascuna, con intervalli di 30 secondi e 30 secondi sul ghiaccio tra un ciclo e l'altro.

Quindi centrifugare il lisato sonicato a 39.000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aggiungere il sopranatante batterico a un millilitro di nickel NTA agarosio lavato. Incubare l'agarosio al nickel NTA e il lisato insieme per 2,5 ore a quattro gradi Celsius con agitazione delicata dopo l'incubazione.

Centrifugare le perle a 400 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Si noti che tutti i successivi lavaggi e l'eluizione vengono eseguiti con queste condizioni di centrifugazione, salvo diversamente indicato. Dopo la centrifugazione.

Combinare 30 microlitri del sopranatante con 10 microlitri di buffer campione SDS 4× in una provetta da microcentrifuga e conservare in ghiaccio per l'analisi della purezza. Successivamente, scartare il resto del sopranatante e lavare le perline quattro volte con buffer di lavaggio per pidocchi, e una volta con buffer salino di interesse, centrifugando tra ogni lavaggio. Da questo momento in poi, assicurarsi di mantenere il campione sempre in ghiaccio.

SLO è una proteina molto sensibile al redox e perderà rapidamente la sua attività se riscaldata a 37 gradi centigradi, anche solo per un breve periodo di tempo. Per eluire la proteina SLO, aggiungere un millilitro di buffer di eluizione e cinque microlitri di DTT uno molare alle perle, incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi centrifugare e raccogliere il sopernatante in un tubo da centrifuga etichettato con il numero di eluizione.

Ripetere questo processo tre volte, quindi per rimuovere l'endotossina dalla proteina SLO, aggiungere 200 microlitri di poli aggregati coniugati con perle di agaro lavate, sospesi in tampone res salino, al campione e agitare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, centrifugare a 10.000 ×g per un minuto a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, raccogliere il sopranatante in nuove provette microcentrifuga etichettate.

Combinare 30 microlitri di ogni eluato con 10 microlitri di buffer campione SDS quattro volte. Per l'analisi SDS-PAGE, mantenere le soluzioni di SLO sul ghiaccio. Determinare le concentrazioni proteiche e l'attività emolitica; se soddisfacenti, raccogliere l'SLOE in aliquote da cinque a 10 microlitri, quindi congelare su ghiaccio secco e conservare a meno 80 gradi Celsius.

Quindi determinare il tasso di lisi specifico. Reese. Sospendere le cellule da testare a due volte. Centrifugare sei cellule per millilitro nel buffer RB con 20 microgrammi per millilitro.

Ioduro di propidio. In questo caso vengono testate le cellule T 27 A. Aggiungere 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a fondo a V da 96 pozzetti in provette microcentrifuga separate.

Diluire in modo seriale SLO a due volte la concentrazione finale nel tampone rb. Quindi aggiungere 100 microlitri di tossina oppure 100 microlitri di tampone RB alle cellule e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Le concentrazioni finali tipiche variano da 2000 unità per millilitro a 31,25 unità per millilitro.

Eseguire le cellule su un citometro a flusso e raccogliere i dati con filtri per fi, cethrin o pe. Uno spostamento di un log rappresenta cellule transitoriamente permeabili, mentre uno spostamento di tre log indica cellule morte. Calcolare il lisi specifico delle cellule sottraendo la percentuale di cellule morte nel controllo da quella sperimentale utilizzando l'equazione mostrata qui un giorno prima della piastratura degli esperimenti, centrando due volte i cinque macrofagi su vetro rivestito di collagene.

Piastre da 35 millimetri inferiori. Il microscopio utilizzato per il rilascio della tossina dovrebbe essere dotato di una configurazione a campo inverso, un palchetto riscaldato, i cubi filtro di eccitazione e emissione appropriati e, se disponibile, una lente bertrand. La parte più difficile di questa procedura consiste nel portare intatta l'ago fino alle cellule.

Per garantire il successo, utilizziamo una lente di Bertrand, normalmente impiegata per l'allineamento, al fine di visualizzare l'ago mentre lo portiamo attraverso i piani focali. Il microscopio deve essere collegato a un microiniettore ed essere controllato da un computer dotato di memoria sufficiente per raccogliere e archiviare i dati, accendere il microscopio e il microiniettore e consentire al palco riscaldato di raggiungere la temperatura di 37 gradi Celsius durante l'attesa del riscaldamento. Etichettare le cellule con il colorante per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

A seconda del saggio, la marcatura può essere eseguita con cinque microlitri, quattro o 2:00 del mattino in un millilitro di HBSS oppure due microlitri di calcio am in un millilitro di mezzo completo; qui vengono utilizzati quattro o due. Rimuovere il mezzo cellulare e lavare le cellule una volta con PBS. Aspirare il PBS e sostituirlo con un millilitro di RPMI integrato con due millimolari di cloruro di calcio.

Montare la piastra sul microscopio, mettere a fuoco le cellule in campo chiaro, quindi regolare il fuoco leggermente al di sopra delle cellule. Successivamente, combinare un microlitro di tossina SLO con quattro microlitri di DEXTRA 5 55 a 10 milligrammi per millilitro e sei microlitri di acqua. Quindi centrifugare a 20.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Il dextrano viene utilizzato per verificare che la punta femto non sia ostruita. Utilizzare un microcaricatore per caricare due microlitri di tossina diluita all'interno della punta femto dal retro. Montare la punta femto sull'iniettore micro.

Quindi regolare l'angolo dell'injector in modo che la punta si posizioni al centro delle cellule con spazio sufficiente per muoversi in tutte le direzioni; cancellare le impostazioni precedenti del limite Z, che limita quanto in basso può arrivare la punta del microinjector. Impostare il microinjector per iniettare per 0,5 secondi a 120 PSI con una pressione di ritorno di 20 PSI. Quindi abbassare la punta finché non entra nel mezzo.

Utilizzando la lente di Bertrand. Centrare la punta e seguire la punta mentre viene abbassata avvicinandola alle cellule. Una volta che l'ago esce dal fuoco, tornare all'ottica normale.

L'ombra dell'ago dovrebbe essere visibile nel campo. Mettere a fuoco al di sopra delle cellule e abbassare l'ago fino a quando non entra a fuoco. Successivamente, mettere a fuoco le cellule e avvicinare con attenzione l'ago a una cellula.

Dopo aver impostato il limite Z per l'iniezione, iniziare l'acquisizione delle immagini e iniettare la tossina. Quindi sollevare l'ago e spostarsi in una nuova regione di cellule. Iniettare ulteriore tossina e continuare l'acquisizione delle immagini dopo l'iniezione.

Spostare l'ago nella posizione iniziale per prevenire qualsiasi fuoriuscita indesiderata di tossina dall'ago utilizzando il metodo descritto in questo video, da 10 alla settima a 10 alla ottava unità per millilitro. L'SLO viene tipicamente ottenuto con una concentrazione proteica di quattro milligrammi per millilitro. Questa gel di elettroforesi SDS-PAGE mostra campioni batterici prima e dopo l'induzione della tossina a seguito della purificazione, e ciascuna delle tre colorazioni con blu di Coomassie rivela che l'SLO indotto è stato purificato con successo.

SLO è la banda a 69 chilodalton utilizzata per determinare la quantità di tossina necessaria per la lisi delle cellule T 27 A o D due. Le cellule sono state esposte a diverse concentrazioni di SLO per cinque minuti a 37 gradi Celsius in presenza di ioduro di propidio ed esaminate mediante citometria a flusso. La lisi specifica è stata determinata come illustrato qui.

250 unità per millilitro. SLO determina una lisi al 50% sia delle cellule T 27 A che delle cellule D. Una dose sottolitica del 10% di tossina sarebbe di 62,5 unità per millilitro.

Questi valori sono importanti per stabilire un parametro di riferimento dell'attività tossica al fine di valutare la morte cellulare in seguito all'esposizione al tossina. Fibroblasti dermici umani sono stati incubati con calcio e omodimero di atherium utilizzando un kit live/dead fornito da Life Technologies. Dopo un'esposizione localizzata alla tossina batterica, anthro lisina O. In questa immagine, il calcio è mostrato in verde e il bromuro di atherium in rosso; le regioni vicine al microbioma mostrano morte cellulare caratterizzata dalla perdita di calcio e dall'assorbimento dell'omodimero di athe, mentre le regioni più distanti dalla punta non mostreranno alcun danno.

La microerogazione della tossina consente anche l'esame di eventi in tempo reale, come il flusso di calcio. Queste cellule dendritiche umane caricate con 4:02 AM sono state esposte a SLO a un flusso costante, con contemporanea acquisizione in tempo reale che mostra un passaggio dal verde al blu. Il colore falso indica un aumento dei livelli di calcio citosolico.

SLO induce un rapido aumento del calcio citosolico, che si propaga attraverso la regione della piastra a causa della somministrazione localizzata. Tuttavia, solo le cellule vicine alla punta del microinjector incontrano e reagiscono alla tossina. Questo dimostra sia la reazione cellulare alla tossina sia l'area spazialmente ristretta di somministrazione della tossina necessaria per risolvere gli eventi nella dimensione zdi.

La microerogazione è stata combinata con microscopia confocale 3D ad alta velocità. Questo insieme di immagini mostra cellule dendritiche dopo l'iniezione della tossina. Erano state pre-incubate con anticorpi anti-CD11c coniugati a un PC mostrato in verde per etichettare la membrana plasmatica.

Come si può vedere qui, le microvescicole vengono rilasciate a seguito della somministrazione della tossina. Come parte del processo di riparazione cellulare, le molecole di tossina si concentrano sui bleb, che vengono espulsi per eliminare la tossina. Una volta preparato, il campione può essere analizzato al microscopio in 45 minuti.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere il tossina fredda prima di mescolarla con le cellule e di verificare l'attività emolitica. Bene. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare la cinetica in tempo reale delle risposte delle cellule immunitarie alle tossine batteriche utilizzando la microscopia su cellule vive.