Imaging dei cambiamenti morfologici nei batteri utilizzando la microscopia a fluorescenza a cellule vive

Inizia con una coltura batterica immobilizzata sotto una lastra di agarosio in una teglia con fondo di vetro.

Le membrane cellulari batteriche sono marcate con un colorante fluorescente.

I batteri sono inoltre progettati per esprimere un RNA antisenso che prende di mira uno specifico mRNA, inibendo la produzione di una proteina essenziale della divisione cellulare.

Aggiungi una goccia di olio a immersione all'obiettivo del microscopio a fluorescenza invertita.

Metti il piatto in un alloggiamento metallico e fissalo sul palco del microscopio.

Alza l'obiettivo finché l'olio non tocca il piatto, poi concentrati sulle cellule.

Usa software di imaging per impostare le pile Z e catturare immagini a più profondità.

Inizia ad acquisire immagini in time-lapse a fluorescenza.

Man mano che le cellule rispondono all'espressione dell'RNA antisenso, non riescono a dividersi e sviluppano forme gonfie.

L'organizzazione della membrana viene disturbata, causando fluorescenza irregolare e focale che indica una divisione cellulare difettosa.

Per visualizzare il campione, si utilizza la manopola di messa a fuoco di regolazione grossolana per assicurarsi che l'obiettivo sia completamente abbassato prima di inizia