Imaging dei cambiamenti morfologici nei batteri utilizzando la microscopia a fluorescenza a cellule vive

Inizia con una coltura batterica immobilizzata sotto una lastra di agarosio in una teglia con fondo di vetro.

Le membrane cellulari batteriche sono marcate con un colorante fluorescente.

I batteri sono inoltre progettati per esprimere un RNA antisenso che prende di mira uno specifico mRNA, inibendo la produzione di una proteina essenziale della divisione cellulare.

Aggiungi una goccia di olio a immersione all'obiettivo del microscopio a fluorescenza invertita.

Metti il piatto in un alloggiamento metallico e fissalo sul palco del microscopio.

Alza l'obiettivo finché l'olio non tocca il piatto, poi concentrati sulle cellule.

Usa software di imaging per impostare le pile Z e catturare immagini a più profondità.

Inizia ad acquisire immagini in time-lapse a fluorescenza.

Man mano che le cellule rispondono all'espressione dell'RNA antisenso, non riescono a dividersi e sviluppano forme gonfie.

L'organizzazione della membrana viene disturbata, causando fluorescenza irregolare e focale che indica una divisione cellulare difettosa.

Per visualizzare il campione, si utilizza la manopola di messa a fuoco di regolazione grossolana per assicurarsi che l'obiettivo sia completamente abbassato prima di inizializzare il microscopio all'interno del software del microscopio. Inserire una goccia di olio con indice di rifrazione di 1,517 nell'obiettivo di immersione in olio 100X e trasferire la ciotola con fondo di vetro contenente il campione nella bara metallica.

Fai scivolare delicatamente il piatto nel morsetto del palco e usa la manopola di regolazione grossolana per sollevare l'obiettivo finché l'olio non tocca il fondo del vetro del piatto. Usa l'oculare e la manopola di regolazione fine per mettere a fuoco il campione e passa in modalità fotocamera. Nel software di imaging nella finestra Resolve 3D, seleziona l'icona Design/Run Experiment.

Apparirà una nuova finestra di dialogo intitolata Design/Run Experiment. Apri le schede Design e Sezionamento nella finestra di dialogo per impostare il numero di Z stack e lo spessore del campione. Per misurare lo spessore delle celle nel campione, regola incrementalmente il piano Z usando le frecce su e giù nella finestra di dialogo 3D di Resolve, rendendo la posizione in cui le celle vanno fuori fuoco come limite superiore e inferiore per l'acquisizione dell'immagine.

Dopo aver regolato la Percentuale di Trasmissione dell'Intensità della Luce e la durata dell'Esposizione per i singoli canali selezionati nella finestra di dialogo Resolve 3D, clicca su Lista Punti per aprire la Lista Punti. Nelle schede Design e Time Lapse, seleziona la casella di spunta Time Lapse e inserisci i parametri del time lapse. Seleziona l'opzione Elenco dei Punti Visita e inserisci i punti da visualizzare nella casella di testo, separando i punti tramite virgole o trattini per sequenze complete.

Poi, modifica i nomi dei file e le posizioni dei file nella scheda Esegui e seleziona Riproduci nella finestra di dialogo Inizia l'esperimento per avviare l'esperimento.