Compact Quantum Dots per singola molecola Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare punti quantici fluorescenti con luminosità e stabilità ottimizzate, nonché dimensioni ridotte al minimo e legame non specifico per l'uso nell'imaging di singole molecole. Ciò si ottiene preparando prima piccoli nuclei di punti quantici di seleniuro di cadmio. Il secondo passo consiste nel legare questi nuclei con il mercurio per spostare la loro fluorescenza nello spettro rosso e aumentare la loro luminosità.

Successivamente, un sottile guscio di lega viene coltivato sui nanocristalli per stabilizzare la loro emissione di fluorescenza. Il passaggio finale consiste nel trasferire queste particelle da solventi organici a tamponi acquosi utilizzando un polimero multidentato, che può essere modificato con glicole polietilenico biologicamente inerte. In definitiva, la spettrometria a fluorescenza, la cromatografia su gel e l'elettroforesi su gel vengono utilizzate per dimostrare che queste particelle hanno una fluorescenza brillante, una dimensione idrodinamica compatta e una carica elettrostatica neutra ben adatta per l'imaging a fluorescenza di una singola molecola in biologia.

Il vantaggio principale di questi punti quantici rispetto ai materiali commerciali esistenti è che queste nanoparticelle hanno una dimensione idrodinamica significativamente ridotta. Sebbene i punti quantici più piccoli siano influenzati negativamente dalla diminuzione dell'intensità della fluorescenza, dalla diminuzione della stabilità della fluorescenza e dalla fluorescenza solo nello spettro blu, abbiamo compensato questi effetti utilizzando un processo di scambio cationico del mercurio. Questi nanocristalli possono aiutare a rispondere a domande chiave in biofisica e segnalazione cellulare consentendo l'imaging dinamico di singole biomolecole in ambienti biologici affollati.

Per iniziare, prepara una soluzione 0,4 molare di selenio in cima aggiungendo selenio a 50 millilitri. Pallone a tre colli, evacuazione del pallone sotto vuoto elevato e riempimento con argon utilizzando una linea di gambo sch in condizioni di assenza di aria. Aggiungere 10 millilitri di superficie e scaldare a 100 gradi Celsius mescolando per un'ora per ottenere una soluzione limpida e incolore.

Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e mettere da parte il pallone. Inoltre, preparare una soluzione di ossido di cadmio TDPA e ODE in un pallone a tre colli da 250 millilitri utilizzando le quantità elencate nel protocollo scritto. A corredo di questo video, evacuare la soluzione utilizzando una linea di gambo mentre si mescola.

Aumentare la temperatura a 100 gradi Celsius ed evacuare per altri 15 minuti. Per rimuovere le impurità a basso punto di ebollizione sotto il gas Argonne, riscaldare la miscela a 300 gradi Celsius per un'ora per sciogliere completamente l'ossido di cadmio. La soluzione cambierà da un colore rossastro a limpido e incolore, raffreddando la soluzione a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungi l'HDA alla soluzione di cadmio, riscalda a 70 gradi Celsius ed evacua. Una volta raggiunta una pressione costante, aumentare la temperatura e rifluire la soluzione per 30 minuti. Commutare la valvola della linea schlink su gas inerte e inserire la termocoppia direttamente nella soluzione.

In condizioni di assenza di aria, aggiungere DPP alla soluzione di cadmio e aumentare la temperatura a 310 gradi Celsius. Ora usa una siringa di plastica usa e getta attaccata a un ago calibro 16 per rimuovere 7,5 millilitri della soluzione di selenio superiore 0,4 molare. Una volta che la temperatura si è stabilizzata a 310 gradi Celsius, impostare il regolatore di temperatura su zero gradi Celsius e iniettare rapidamente la soluzione di selenio superiore direttamente nella soluzione di cadmio.

La soluzione cambierà da incolore a gialla, arancione e la temperatura scenderà rapidamente e aumenterà di nuovo a circa 280 gradi Celsius. Il passaggio più difficile di questa procedura consiste nell'iniettare l'intero volume della siringa il più rapidamente possibile nella soluzione di cadmio. Ciò garantisce che le particelle nucleino in modo omogeneo.

Dopo un minuto di reazione, rimuovere il pallone dal mantello riscaldante e raffreddare rapidamente con un getto d'aria fino a quando la temperatura non scende a meno di 200 gradi Celsius. Quando la temperatura raggiunge circa 40 gradi Celsius, diluire con 30 millilitri di esano, la maggior parte del precursore del cadmio rimanente si depositerà fuori dalla soluzione. Rimuovere questo precipitato mediante centrifugazione.

In ciascuna delle sei provette da centrifuga coniche in polipropilene da 50 millilitri, diluire 12 millilitri della soluzione grezza di nano Krystal risultante. Con 40 millilitri di acetone dopo la centrifugazione con gli stessi parametri, decantare accuratamente e scartare il surnatante. Quindi, sciogliere i pellet di nano krysttal in esano.

Estrarre la soluzione con un volume uguale di metanolo mantenendo la fase superiore. Ripetere l'estrazione altre due volte per la terza estrazione. Il volume di metanolo può essere regolato a circa 15 millilitri per ottenere una soluzione concentrata di esano di punti quantici di seleniuro di cadmio puro a circa 200 micromolari.

La resa tipica di questa reazione è di tre cristalli micromolari di seleniuro di cadmio con un diametro di due tre nanometri determinano il diametro e la concentrazione del nano Krystal misurando lo spettro di assorbimento visibile ultravioletto come descritto nella procedura scritta, i nano cristalli possono essere parzialmente scambiati con il mercurio per lo spostamento verso il rosso, l'assorbimento e l'emissione di fluorescenza. Per fare questo in una fiala di vetro da 20 millilitri con mescola esano e cloroformio, quindi aggiungere la soluzione di punti quantici di seleniuro di cadmio OLA e l'ottano di mercurio violano. Dopo aver purificato i nanocristalli e determinato la loro concentrazione come descritto nella procedura scritta, lasciare invecchiare i nanocristalli per almeno 24 ore a temperatura ambiente per la crescita del guscio.

Preparare soluzioni di precursori di gusci molari da 0,1 in 50 millilitri, tre fiasche a collo sotto soluzioni termiche sotto vuoto di precursore di cadmio, precursore di zinco e precursore di zolfo a riflusso per un'ora per produrre soluzioni limpide, quindi caricare con argon in un pallone a tre colli. Aggiungere l'ODE topografico e i punti quantici preparati di seleniuro di mercurio e cadmio. Evacuare l'esagono a temperatura ambiente utilizzando la linea di fianco.

Aumentare la temperatura a 100 gradi Celsius e rifluire per 15 minuti. Sostituire la valvola di linea con il gas Argonne e inserire la termocoppia nella soluzione nano Krystal. Dopo aver aumentato la temperatura a 120 gradi Celsius, aggiungere 0,5 monostrati o 140 microlitri di soluzione di precursore dello zolfo e lasciare che la reazione proceda per 15 minuti.

Aumentare la temperatura a 140 gradi Celsius. Aggiungere 0,5 monostrati o 140 microlitri di soluzione precursore del cadmio e lasciare che la reazione proceda per 15 minuti. Quindi aggiungere 500 microlitri di OLA anidro alla soluzione di reazione.

Aggiungere 160 gradi Celsius, aggiungere 0,5 monostrati o 220 microlitri di soluzione di precursore dello zolfo, seguita da una quantità uguale di soluzione di precursore dello zinco a 170 gradi Celsius con 15 minuti tra ogni aggiunta. Quindi, a 180 gradi Celsius, aggiungere 0,25 monostrati o 150 microlitri di soluzione di precursore dello zolfo e soluzione di precursore dello zinco a intervalli di 15 minuti. Bello. La soluzione a temperatura ambiente e un nuovo coefficiente di estinzione per queste particelle.

Utilizzando uno spettro UV-vis, supponendo che il numero di nanocristalli non sia cambiato, conservare la soluzione di reazione sotto forma di miscela grezza in un congelatore. In questa fase, i nanocristalli possono essere caratterizzati utilizzando la microscopia elettronica, la spettroscopia di assorbimento UV-VIS e la spettroscopia di fluorescenza. Aggiungere i punti quantici del guscio del nucleo purificati a un pallone a tre colli da 50 millilitri e rimuovere l'esina sotto vuoto spinto.

Per ottenere un film asciutto, riempire il pallone con argonne. Aggiungere la purina anidra al film di nanoparticelle e riscaldare l'impasto a 80 gradi Celsius nel corso di una o due ore. Le nanoparticelle si dissolveranno completamente.

Aggiungere un millilitro di un glicerolo FIO alla soluzione e mescolare a 80 gradi Celsius per due ore. Dopo aver raffreddato la soluzione a temperatura ambiente, aggiungere 0,5 millilitri di trietilammina per deprotonare il tio glicerolo e mescolare per 30 minuti. La soluzione può diventare torbida dopo l'aggiunta di trietilammina a causa della scarsa solubilità dei nanocristalli polari in questa miscela di solventi.

Trasferire la soluzione di punti quantici in una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri contenente una miscela di 20 millilitri di esano e 20 millilitri di acetone e mescolare bene. Isolare i nanocristalli precipitati mediante centrifugazione, seguita dal lavaggio del pellet con acetone, sciogliere il pellet di punti quantici in cinque millilitri di DMSO con sonicazione a bagno e seguire con la centrifugazione. Per rimuovere eventuali aggregati, determinare la concentrazione di nanoparticelle da uno spettro di assorbimento UV V.

La soluzione di punti quantici puri deve essere utilizzata entro tre ore poiché la superficie può ossidarsi lentamente in condizioni ambientali nell'aria. Diluire la soluzione di punti quantici a 10 micromolari o meno con DMSO e trasferirla in un matraccio da 50 millilitri. Aggiungere una soluzione preparata di cinque milligrammi per millilitro di acido poliacrilico dilatato in DMSO, goccia per goccia alla soluzione di punti quantici mescolando e degassare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti.

Spurgare la soluzione polimerica a punti quantici con Argonne e riscaldare a 80 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo aver raffreddato la soluzione a temperatura ambiente, aggiungere un volume uguale di 50 millimolari di sodio a pH otto goccia per goccia e mescolare per 10 minuti. Purificare i punti quantici come descritto nella procedura scritta e determinare la concentrazione da uno spettro di assorbimento UV-vis in una fiala di vetro da quattro millilitri con ancoretta, mescolare una mole, punti quantici in tampone borato con un eccesso di 40.000 volte molare di 750 Dalton mono ammino polietilenglicole.

Le istruzioni sono disponibili nella procedura scritta su come aggiungere funzionalità chimiche specifiche ai nanocristalli. Aggiungere rapidamente un eccesso di 25.000 volte molare di una soluzione appena preparata della soluzione dell'agente attivante alla soluzione di punti quantici e agitarla a temperatura ambiente per 30 minuti. Ripetere questo passaggio altre quattro volte per saturare la superficie nano krysttal con PEG.

Infine, aggiungere 200 microlitri di un tampone tris molare per estinguere la reazione prima di purificare i nano cristalli Utilizzando filtri centrifughi per dialisi o ultracentrifugazione, il nano cristallo risultante può essere analizzato per le dimensioni idrodinamiche della mono dispersità e la carica superficiale utilizzando la cromatografia liquida, l'elettroforesi su gel e la microscopia a fluorescenza. Qui è mostrato un assorbimento rappresentativo e spettri fluorescenti per nano cristalli di seleniuro di cadmio, mercurio, cadmio, seleniuro, nano cristalli dopo lo scambio di cadione e un nucleo di seleniuro di cadmio di mercurio, cadmio del guscio, nano cristalli di solfuro di zinco dopo la crescita del guscio. I nanocristalli di seleniuro di cadmio hanno una resa quantica di fluorescenza vicina al 15%Tuttavia, questa efficienza scende a meno dell'1% dopo lo scambio di mercurio, probabilmente a causa delle trappole portatrici di carica introdotte attraverso la distruzione dell'atomo superficiale.

La crescita di un sottile guscio di solfuro di cadmio e zinco aumenta questa efficienza a oltre il 70%, che viene in gran parte mantenuta dopo il trasferimento in acqua. Al contrario, i nanocristalli di seleniuro di cadmio centrale, cadmio a conchiglia, solfuro di zinco senza incorporazione di mercurio perdono una frazione sostanziale della loro resa quantica in acqua, a meno che non venga coltivato un guscio spesso. È importante notare che la copertura con solfuro di cadmio e zinco sposta gli spettri verso il rosso a causa della perdita dei portatori di carica elettronici nel materiale del guscio.

Questo spostamento è di circa 20-30 nanometri per i nuclei di cadmio e aumenta con l'aumentare del contenuto di mercurio nel nucleo. Pertanto, incorporando il mercurio nel nano cristallo del nucleo, le piccole dimensioni del nano Krystal possono essere mantenute senza sacrificare la luminosità. Le piccole dimensioni sono dimostrate in questa micrografia elettronica a trasmissione e nella distribuzione granulometrica dei nanocristalli di mercurio, cadmio, seleniuro, cadmio a guscio, solfuro di zinco che mostrano un diametro medio di 3,2 più o meno 0,6 nanometri.

L'uso di un trasferimento di fase in due fasi all'acqua è fondamentale per ottenere una popolazione omogenea di nanocristalli che non richiedono un'ulteriore selezione dimensionale per rimuovere i cluster e aggregare l'esclusione dimensionale. Il cromatogramma qui raffigurato conferma che la dimensione è simile a quella della conalbumina. A 75 kilodalton e dopo la modifica con 750 Dalton amino PEG, la dimensione è aumentata a soli 12 nanometri, simile a quella di un anticorpo IgG.

modifica del PEG neutralizza la carica superficiale come confermato nell'esperimento di elettroforesi su gel aros qui raffigurato, il pozzetto è contrassegnato da una freccia e le polarità degli elettrodi sono indicate sulla destra mostrando che prima della coniugazione i nano cristalli migrano come particelle oniche e che i nano cristalli pegilati sono elettrostaticamente neutri. Qui è mostrata una micrografia a epifluorescenza di questi nano cristalli depositati su un vetrino di vetro ed eccitati con luce visibile a 545 nanometri. Questi nanocristalli sono facilmente osservabili a livello di singola molecola a 30 fotogrammi al secondo con una telecamera CCD a moltiplicazione di elettroni.

Questo grafico mostra che il numero di particelle fluorescenti osservate in ciascun fotogramma fluttua nel tempo con l'eccitazione continua. Ciò è dovuto a una combinazione di lampeggiamento e degrado delle foto. Le palpebre dominano per i primi sette minuti prima che la degradazione della foto ossidativa diventi lentamente evidente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare chimicamente i punti quantici, come trasferirli in tamponi acquosi e come modificarli per le applicazioni di bioimaging. Non dimenticare che lavorare con reagenti contenenti cadio e mercurio può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere ulteriori precauzioni per prevenire l'esposizione personale.