Compact Quantum Dots per singola molecola Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare punti quantici fluorescenti con luminosità e stabilità ottimizzate, nonché dimensioni ridotte e legame non specifico minimizzato, per l'utilizzo nell'imaging di singole molecole. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando nuclei piccoli di punti quantici al seleniuro di cadmio. Il secondo passaggio consiste nell'allestire questi nuclei con mercurio per spostare la loro fluorescenza verso lo spettro rosso e aumentarne la luminosità.

Successivamente, su questi nanocristalli viene fatto crescere un sottile strato di lega per stabilizzarne l'emissione fluorescente. L'ultimo passaggio consiste nel trasferire queste particelle da solventi organici a tamponi acquosi utilizzando un polimero multidentato, che può essere modificato con polietilene glicole biologicamente inerte. Infine, la spettrometria di fluorescenza, la cromatografia su gel e l'elettroforesi su gel vengono utilizzate per dimostrare che queste particelle presentano una fluorescenza intensa, una dimensione idrodinamica compatta e una carica elettrostatica neutra, caratteristiche particolarmente adatte all'imaging di singole molecole mediante fluorescenza in ambito biologico.

Il principale vantaggio di questi punti quantici rispetto ai materiali commerciali esistenti è che queste nanoparticelle presentano una dimensione idrodinamica significativamente ridotta. Sebbene i punti quantici più piccoli siano negativamente influenzati da una minore intensità di fluorescenza, da una ridotta stabilità della fluorescenza e da emissione fluorescente limitata allo spettro blu, abbiamo compensato questi effetti mediante un processo di scambio di cationi di mercurio. Questi nanocristalli possono contribuire a rispondere a questioni fondamentali in biofisica e segnalazione cellulare, permettendo l’imaging dinamico di singole biomolecole in ambienti biologici affollati.

Per iniziare, preparare una soluzione 0,4 molare di selenio in TOP aggiungendo selenio a un matraccio tricollo da 50 millilitri, evacuando il matraccio sotto vuoto spinto e riempiendolo con argon utilizzando una linea a schlenk in condizioni prive di aria. Aggiungere 10 millilitri di TOP e riscaldare a 100 gradi Celsius sotto agitazione per un'ora, ottenendo una soluzione limpida e incolore.

Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e mettere da parte il pallone. Inoltre, preparare una soluzione di ossido di cadmio TDPA e ODE in un pallone da 250 millilitri a tre collo usando le quantità indicate nel protocollo scritto. In contemporanea a questo video, sottoporre la soluzione a vuoto utilizzando una linea a vuoto sotto agitazione.

Aumentare la temperatura a 100 gradi Celsius ed effettuare il vuoto per ulteriori 15 minuti. Per rimuovere le impurità a basso punto di ebollizione sotto gas Argonne, riscaldare la miscela a 300 gradi Celsius per un'ora in modo da sciogliere completamente l'ossido di cadmio. La soluzione passerà da un colore rossastro a incolore e limpida; raffreddare quindi la soluzione a temperatura ambiente.

Successivamente, aggiungere HDA alla soluzione di cadmio, riscaldare a 70 gradi Celsius ed evacuare. Una volta raggiunta una pressione costante, aumentare la temperatura e rifluire la soluzione per 30 minuti. Commutare la valvola della linea schlink al gas inerte e inserire il termocoppia direttamente nella soluzione.

In condizioni prive di aria, aggiungere DPP alla soluzione di cadmio e aumentare la temperatura a 310 gradi Celsius. Utilizzare ora una siringa di plastica monouso collegata a un ago da 16 gauge per prelevare 7,5 millilitri della soluzione superiore di selenio 0,4 molare. Una volta che la temperatura si è stabilizzata a 310 gradi Celsius, impostare il regolatore di temperatura a zero gradi Celsius e iniettare rapidamente la soluzione superiore di selenio direttamente nella soluzione di cadmio.

La soluzione cambierà da incolore a gialla, arancione, e la temperatura scenderà rapidamente per poi aumentare nuovamente a circa 280 gradi Celsius. Il passaggio più difficile di questa procedura consiste nell'iniettare il volume intero della siringa il più rapidamente possibile nella soluzione di cadmio. Questo garantisce una nucleazione omogenea delle particelle.

Dopo un minuto di reazione, rimuovere il pallone dal mantello riscaldante e raffreddare rapidamente con un flusso d'aria fino a quando la temperatura scende sotto i 200 gradi Celsius. Quando la temperatura raggiunge circa 40 gradi Celsius, diluire con 30 millilitri di esano; la maggior parte del precursore del cadmio residuo precipiterà dalla soluzione. Rimuovere questo precipitato mediante centrifugazione.

In ciascuna delle sei provette coniche da centrifuga in polipropilene da 50 millilitri, diluire 12 millilitri della soluzione grezza nano Krystal risultante. Con 40 millilitri di acetone, dopo la centrifugazione con gli stessi parametri, versare con attenzione e scartare il soprannatante. Successivamente, sciogliere i pellet di nano krysttal in esano.

Estrarre la soluzione con un volume uguale di metanolo, mantenendo la fase superiore. Ripetere questa estrazione altre due volte per la terza estrazione. Il volume di metanolo può essere regolato a circa 15 millilitri per ottenere una soluzione concentrata di hexano contenente punti quantici puri di seleniuro di cadmio a circa 200 micromolare.

Il rendimento tipico di questa reazione è di tre micromoli di cristalli di seleniuro di cadmio con un diametro di due-tre nanometri. Determinare il diametro e la concentrazione dei nano cristalli misurando lo spettro di assorbimento nell'ultravioletto-visibile come descritto nella procedura scritta. I nano cristalli possono essere parzialmente scambiati con mercurio per spostare verso il rosso l'assorbimento e l'emissione fluorescente. Per fare ciò, in un vial di vetro da 20 millilitri con barretta magnetica, mescolare esano e cloroformio, quindi aggiungere la soluzione di punti quantici di seleniuro di cadmio, OLA e octanoilato di mercurio. Dopo aver purificato i nano cristalli e determinato la loro concentrazione come descritto nella procedura scritta, lasciare invecchiare i nano cristalli per almeno 24 ore a temperatura ambiente per la crescita del guscio.

Preparare soluzioni precursori 0,1 molari per il guscio in fiale da 50 millilitri, a tre collo, sotto vuoto. Riscaldare le soluzioni dei precursori di cadmio, zinco e zolfo fino al riflusso per un'ora per ottenere soluzioni limpide, quindi saturare con argon una fiala a tre collo. Aggiungere il topo ODE e i punti quantici di seleniuro di mercurio e cadmio preparati. Rimuovere l'esina a temperatura ambiente utilizzando la linea laterale.

Aumentare la temperatura a 100 gradi Celsius e sottoporre a riflusso per 15 minuti. Cambiare la valvola del gas di linea con quello di Argon e inserire la termocoppia nella soluzione di nano Krystal. Dopo aver aumentato la temperatura a 120 gradi Celsius, aggiungere 0,5 strati monocristallini oppure 140 microlitri di soluzione precursora di zolfo e lasciare procedere la reazione per 15 minuti.

Aumentare la temperatura a 140 gradi Celsius. Aggiungere 0,5 strati monoatomici o 140 microlitri di soluzione precursori di cadmio e lasciare procedere la reazione per 15 minuti. Successivamente aggiungere 500 microlitri di OLA anidro alla soluzione di reazione.

Aggiungere 160 gradi Celsius, aggiungere 0,5 strati monoatomici, oppure 220 microlitri di soluzione precursora di zolfo, seguiti da una quantità equivalente di soluzione precursora di zinco a 170 gradi Celsius con intervalli di 15 minuti tra ogni aggiunta. Successivamente a 180 gradi Celsius, aggiungere 0,25 strati monoatomici, oppure 150 microlitri di soluzione precursora di zolfo e soluzione precursora di zinco a intervalli di 15 minuti. Raffreddare. La soluzione fino alla temperatura ambiente e un nuovo coefficiente di estinzione per queste particelle.

Utilizzando uno spettro UV vis, supponendo che il numero di nanostrutture non sia cambiato, conservare la soluzione di reazione come miscela grezza in un congelatore. A questo punto, le nanostrutture possono essere caratterizzate mediante microscopia elettronica, spettroscopia di assorbimento UV vis e spettroscopia di fluorescenza. Aggiungere i punti quantici purificati con nucleo e guscio in un pallone da 50 millilitri a tre collo e rimuovere l'esina sotto vuoto elevato.

Per ottenere un film secco, riempire il pallone con argon. Aggiungere purina anidra al film di nanoparticelle e riscaldare la sospensione a 80 gradi Celsius nell'arco di una o due ore. Le nanoparticelle si scioglieranno completamente.

Aggiungere un millilitro di glicerolo FIO 1 M alla soluzione e agitare a 80 gradi Celsius per due ore. Dopo aver raffreddato la soluzione a temperatura ambiente, aggiungere 0,5 millilitri di trietilammina per deprotonare il tioglicerolo e agitare per 30 minuti. La soluzione può diventare torbida dopo l'aggiunta della trietilammina a causa della scarsa solubilità dei nanocristalli polari in questa miscela di solventi.

Trasferire la soluzione di punti quantici in un tubo conico da centrifuga da 50 millilitri contenente una miscela di 20 millilitri di esano e 20 millilitri di acetone e mescolare accuratamente. Isolare i nanocristalli precipitati mediante centrifugazione, seguita da un lavaggio del pellet con acetone, sciogliere il pellet di punti quantici in cinque millilitri di DMSO mediante sonificazione in bagno e procedere quindi con la centrifugazione. Per rimuovere eventuali aggregati, determinare la concentrazione delle nanoparticelle da uno spettro di assorbimento UV-VIS.

La soluzione di punti quantici puri deve essere utilizzata entro tre ore poiché le superfici possono ossidarsi lentamente in condizioni ambientali in aria. Diluire la soluzione di punti quantici fino a 10 micromolari o meno con DMSO e trasferirla in un matraccio da 50 millilitri. Aggiungere goccia a goccia, sotto agitazione, una soluzione preparata di acido poliacrilico dilatato a cinque milligrammi per millilitro in DMSO alla soluzione di punti quantici e degasare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti.

Svuotare la soluzione polimerica di punti quantici con Argonne e riscaldare a 80 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo aver raffreddato la soluzione a temperatura ambiente, aggiungere un volume uguale di sodio ate 50 millimolare a pH otto goccia a goccia e agitare per 10 minuti. Purificare i punti quantici come descritto nella procedura scritta e determinare la concentrazione da uno spettro di assorbimento UV-vis in un vial di vetro da quattro millilitri con barra magnetica; mescolare un mole di punti quantici in tampone borato con un eccesso molare 40.000 volte di polietilenglicole monoamminico da 750 Dalton.

Le istruzioni su come aggiungere una specifica funzionalità chimica ai nanocristalli sono disponibili nella procedura scritta. Aggiungere rapidamente un eccesso molare di 25.000 volte di una soluzione appena preparata dell'agente attivante alla soluzione di punti quantici e agitare a temperatura ambiente per 30 minuti. Ripetere questo passaggio altre quattro volte per saturare la superficie del nanocristallo con PEG.

Infine, aggiungere 200 microlitri di tampone tris uno molare per bloccare la reazione prima di purificare i nano cristalli mediante filtri centrifughi per dialisi o ultracentrifugazione. I nano cristalli ottenuti possono essere analizzati per quanto riguarda la monodisperisità, le dimensioni idrodinamiche e la carica superficiale utilizzando cromatografia liquida, elettroforesi su gel e microscopia a fluorescenza. Qui sono mostrati spettri rappresentativi di assorbimento e fluorescenza per nano cristalli di seleniuro di cadmio, nano cristalli di seleniuro di mercurio e cadmio dopo scambio cationico, e nano cristalli a nucleo di seleniuro di mercurio e cadmio e guscio di solfuro di cadmio e zinco dopo la crescita del guscio. I nano cristalli a nucleo di seleniuro di cadmio presentano un rendimento quantico di fluorescenza vicino al 15%. Tuttavia, questa efficienza scende a meno dell'1% dopo lo scambio con mercurio, probabilmente a causa di trappole per i portatori di carica introdotte dalla perturbazione degli atomi superficiali.

La crescita di uno strato sottile di solfuro di cadmio zinco aumenta questa efficienza a oltre il 70%, valore che viene in gran parte mantenuto anche dopo il trasferimento in acqua. Al contrario, le nanostrutture con nucleo di seleniuro di cadmio e involucro di solfuro di cadmio zinco, senza incorporazione di mercurio, perdono una frazione sostanziale del loro rendimento quantico in acqua, a meno che non venga formato uno strato spesso. È importante notare che la passivazione con solfuro di cadmio zinco sposta gli spettri verso il rosso a causa della fuoriuscita dei portatori di carica elettronica nel materiale dell’involucro.

Questo spostamento è di circa 20-30 nanometri per i nuclei di cadmio e aumenta con il crescente contenuto di mercurio nel nucleo. Pertanto, incorporando il mercurio nel nanocristallo del nucleo, è possibile mantenere le ridotte dimensioni del nanocristallo senza compromettere la luminosità. Le piccole dimensioni sono dimostrate in questa microfotografia al microscopio elettronico a trasmissione e nella distribuzione delle dimensioni delle particelle di nanocristalli costituiti da nucleo di mercurio, cadmio, selenio e guscio di solfuro di cadmio e zinco, che mostrano un diametro medio di 3,2 ± 0,6 nanometri.

L'utilizzo di un trasferimento di fase in due passaggi in acqua è fondamentale per ottenere una popolazione omogenea di nanocristalli che non richiede ulteriore selezione per dimensione al fine di rimuovere aggregati e ammassi mediante esclusione dimensionale. Il cromatogramma qui riportato conferma che la dimensione è simile a quella della conalbumina. A 75 chilodalton e dopo la modifica con amino PEG da 750 Dalton, la dimensione aumenta fino a 12 nanometri, valore paragonabile a quello di un anticorpo IgG.

La modifica con PEG neutralizza la carica superficiale, come confermato dall'esperimento di elettroforesi in gel agarosio mostrato qui; il pozzetto è indicato con una freccia e le polarità degli elettrodi sono segnate a destra, dimostrando che prima della coniugazione i nanocristalli migrano come particelle ioniche, mentre i nanocristalli pegilati sono elettrostaticamente neutri. Qui è mostrata una microfotografia in epifluorescenza di questi nanocristalli depositati su un coprioggetto di vetro ed eccitati con luce visibile a 545 nanometri. Questi nanocristalli sono facilmente osservabili a livello di singola molecola a 30 fotogrammi al secondo mediante una telecamera CCD a moltiplicazione elettronica.

Questo grafico mostra che il numero di particelle fluorescenti osservate in ogni fotogramma fluttua nel tempo con eccitazione continua. Ciò è dovuto a una combinazione di fenomeni di blinking e degradazione fotoossidativa. Il blinking è predominante nei primi sette minuti, prima che la degradazione fotoossidativa diventi gradualmente evidente.

Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come sintetizzare chimicamente i punti quantici, su come trasferirli in tamponi acquosi e su come modificarli per applicazioni di bioimmagine. Non dimenticare che lavorare con reagenti contenenti cadmio e mercurio può essere estremamente pericoloso e che devono essere adottate precauzioni aggiuntive per prevenire l'esposizione personale.