Name: Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Scopri l'analisi microfluidica unicellulare di Bacillus subtilis per studiare la fisiologia batterica a lungo termine. Questo metodo consente l'osservazione di lignaggi cellulari individuali per centinaia di generazioni in condizioni controllate.

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Questo progetto è stato finanziato dal National Institutes of Health, sotto GM018568. Questo protocollo è stato effettuato in parte al centro per sistemi su scala nanometrica (CNS), un membro della nazionale nanotecnologia coordinato infrastruttura rete (NNCI), che è sostenuto dalla National Science Foundation sotto Premio NSF n. 1541959. CNS è parte dell'Università di Harvard. Molte grazie sono dovuti Thomas Norman e Nathan Lord, per il loro lavoro nella ideazione e realizzazione del modello master utilizzato per i dispositivi mostrati qui e nella creazione della versione originale dell'apparato. Inoltre ringraziamo Johan Paulsson per i suoi preziosi consigli collaborativo e ringraziare i membri del suo laboratorio per i loro consigli e continue migliorie agli apparati di microfluidica batterica.

1. PDMS dispositivo Casting
<ol><li>In un ambiente privo di polvere, mescolare polimero PDMS e agente indurente con un rapporto 10:1 e degassare sotto vuoto per almeno 10 min.</li>
	<li>Posizionare un maestro di silicio (o di una resina epossidica o poliuretano replica della stessa) su un pezzo di carta stagnola ininterrotta in una piastra di Petri in polistirolo. Versare il composto PDMS degassato sopra il padrone ad una profondità di circa 5 mm. Degas la piastra di Petri per almeno 10 min. uso un leggero getto d'aria per rompere le bolle superficiali. Nota: Le dimensioni del dispositivo due-tiered utilizzato sono disponibili in accompagnamento5 file CAD (Vedi supplementari File 1). Un master in plastica replica parzialmente può galleggiare durante il degasaggio; in questo caso, spingere verso il basso la replica con un applicatore di plastica pulito.</li>
	<li>Curare il PDMS per almeno 1 ora in forno a 60 ° C e raffreddare a temperatura ambiente. Rimuovere il foglio di alluminio contenente il PDMS master e curata dalla piastra di Petri. Rimuovere con cautela il foglio di alluminio dalla parte posteriore del Maestro, quindi rimuovere con cautela il PDMS dal master. Nota: In alternativa, PDMS, possono essere curate durante la notte a temperatura ambiente. La relativa fragilità di un maestro di wafer di silicio può essere superata utilizzando adesivo epossidico per legare definitivamente la cialda di un 1/16 di pollice-disco di alluminio di spessore della stessa dimensione come la cialda.</li>
	<li>Come un wafer in genere include diversi dispositivi microfluidici con dimensioni leggermente diverse (vedere 1 File supplementari), taglia una singola periferica a misura con un bisturi affilato, pulito. Nota: Per b. subtilis lavoro di routine, usare dispositivi con trincee 1.0-µm a livello cellulare, che sono segnate con una C o F nel file CAD associato.</li>
</ol>2. dispositivo di punzonatura e incollaggio
<ol><li>Posto un pezzo di traslucido ufficio nastro (Vedi Tabella materiali) sul lato disegnato del dispositivo per migliorare la visibilità delle feature. Le porte di ingresso e di uscita sono identificate come aree circolari alle estremità opposte dei canali fluidici visibile (Figura 1). Per migliorare la loro visibilità quando forando il dispositivo per i pin di ingresso e uscita, contrassegnare gli ingressi e le uscite con i puntini con un pennarello a punta fine. Nota: Per garantire che i pin di ingresso e di uscita non sono affollati, ogni altro canale è perforato, cominciando con il canale appena sotto la designazione alfabetica per il dispositivo.</li>
	<li>Capovolgere il dispositivo PDMS, in modo che il lato disegnato è giù e perforare attraverso il dispositivo per i punti contrassegnati usando un punzone per biopsia 0,75 mm; scartare le punzonature. Nota: I dispositivi sono perforati con lato disegnato verso il basso perché il buco generato dal Punzone biopsia in genere è leggermente svasato dove il pugno entra il polimero. Il dispositivo in un orientamento invertito di punzonatura assicura che il foro sul lato disegnato ha un bordo tagliente.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio stereoscopico, assicurarsi che i fori si sovrappongono con le aree di ingresso e di uscita del dispositivo. Utilizzare una pinzetta punta fine per rimuovere eventuali frammenti estranei di PDMS da fori perforati.</li>
	<li>Utilizzare nastro adesivo per rimuovere la polvere da entrambi i lati del dispositivo e del luogo in una piastra di Petri pulita in polistirolo. Preparare un vetro di copertura 22 x 40 mm bagnando con 100% di alcol isopropilico e strofinando con un panno di camere sterili; asciugare con un flusso di aria priva di polvere o azoto.</li>
	<li>Posizionare il perforato PDMS dispositivo funzionalità lato fino insieme con il vetro di copertura pulito in un plasma ad ossigeno pulitore.<ol>
<li>Plasma-trattare il dispositivo con le seguenti impostazioni: vuoto, mTorr 70; O pressione2 , 200 mTorr; durata, 15 s; potenza, 30 w. immediatamente al termine del periodo di trattamento al plasma, rimuovere il dispositivo e copertura in vetro dal plasma pulitore.</li>
		<li>Invertire il PDMS e posizionarlo al centro del vetro di copertura, in modo che contatti lato disegnato il vetro; Assicurarsi che i canali di alimentazione (in esecuzione tra le aree di ingresso e uscita) siano allineati con l'asse lungo il vetro di copertura. Premere molto delicatamente per assicurarsi che le guarnizioni PDMS contro il vetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuocere il dispositivo assemblato in un forno per almeno 1 h a 60 ° C. Dopo la cottura, verificare manualmente che il PDMS è incollato al vetro spingendo delicatamente su un angolo del dispositivo. Nota: Una volta che il dispositivo è legato, è consigliabile utilizzarla entro 24 h, come il polimero diventerà sempre più idrofobo con l'aumento di tempo dopo il trattamento al plasma.</li>
</ol>3. impianto idraulico microfluidici preparazione
<ol><li>Tagliare lunghezze di polimero tubi (diametro interno (ID) 0,02 pollici, diametro esterno (OD) 0,06 pollici) per lunghezze adeguate per raggiungere da pompa a siringa all'apparato di commutazione (se utilizzato) e il dispositivo quando è montato sul microscopio. Tagliare lunghezze come molti come ci sono corsie di microfluidica.</li>
	<li>Montare Y giunzioni per valvole a manicotto (se usando) taglio e collegando 2 cm lunghezze di silicone flessibile tubazione (0.03 pollici ID, 0,065 pollici OD) per le barbe superiore del "y" e lunghezze di 1 cm di tubo in silicone per la sbavatura di fondo del "y".</li>
	<li>Lunghezza di 10 cm (o appropriato) taglio di tubi di polimero; collegarli ad un'estremità fino al bivio di interruttore inserendo i segmenti di tubo in silicone 1 cm su barb inferiore del "y". Collegarli a altra estremità per aghi G 21 che sono stati rimossi dal loro piegato circa 90 ° circa 9 mm dall'estremità dell'ago e siringa di plastica adattatori.</li>
	<li>Collegare aghi smussato 21G a un'estremità dei segmenti di tubo che verrà eseguito dalle siringhe all'apparato interruttore inserendo gli aghi nel tubo. Inserire l'altra estremità di ogni tubo lunghezza i segmenti di tubo in silicone sugli strali di ingresso delle giunzioni Y. Nota: Utilizzare una sorta di apparecchio per tenere le valvole a manicotto e giunzioni sul posto; Questo può essere fatto facilmente da una casella di punta della micropipetta (Figura 2D).</li>
	<li>Tagliare lunghezze di tubo di polimero per trasportare rifiuti dalla presa del dispositivo in un recipiente di scarico. Collegarli ad una estremità ad aghi piegati 21G preparato come descritto sopra. L'altra estremità dei tubi del nastro in un becher da rifiuti.</li>
	<li>Preparare volumi appropriati di supporto contenente 0,1 mg/mL albumina di siero bovino (BSA) e riempire la dimensione desiderata e il numero delle siringhe. Collegare le siringhe BSA-caricati gli aghi 21G preparato allegati per le siringhe di tubazione e carico di ingresso in pompe a siringa. Nota: per tipici esperimenti 5 canali del dispositivo vengono utilizzati, ciascuno con una siringa da 20 mL. Un esperimento in cui il mezzo è commutato richiederà 2 banchi da 5 siringhe. Qui, la pompa contenente la prima banca è indicata come la pompa di fase 1 e la pompa contenente la seconda banca, con il mezzo di post-interruttore, è indicata come la pompa di fase-2.</li>
	<li>Spurgare l'aria dall'impianto idraulico ingresso eseguendo le pompe siringa ad un'alta portata (> 500 µ l/min), inizio orientando le pompe siringa verticalmente e toccando le siringhe per portare le bolle d'aria verso l'alto. Una volta che l'aria è stata eliminata dalle siringhe, posizionare la pompa a siringa orizzontalmente e progressivamente tocca o scorri verso l'alto le linee di polimero dalle siringhe attraverso l'interruttore dell'apparecchio sloggiare ed eliminare le bolle d'aria. Ripetere questo processo per la seconda banca di siringhe (se media di commutazione).</li>
	<li>Dopo le bolle d'aria vengono eliminate, impostare la pompa a siringa di fase-2 (cioè, con il mezzo che verrà utilizzato secondo, dopo l'interruttore) a 1,5 µ l/min, quindi sospendere il flusso. Piccolo raccoglitore posto aggancia i segmenti di tubi flessibili sul ramo delle giunzioni Y corrispondente alla seconda fase media. Continuare a eseguire la pompa a siringa di fase-1 ad una modesta portata (per esempio, 10 µ l/min) per almeno 30 min eliminare il mezzo secondo dal tubo dell'aspirazione a valle della giunzione Y.</li>
</ol>4. cellula cultura preparazione
<ol><li>Crescere una coltura del ceppo di interesse per il mezzo desiderato durante la notte, alla fase stazionaria. Il ceppo batterico dovrebbe contenere una mutazione che rende immobile, le cellule che le cellule non nuotare fuori i canali del dispositivo. Nota: In questo protocollo, il ceppo batterico è Bacillus subtilis 3610 contenente un hagA233V sostituzione (questa mutazione causa il flagello dritto piuttosto che di motilità cellulare elicoidale, prevenendo), un PrsbV- mNeonGreen Reporter per stress cellulare e costitutiva reporter Phyperspank- mNeptune (rosso) per evidenziare le celle. LB Lennox mezzo è usato nel protocollo di esempio. Tipici ceppi per esperimenti di microfluidica contengono uno o più reporter fluorescenti trascrizionale e una proteina fluorescente citoplasmica, costitutivamente prodotta per facilitare la rilevazione automatizzata delle cellule. Difetti di crescita non sono stati osservati quando mezzo ricco LB Lennox è stato usato, ma crescita di b. subtilis in media minima può essere inibita in condizioni di microfluidica perché secreto siderofori vengono lavati via dal flusso medio. In tali circostanze, crescita può essere ripristinato mediante l'aggiunta di citrato di sodio e cloruro ferrico al medium, come segnalato per S750 media11.</li>
	<li>La mattina dell'esperimento, diluire le cellule di b. subtilis 01:50 in una beuta da 250 mL sconcertato contenente 25 mL di terreno di coltura. Crescere le cellule per 5-6 h in agitazione la coltura a 37 ° C per una densità ottica di maggiore di 1. Nota: È preferibile una coltura cellulare denso perché la fase stazionaria Bacillus subtilis cellule sono più piccole e meno cella spesso trovata in catene, facilitando il caricamento del dispositivo. Diverse specie batteriche possono richiedere altre condizioni medie o crescita per un carico ottimale.</li>
	<li>Usando una siringa graduata con un filtro di dimensioni dei pori di 5 µm, filtrare circa 15 mL di coltura cellulare in una provetta conica da 15 mL per togliere le catene delle cellule di b. subtilis (è inutile per e. coli e potrebbe non essere necessario con altre specie). Nota: Relativamente poche cellule devono essere rimosso; il filtrato deve essere torbido.</li>
	<li>Centrifugare la cultura filtrata per 10 min a 4.000 x g e a temperatura ambiente. Versare il supernatante e risospendere il pellet cellulare nel sovranatante residuo rimanente nel tubo, eventualmente facilitare la sospensione cellulare di pipettaggio, aggiungendo circa 500 µ l di terreno fresco.</li>
</ol>5. il dispositivo caricamento
<ol><li>Posizionare delicatamente vuota sottile gel-caricamento micropipetta punte (Vedi Tabella materiali) nei fori di uscita del dispositivo microfluidico.</li>
	<li>Utilizzando sottile gel-caricamento suggerimenti con una micropipetta P200, passivare il dispositivo iniettando mezzo contenente 1 mg/mL BSA nei fori d'ingresso, osservando i suggerimenti nei fori di uscita per monitorare il riempimento dei canali microfluidici (Figura 2A). Incubare il dispositivo a temperatura ambiente per circa 5 min. Nota: BSA è comunemente usato come un agente blocco o passivazione che si legherà alla superficie idrofoba del polimero PDMS, aumentando la sua idrofilia e riducendo l'associazione di altre proteine o di cellule (via molecole di superficie delle cellule).</li>
	<li>Utilizzando sottile gel-caricamento suggerimenti, caricare ogni canale con le cellule del sedimento (dalla sezione 4), utilizzando i suggerimenti nel canale di uscita per monitorare l'avanzamento delle cellule attraverso il dispositivo (Figura 2B). Nota: Il caricamento è facilitato impostando la micropipetta P200 al suo volume massimo 200-µ l e quindi aspirare un cuscino d'aria prima aspirando un piccolo volume (circa la metà del volume della sezione sottile della punta della pipetta) delle cellule. Il volume di sedimento cellule non deve essere preciso, poiché il volume del dispositivo PDMS è piccolo rispetto a quello della micropipetta. Sappiamo di nessun limite superiore per la densità delle cellule del sedimento, fino a quando la sospensione delle cellule può essere dispensata nel dispositivo. Grumi di cellule possono intasare il dispositivo e dovrebbero essere evitati da pipettaggio approfondita e/o vortice di miscelazione.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente le punte di gel-caricamento dai fori di uscita, lavorando uno alla volta per evitare danni al dispositivo.</li>
	<li>Centrifugare il dispositivo in una microcentrifuga banco in un adattatore appropriato rotore a circa 6.000 x g per 10 min (Figura 2). Nota: È stato utilizzato un adattatore di rotore di custom-lavorati in alluminio che è stato progettato per adattarsi in un microcentrifuga rotore (Figura 2); centrifuga diversi modelli possono essere utilizzati con adattatori appropriati rotore. La caratteristica importante dell'adattatore è che esso fornisce forza laterale in direzione delle estremità chiuse delle trincee cella, costringendo le cellule nei canali laterali.</li>
	<li>Verificare caricamento riuscito sotto il microscopio (Figura 3), ma senza il dispositivo alla diapositiva titolare/fase di apposizione inserire. Nota: In questo protocollo, un 60 X, 1,4 obiettivo a immersione in olio NA Ph3 è usato per entrambi verifica in questa fase e per formazione immagine successiva.</li>
</ol>6. montaggio, equilibratura e montaggio del dispositivo
<ol><li>Attentamente montare il dispositivo caricato su un inserto di fase toccando il vetro di copertura su entrambi i lati di PDMS alla parte inferiore dell'inserto fase (cioè, invertire l'inserto di fase prima di fissare il dispositivo). L'Assemblea di inserto-dispositivo di fase il PDMS è rivolto verso l'alto e posizionarlo su una superficie morbida, come un panno privo di polvere (Figura 2D).</li>
	<li>Regolare la portata della pompa, phase-1 siringa per 35 µ l/min lavorando con una corsia per volta, inserire l'ago di aspirazione e quindi l'ago di presa (cioè, in esecuzione per il contenitore dei rifiuti; Figura 2E).</li>
	<li>Spazzare via ogni eccesso del prodotto con un panno pulito privo di polvere e ispezionare visivamente il dispositivo di tenuta. Esaminare il tubo di uscita per la comparsa di cellule in eccesso (in genere che appare come una striscia torbida) e il menisco medio, che si sposta lentamente verso il contenitore dei rifiuti.</li>
	<li>Consentire al dispositivo di eseguire a 35 µ l/min per circa 15-30 min, fino a quando tutte le corsie collegate sono drenante nel contenitore dei rifiuti.</li>
	<li>Impostare la pompa a siringa di fase-1 a 1,5 µ l/min e sospendere il flusso. Portare l'intero apparato di pompa e dispositivo al microscopio (questo processo è aiutato mettendolo tutto su un carrello dei Rolling Stones) e riavviare la fase-1 flusso medio a 1,5 µ l/min con attenzione montare l'inserto di fase con il dispositivo su un microscopio a fluorescenza invertito, utilizzando nastro come necessario per instradare l'ingresso e il tubo di uscita.</li>
	<li>Individuare posizioni desiderate sul dispositivo per l'imaging e iniziare la formazione immagine come desiderato. Si noti che le cellule richiedono in genere un paio d'ore (circa 10 generazioni) per raggiungere allo steady-state fase esponenziale crescita, e l'insorgenza di acquisizione delle immagini può essere ritardata come desiderato in modo che la formazione immagine inizia dopo il periodo di equilibrazione. Nota: La crescita di stato stazionario delle cellule tenuto in fase esponenziale deve essere verificata durante l'analisi di immagine successiva da rilevamento tempi di divisione cellulare e garantire che essi hanno raggiunto un valore minimo costante.</li>
</ol>7. media di commutazione
<ol><li>Tra successivi turni di imaging, mettere in pausa il flusso della pompa siringa di fase-1. Attentamente e sganciare la clip di legante da fase-2 silicone tubing, ciascuno per la tubazione del silicone in movimento sul ramo della giunzione Y fase-1. ONU-pausa il flusso della fase-2 siringa pompa (che è stata impostata su 1,5 µ l/min al punto 3.8) e continuare la formazione immagine. Nota: A 1,5 µm/min con una lunghezza di 10 cm del polimero della tubazione a valle delle giunzioni Y, il mezzo di seconda fase raggiunge il dispositivo in circa 50 min. Il tempo per il dispositivo può essere verificato empiricamente utilizzando supporti che contengono particelle di tracciante fluorescente.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo di microfluidica è flessibile in quanto molti dei passaggi possono essere modificate per ottimizzarne l'uso con una particolare specie o ceppo o per uno scopo specifico. In questo protocollo, infatti, abbiamo fatto modifiche al concetto "macchina madre" originale4 per ottimizzarne l'uso con Bacillus subtilis. Spesso, le trincee in cui le cellule sono confinate costituiscono una caratteristica di monostrato, considerando che in questo protocollo usiamo trincee di due-stra...

Una delle caratteristiche più sorprendenti della vita sulla terra è la sua ottima resilienza e varietà. Un obiettivo centrale della biologia molecolare è di capire la logica con cui le cellule usano geni e proteine per massimizzare la loro crescita e fitness sotto un'ampia varietà di condizioni ambientali. Per raggiungere questo obiettivo, gli scienziati devono essere in grado di osservare con fiducia come crescono le singole celle, dividono ed esprimono loro geni sotto un dato insieme di condizioni, notando come le cellule rispondono alle successive modifiche nel loro ambiente. Tuttavia, i tradizionali metodi analitici in microbiologia hanno limitazioni tecniche che interessano i tipi di domande che possono essere affrontate. Ad esempio, analisi basati sulla cultura di massa sono stati molto utili nel corso degli anni, ma offrono solo dati a livello di popolazione che possono mascherare significative variazioni di cellula--cellula o i comportamenti di più piccole sottopopolazioni di cellule nella popolazione totale. Analisi unicellulare di batteri viventi basati su microscopia chiara rivelano unicellulare comportamento ma anche tecnicamente limitati. Batteri in genere sono immobilizzati su agarosi pastiglie contenenti terreno di coltura, ma folle crescita e divisione di cella la vista al microscopio e impoverisce i nutrienti disponibili dopo pochi cicli cellulari, sostanzialmente limitando il tempo di osservazione1, 2. Inoltre, lo svuotamento locale di sostanze nutritive e la concomitante formazione di sottoprodotti metabolici a causa della crescita delle cellule sono costantemente l'ambiente di crescita delle cellule locali in modi che sono difficili da misurare o prevedere. Tali cambiamenti ambientali usando agarosio rilievi rappresentano una sfida agli studi dei comportamenti stazionario o delle risposte cellulari agli specifici cambiamenti nella crescita condizioni3.
Tecnologia microfluidica, in cui un mezzo liquido è attraversato continuamente i dispositivi microfabbricati, offre una soluzione al classici limiti sperimentali. Un dispositivo microfluidico può mantenere singole celle in posizione per microscopia di cellule vive, mentre il flusso del mezzo di crescita costantemente cellule fornisce i nutrienti fresche e lava via i sottoprodotti metabolici e cellule in eccesso, creando così una crescita altamente uniforme ambiente. In condizioni di costante crescita, i comportamenti delle cellule possono essere osservati in isolamento dall'influenza di fattori ambientali, permettendo una vista ai confini della logica interna delle cellule. Come il flusso del fluido impedisce che il dispositivo microfluidico diventando affollato con le cellule, osservazione dei lignaggi di singola cellula per decine o centinaia di generazioni diventa possibile4,5. Tali tempi di osservazione lungo consentono la rilevazione di comportamenti non altrimenti rilevabili rari o a lungo termine delle cellule. Infine, la composizione del mezzo che attraversa il dispositivo può essere modificato a volontà, permettendo che le cellule devono essere rispettate come rispondono all'insorgenza di uno stress o per l'introduzione o la rimozione di un particolare composto.
Microfluidica ha già goduto di un numero di importanti applicazioni. Per esempio, è stato utilizzato in tessuto, organo o dispositivi di corpo-on-a-chip, in cui più tipi di cellule umane sono co-coltivati per simulare un in vivo condizione6; per lo studio del movimento del nematode in ambienti microstrutturata7; per esaminare le interazioni tra i biofilm batterici (ad es., 8); e per l'incapsulamento e la manipolazione di piccoli volumi di cellule o sostanze chimiche (ad es., 9). Dispositivi microfluidici sono diventati sempre più popolari nel campo della microbiologia (per recensioni eccellenti, Vedi 10 e 11), soprattutto come loro fisico e proprietà di flusso sono ben abbinati a nicchie microbiche naturali12. Per esempio, microfluidica è stato recentemente impiegato da microbiologi per tali scopi come misura precisamente cella crescita e divisione13,14,15, analizzando patogeno movimento16, monitoraggio di quorum sensing17 e transizioni fisiologico18e per la proteina contando19, fra molti altri esempi. Il metodo presentato qui è specificamente progettato per l'analisi dei lignaggi di singola cellula batterica piuttosto che combinazioni di specie o ceppi. Il dispositivo microfluidico dimostrato qui utilizza una variante di "macchina madre" design4, in cui le cellule sono coltivate file singolo all'interno di una trincea di microfluidica con un'estremità chiusa e una aperta; divisione e crescita delle cellule spinge le cellule progenie e fuori l'estremità aperta nel flusso del fluido. Le nostre analisi in genere concentrano solo sulla cella "madre" che si limita all'estremità chiusa della trincea. Consideriamo questo metodo come un avanzamento sopra precedente leggeri basato su microscopia unicellulare tecniche analitiche, quali immobilizzazione delle cellule su agarosio pastiglie. Mentre b. subtilis è utilizzato come un modello di qui, il metodo è applicabile ad altre specie batteriche (Escherichia coli è un altro modello comune; alcune specie con celle di diverse dimensioni o morfologie possono richiedere la realizzazione di nuovi dispositivi con dimensioni diverse). L'uso di reporter fluorescenti per contrassegnare le celle e di visualizzare i cambiamenti nell'espressione genica richiede l'uso di specie geneticamente trattabili; Tuttavia, l'analisi della crescita delle cellule e la morfologia sono possibili anche senza marcatori fluorescenti.
Il presente protocollo esclude il processo di fabbricare il maestro di silicio mediante fotolitografia, che è stato ampiamente descritta altrove5; Master può anche essere facilmente in outsourcing da strutture di microfabbricazione. Esso comprende lo stampaggio di un dispositivo PDMS da un maestro di silicone rinforzato; incollaggio al dispositivo di un pezzo di vetro di copertura; montaggio l'entrata di microfluidica e tubature di scarico, compreso pizzico valvole per consentire la commutazione medie; passivante del dispositivo, la preparazione delle cellule batteriche e caricamento della periferica con cellule batteriche; Collegare l'impianto idraulico al dispositivo ed equilibrare le cellule; e caricamento della periferica su un microscopio a fluorescenza per l'imaging. Perché molti diversi immagine acquisizione ed elaborazione software strumenti possono essere utilizzati per visualizzare e analizzare dati diversi di interesse4,5, immagini di esempio sono mostrate, ma metodi di acquisizione delle immagini non sono inclusi nel presente protocollo.

<table><tbody><tr><td>Kit elastomero siliconico Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>Questo è indicato come PDMS nel protocollo. Ci sono 2 componenti che vengono miscelati con un rapporto 10:1</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia da 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm No. 1,5 vetro di copertura VWR</td><td></td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Etch PE-50</td><td>Plasma Etch Inc.</td><td>PE-50</td><td>Strumento utilizzato per incollare PDMS al vetro utilizzando il trattamento al plasma di ossigeno</td></tr><tr><td>Tygon tubo flessibile ID 0,02", OD 0,06"</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>Per la parte principale del tubo, ad esempio attaccato agli aghi</td></tr><tr><td>Tubo in silicone, 0,04" ID, 0,085" OD</td><td>Tubo in silicone standard HelixMark</td><td>60-795-05</td><td>Per valvole a manicotto e collegamento a giunzione a Y</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Utilizzato come agente di passivazione</td></tr><tr><td>ART Gel Pipet Tips (P200)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>2155</td><td>Per il caricamento del dispositivo con fluido e celle</td></tr><tr><td>Filtro per siringa Acrodisc da 32 mm con 5-&mu; m Supor membrana</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td><td>Per filtrare le colture prima del caricamento del dispositivo</td></tr><tr><td>Aghi smussati da 21 ga, connettore</td> a Y da 1" <td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>con punte serie 200, tubo ID da 1/16", polipropilene</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>L'azienda è AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td></td><td>Questa unità è stata interrotta dal produttore ed è stata sostituita dalla Ti 2 E.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis ceppo NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>ceppo parentale wild-type modificato per l'uso negli esperimenti mostrati in questo protocollo</td></tr><tr><td>Forno a convezione a gravità</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>per la polimerizzazione PDMS e la cottura assemblato dispositivi</td></tr><tr><td>Scotch-Weld Epoxy Kit</td><td>3M</td><td>2216 B/A</td><td>può essere utilizzato per incollare un wafer di silicone a una piastra di supporto in alluminio</td></tr><tr><td>Nastro Scotch Magic, 3/4" di larghezza</td><td>3M</td><td></td><td>per pulire la polvere dai dispositivi PDMS e per posizionare sopra le caratteristiche per aumentare la visibilità (indicato con "nastro da ufficio" o "nastro adesivo" nel protocollo)</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>qui elencato a titolo di esempio; quasi tutti gli stereomicroscopi faranno</td></tr><tr><td>alcol isopropilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td>Per pulire il vetro di copertura</td></tr><tr><td>Pompa Syring, 6 canali</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>un marchio di salviette senza polvere</td></tr></tbody></table>

analisi microfluidic unicellulare del bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Tecnologia microfluidica supera molte delle limitazioni ai tradizionali metodi analitici in microbiologia. A differenza dei metodi di cultura di massa, offre risoluzione cella singola e lunga osservazione volte spanning centinaia di generazioni; a differenza dell'agarosi basati su pad microscopia, ha condizioni di crescita uniforme che possono essere strettamente controllate. Perché il flusso continuo di crescita medio consente di isolare le cellule in un dispositivo microfluidico da imprevedibili variazioni nell'ambiente chimico locale causato dalla crescita delle cellule e del metabolismo, autentici cambiamenti nell'espressione genica e la crescita delle cellule in risposta a stimoli specifici possono essere osservati con maggiore sicurezza. Bacillus subtilis è utilizzato qui come una specie batterica di modello per dimostrare una "macchina madre"-digitare metodo per analisi cellulare. Vi mostriamo come costruire e scandagliare un dispositivo microfluidico, caricarlo con cellule, avviare la formazione immagine microscopica e di esporre le cellule ad uno stimolo di commutazione da una coltura a altra. Un reporter lo stress-sensible a reagire è utilizzato come esempio per rivelare il tipo di dati che possono essere ottenuti da questo metodo. Inoltre brevemente discutiamo ulteriori applicazioni di questo metodo per altre tipologie di esperimenti, quali l'analisi di sporulazione batterica.

Successo iniziale delle cellule di carico, come valutato da microscopia di contrasto di fase prima di collegare l'impianto idraulico di microfluidica al dispositivo, sarebbe considerato come avendo tutti o quasi tutti i canali di lato di microfluidica contenente uno o più cellule batteriche ( Figura 3A). Carico ottimale avrebbe mostrato diverse celle in ogni canale, ma canali comunque si riempiranno di cellule a causa della crescita delle cellule durante il p...

Presentiamo un metodo per l'analisi di microfluidica di lignaggi di singola cellula batterica utilizzando Bacillus subtilis come esempio. Il metodo sormonta le imperfezioni dei tradizionali metodi analitici in microbiologia, consentendo l'osservazione di centinaia di generazioni di cellulari in condizioni di crescita uniforme e ben controllabile.

Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

L'obiettivo generale di questa configurazione sperimentale microfluidica è quello di consentire l'osservazione a lungo termine di singole cellule batteriche in condizioni ambientali costanti e altamente controllate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia batterica, come ad esempio quali sono i modelli di risposta a lungo termine delle singole cellule allo stress o come varia un fenotipo eterogeneo in una popolazione nel tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo osservare singole linee cellulari per decine o addirittura centinaia di generazioni, in condizioni ambientali costanti, uniformi e altamente controllate.Dopo aver preparato il polimero PDMS secondo il protocollo di testo, posizionare un master in silicone su un pezzo di foglio di alluminio ininterrotto in una capsula di Petri di polistirene. Versare la miscela PDMS degassata sul master a una profondità di circa cinque millimetri. Quindi degasare la pirofila per almeno 10 minuti.Polimerizzare il PDMS in forno a 60 gradi Celsius per almeno un'ora e raffreddarlo a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il foglio di alluminio contenente il PDMS master e polimerizz

single-cell-microfluidic-analysis-of-bacillus-subtilis

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Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo protocollo descrive un microfluidica co-coltura modello per la cultura contemporanea e localizzato delle cellule epiteliali e batteri. Questo modello può essere utilizzato per indagare il ruolo dei diversi segnali solubili molecolare sulla patogenesi e schermo l'efficacia del putativo ceppi batterici probiotici.

Microfluidica Co-coltura di cellule epiteliali e batteri per le indagini solubile del segnale mediato da Interazioni

Questo protocollo offre un passo-passo procedura per monitorare il comportamento singola cellula dei batteri diversi nel tempo con modalità automatizzate fluorescenza microscopia time-lapse. Inoltre, forniamo le linee guida su come analizzare le immagini di microscopia.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l'uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi...

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Fonte: Pioli, R., et al., Patterning di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra il metodo di cattura di singole cellule di Escherichia coli (E. coli) marcate in fluorescenza in trappole microfluidiche utilizzando una sospensione priva di carbonio e un flusso controllato, seguito dall'aggiunta di nutrienti per innescare la crescita e l'imaging a fluorescenza delle microcolonie.

Patterning microfluidico e tracciamento basato sulla fluorescenza della crescita batterica di singole cellule

Fonte: Cabeen, M. T., et al. Analisi microfluidica a singola cellula di Bacillus subtilis. J. Vis. Esp. (2018)Il video mostra l'uso di un dispositivo microfluidico per osservare la crescita batterica a livello di singola cellula. Mostra come le cellule batteriche non mobili, confinate in trincee su scala microscopica, vengano continuamente nutrite e imaggiate sotto un microscopio a fluorescenza. L'installazione consente la visualizzazione in tempo reale della divisione cellulare e del...

Monitoraggio della crescita batterica a risoluzione di singola cellula in un sistema microfluidico

In questo protocollo viene introdotta la fabbricazione, l'impostazione e il funzionamento di base di un bioreattore microfluidico picolitro (PLBR) per l'analisi di singole cellule di microrganismi procarioti. I microrganismi rilevanti a livello industriale sono stati analizzati come prova di principio che consente di comprendere il tasso di crescita, la morfologia e l'eterogeneità fenotipica in determinati periodi di tempo, difficilmente possibili con i metodi convenzionali.

Bioreattore microfluidico picolitro per l'analisi microbica di singole cellule: fabbricazione, configurazione del sistema e funzionamento

In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.

Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

L'imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l'integrazione dell'imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l'architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

La persistenza degli antibiotici descrive la capacità di piccole sottopopolazioni all'interno di una popolazione isogena sensibile di tollerare transitoriamente alte dosi di antibiotici battericidi. Il presente protocollo combina approcci per caratterizzare il fenotipo di persistenza antibiotica a livello molecolare e cellulare dopo aver esposto Escherichia coli a dosi letali di ofloxacina.

Analisi di popolazione e monocellulare della persistenza antibiotica in Escherichia coli

Questo protocollo si concentra sull'uso della citometria a flusso e del conteggio delle microsfere per quantificare le spore batteriche marcate con bromuro di etidio. Il metodo è anche efficiente per analizzare l'accoppiamento covalente di proteine sulla superficie di spore intatte.

Miglioramento dell'enumerazione delle spore di Bacillus subtilis e analisi dell'etichetta nella citometria a flusso

Scopri l'analisi microfluidica unicellulare di Bacillus subtilis per studiare la fisiologia batterica a lungo termine. Questo metodo consente l'osservazione di lignaggi cellulari individuali per centinaia di generazioni in condizioni controllate.

Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis

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