Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis

L'obiettivo generale di questa configurazione sperimentale microfluidica è quello di consentire l'osservazione a lungo termine di singole cellule batteriche in condizioni ambientali costanti e altamente controllate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia batterica, come ad esempio quali sono i modelli di risposta a lungo termine delle singole cellule allo stress o come varia un fenotipo eterogeneo in una popolazione nel tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo osservare singole linee cellulari per decine o addirittura centinaia di generazioni, in condizioni ambientali costanti, uniformi e altamente controllate.

Dopo aver preparato il polimero PDMS secondo il protocollo di testo, posizionare un master in silicone su un pezzo di foglio di alluminio ininterrotto in una capsula di Petri di polistirene. Versare la miscela PDMS degassata sul master a una profondità di circa cinque millimetri. Quindi degasare la pirofila per almeno 10 minuti.

Polimerizzare il PDMS in forno a 60 gradi Celsius per almeno un'ora e raffreddarlo a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il foglio di alluminio contenente il PDMS master e polimerizzato dalla piastra. Segnalo con cura e stacca il foglio di alluminio dal retro del master.

Quindi staccare con cura il PDMS dal master. Come wafer, in genere include diversi dispositivi microfluidici con dimensioni leggermente diverse. Usa un bisturi pulito e affilato per tagliare un singolo dispositivo alla dimensione appropriata.

Posiziona un pezzo di nastro adesivo traslucido per ufficio sul lato con motivo del dispositivo per migliorare la visibilità delle caratteristiche con motivo. Le porte di ingresso e di uscita sono identificate come aree circolari alle estremità opposte dei canali fluidici visibili. Capovolgere il dispositivo PDMS con il lato del modello rivolto verso il basso e utilizzare un punzone per biopsia da 0,75 millimetri per perforare il dispositivo fino ai punti contrassegnati.

Quindi scartare le punzonature. Potrebbe essere necessaria una pinzetta per rimuovere i punzoni dal dispositivo. Inserire il vetro di copertura pulito e asciugato e il dispositivo PDMS in un pulitore al plasma di ossigeno e trattare il dispositivo con le impostazioni mostrate qui.

Subito dopo la fine del trattamento al plasma, rimuovere il dispositivo e coprire il vetro dal pulitore al plasma. Capovolgere il PDMS e posizionarlo al centro del vetro di copertura in modo che il lato del modello tocchi il vetro. Assicurarsi che i canali di alimentazione siano allineati con l'accesso lungo del vetro di copertura.

Premere molto delicatamente per assicurarsi che il PDMS aderisca al vetro. Cuocere il dispositivo assemblato in forno a 60 gradi Celsius per almeno un'ora. Dopo la cottura, verificare manualmente che il PDMS sia incollato al vetro spingendo delicatamente su un angolo del dispositivo.

Dopo aver tagliato i tubi in polimero secondo il protocollo di testo, assemblare le giunzioni a Y per le valvole a manicotto, se le utilizzano, tagliando e attaccando due centimetri di tubi flessibili in silicone alle punte superiori della Y e un centimetro di tubi in silicone alla punta inferiore della Y.Quindi, tagliare 10 centimetri di tubi in polimero, quindi collegarli a un'estremità alla giunzione dell'interruttore inserendole nei segmenti del tubo in silicone da un centimetro collegare le lunghezze del tubo all'altra estremità agli aghi calibro 21 che sono stati rimossi dai loro adattatori per siringhe di plastica e piegati di circa 90 gradi a circa nove millimetri dall'estremità dell'ago. Collegare gli aghi smussati calibro 21 a un'estremità dei segmenti del tubo che andranno dalle siringhe all'apparato di commutazione inserendo gli aghi nel tubo. Inserire le altre estremità di ogni lunghezza di tubo nei segmenti del tubo in silicone sulle punte di ingresso delle giunzioni a Y.

Dopo aver riempito le siringhe con terreno di crescita batterico, integrato con BSA, secondo il protocollo di testo, collegare le siringhe caricate agli aghi calibro 21 preparati, collegarle al tubo di ingresso e caricare le siringhe nelle pompe a siringa. Spurgare l'aria dall'impianto idraulico di ingresso facendo funzionare le pompe a siringa ad alta portata e orientando le pompe a siringa verticalmente, picchiettando le siringhe per portare le bolle d'aria verso l'alto. Una volta che l'aria è stata spurgata dalla siringa, posizionare la pompa a siringa orizzontalmente e picchiettare o far scorrere progressivamente le linee del polimero dalle siringhe, verso l'alto attraverso l'apparato di commutazione per rimuovere ed eliminare eventuali bolle d'aria.

Ripetere questa procedura per il secondo banco di siringhe se si cambia il fluido. Dopo che le bolle d'aria sono state spurgate, impostare la pompa a siringa di fase due su 1,5 microlitri al minuto, quindi mettere in pausa il flusso. Posizionare piccoli fermagli leganti sui segmenti del tubo flessibile sul ramo dei raccordi a Y corrispondenti alla seconda fase del fluido e continuare a far funzionare la pompa di fase uno per spurgare il secondo fluido a valle del giunto a Y.

Per caricare il dispositivo PDMS, iniziare posizionando delicatamente i puntali per micropipette vuoti e sottili con caricamento di gel nei fori di uscita del dispositivo microfluidico. Utilizzando puntali sottili per il caricamento del gel con la micropipetta P200, passivare il dispositivo iniettando un terreno contenente un milligrammo per millilitro di BSA nei fori di ingresso, osservando i puntali e i fori di uscita per monitorare il riempimento dei canali microfluidici. Incubare il dispositivo a temperatura ambiente per circa cinque minuti.

Quindi, utilizzando punte simili, caricare ciascun canale con le celle risospese utilizzando le punte nel canale di uscita per monitorare l'avanzamento delle celle attraverso il dispositivo. Rimuovere delicatamente le punte di caricamento del gel dai fori di uscita, lavorando una alla volta per evitare danni al dispositivo. Centrifugare il dispositivo in una microcentrifuga da banco in un adattatore del rotore appropriato a circa 6.000 volte g per 10 minuti.

Verificare il corretto caricamento al microscopio, ma senza fissare il dispositivo all'inserto del tavolino portavetrini. Montare con cautela il dispositivo caricato su un tavolino inserendo il nastro adesivo del vetro di copertura su entrambi i lati del PDMS nella parte inferiore del tavolino. Capovolgere il tavolino inserire il gruppo del dispositivo in modo che il PDMS sia rivolto verso l'alto e posizionarlo su una superficie morbida come un panno privo di polvere.

Regolare la portata della pompa a siringa di fase uno a 35 microlitri al minuto. Quindi, lavorando con una corsia alla volta, inserire l'ago di ingresso e poi lo spillo di uscita che corre verso il becher di scarico. Dopo aver ispezionato visivamente il dispositivo per verificare la presenza di perdite, esaminare il tubo di uscita per verificare la presenza di cellule in eccesso che appaiono come una striscia torbida nel menisco medio, che si sposterà lentamente verso il becher di scarto.

Una volta che il dispositivo ha funzionato per circa 15 minuti, impostare la pompa a siringa di fase uno su 1,5 microlitri al minuto e mettere in pausa il flusso. Portare l'intera pompa e l'apparato del dispositivo a un microscopio a fluorescenza invertito e riavviare il flusso del mezzo di fase uno a 1,5 microlitri al minuto. Montare con cautela l'inserto del tavolino con il dispositivo sul microscopio, utilizzando il nastro adesivo necessario per instradare i tubi di ingresso e uscita.

Individuare le posizioni appropriate sul dispositivo per l'imaging e iniziare l'imaging come desiderato. Si noti che le cellule richiedono in genere alcune ore per leggere lo stato stazionario, la crescita della fase esponenziale e l'inizio dell'acquisizione dell'immagine può essere ritardato come desiderato in modo che l'imaging inizi dopo il periodo di equilibrio. Per passare da un mezzo all'altro di cicli successivi di imaging, mettere in pausa il flusso della pompa a siringa di fase uno, sganciare con cautela le clip del legante dal tubo in silicone di fase due, spostandole ciascuna sul tubo di silicone sul ramo di fase uno della giunzione a Y, quindi rimettere in pausa il flusso della pompa a siringa di fase due e continuare l'imaging.

Come valutato mediante microscopia a contrasto di fase, prima di collegare l'impianto idraulico microfluidico al dispositivo, il carico iniziale delle cellule sarebbe considerato riuscito se tutti o quasi tutti i canali laterali microfluidici contenessero una o più cellule batteriche. Una volta che il dispositivo è stato caricato inizialmente, viene bilanciato a una portata relativamente elevata. Come mostrato qui, l'ispezione microscopica di un dispositivo equilibrato dovrebbe rivelare alcune cellule confinate in fila singola nella maggior parte dei canali laterali.

Una volta che un dispositivo equilibrato viene posizionato sul microscopio sotto flusso a 1,5 microlitri al minuto a 37 gradi Celsius, le cellule riprenderanno una crescita di fase esponenziale uniforme e costante nel corso di circa due ore. Le cellule che hanno ripreso la crescita in fase esponenziale possono essere visualizzate in modo affidabile utilizzando la microscopia a campo chiaro o a fluorescenza per almeno 24 ore. L'introduzione di un interruttore medio amplia la gamma di esperimenti che possono essere condotti, ma aumenta anche la frequenza di eventi catastrofici di morte cellulare attraverso la presenza di bolle d'aria o gruppi di cellule all'ingresso che si staccano e passano attraverso il canale di alimentazione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore, se eseguita correttamente. Utilizzando questa procedura, con diversi reporter fluorescenti, ceppi e condizioni ambientali, è possibile esaminare un'ampia varietà di fenomeni fisiologici, inclusi eventi molto rari o transitori.