Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare il legame delle proteine leganti il DNA come i fattori di trascrizione o le sue modificazioni dei calcoli. Ciò si ottiene preparando prima la cromatina come seconda fase. Viene impostata una reazione di immunoprecipitazione della cromatina per abbattere frammenti di DNA legati alla proteina di interesse.

Successivamente, il frammento di DNA legato alla proteina di interesse viene amplificato mediante PCR. Si ottengono risultati che mostrano un arricchimento del frammento di DNA legato alla proteina di interesse rispetto a una regione non legata sulla base dell'analisi QPCR. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della trascrizione, della cromatina e dell'epigenetica, come ad esempio quando e dove sono presenti diverse proteine modificate o non modificate.

Sul DNA Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla regolazione genica delle cellule T. Può essere applicato anche ad altri sistemi come linfociti B, campioni di leucemia e linee di cellule immortalizzate. La cromatina per questo esperimento sarà preparata da quattro cellule T naïve CD splenic di topo.

Per iniziare questa procedura, aggiungere il 37% di formaldeide a una concentrazione finale dell'1% alla sospensione di quattro cellule T CD in DMEM e agitare delicatamente a temperatura ambiente per 15 minuti. Questo reticolerà i complessi proteici del DNA. Arrestare la reticolazione aggiungendo un molare di glicina a una concentrazione finale di 125 millimolari.

Continuare a dondolare per cinque minuti a temperatura ambiente. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 200 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in cinque millilitri di PBS ghiacciato contenente inibitori della proteasi centrifugare nuovamente, lavare le cellule in questo modo per un totale di tre volte dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di tampone di lisi cellulare ghiacciato contenente inibitori della proteasi.

Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri e incubare su ghiaccio per 15 minuti. Raccogliere i nuclei mediante centrifugazione a 200 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare con cura il surnatante, risospendere i nuclei in 500 microlitri di lisi nucleare.

Il tampone contenente inibitori della proteasi incubare su ghiaccio per 15 minuti. Quindi, sonicare le celle utilizzando una sonda da 1,6 millimetri e un livello di uscita di quattro sonicare per 15 secondi. Raffreddare il campione sul ghiaccio per uno o due minuti per evitare il surriscaldamento e sonicare di nuovo per 15 secondi.

Ripetere la sonicazione e il raffreddamento per un totale di quattro volte centrifugare, la cromatina sonica a 16.000 G per cinque minuti. Alle quattro quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante limpido in una nuova provetta per microcentrifuga.

Rimuovere un'aliquota di 20 microlitri di surnatante trasparente. Aggiungere il colorante di caricamento del DNA e controllare il DNA sonicato mediante elettroforesi attraverso un gel agro al 2%. La dimensione ideale del DNA sonicato per la maggior parte delle applicazioni è compresa tra 200 e 500 coppie di basi.

Infine, determinare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro UV. La cromatina tranciata può essere utilizzata immediatamente per impostare una reazione di immunoprecipitazione della cromatina o conservata a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per l'immunoprecipitazione della cromatina o per la diluizione della cromatina a una concentrazione di DNA compresa tra cinque e 10 microgrammi per millilitro in un volume totale di due millilitri in tampone di diluizione del chip con inibitori della proteasi. Tutti i passaggi di questa procedura devono essere eseguiti a una temperatura compresa tra zero e quattro gradi Celsius.

Risparmia il 10%, ovvero 200 microlitri in questo esempio della cromatina sonicata diluita come riserva di input su ghiaccio del campione rimanente, aliquote di 450 microlitri in ciascuna delle quattro provette microview da 1,7 millilitri etichettate come controllo isotipo e anticorpo di interesse. Se vengono utilizzati più anticorpi dello stesso isotipo, sarà sufficiente un singolo controllo isotipo. Per eseguire questa analisi, aggiungere da due a cinque microgrammi di anticorpo specifico a seconda della specificità dell'anticorpo utilizzato o del controllo isotipografico alle rispettive provette. Agitare i tubi durante la notte a quattro gradi Celsius per consentire la formazione di complessi anticorpali della cromatina la mattina seguente.

Aggiungere 25 microlitri di perle magnetiche di proteina G a ciascuna miscela e agitare per almeno due ore a quattro gradi Celsius. Quindi, posizionare i tubi di fuge su un supporto magnetico per 15-20 secondi per consentire alle perline di raccogliersi sul lato magnetizzato. Rimuovere con cura la soluzione per aspirazione senza disturbare le perline.

Aggiungere un millilitro di soluzione di lavaggio a basso contenuto di sale e agitare delicatamente per cinque minuti sul mutatore. Raccogliere le perline utilizzando il supporto magnetico e rimuovere la soluzione di lavaggio. Aggiungere di nuovo un millilitro di soluzione di lavaggio a basso contenuto di sale e agitare delicatamente per cinque minuti.

Dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio a basso contenuto di sale, aggiungere un millilitro di soluzione di lavaggio ad alto contenuto di sale e agitare per cinque minuti. Raccogliere le perline utilizzando il supporto magnetico e rimuovere la soluzione di lavaggio. Ripetere il lavaggio con la soluzione di lavaggio ad alto contenuto di sale.

Una volta rimossa la soluzione di lavaggio ad alto contenuto di sale, aggiungere un millilitro di soluzione di lavaggio al cloruro di litio e agitare per cinque minuti. Raccogliere le perline utilizzando il supporto magnetico e rimuovere la soluzione di lavaggio. Ripetere il lavaggio con cloruro di litio una volta.

Aggiungere un millilitro di soluzione di TE e agitare per cinque minuti. Raccogliere le perline utilizzando il supporto magnetico e rimuovere la soluzione di lavaggio. Eluire il DNA dalle perle aggiungendo 250 microlitri di roccia tampone eluciana per 15 minuti a temperatura ambiente.

Pipet fuori dall'EIT e salva questo materiale in un nuovo tubo fuge da 1,7 millimetri. Ripetere ancora una volta e unire entrambi gli elu, scartare le perline per invertire le maglie incrociate. Aggiungere al DNA eluso cinque molari di cloruro di sodio fino a una concentrazione finale di 0,3 molari e un microlitro di RNA.

A aggiungere 400 microlitri di tampone di eluizione agli input salvati in precedenza. Per rendere il volume di 500 microlitri per ogni input, aggiungere cloruro di sodio a 0,3 molari, un microlitro di RNA, 10 microlitri di EDTA 0,5 molari, 20 microlitri di un tris molare, HCL pH 6,5 e un microlitro di proteinasi K.Sigillare le provette e incubarle per una notte a 65 gradi Celsius in un blocco riscaldante asciutto la mattina seguente, Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente. Quindi aggiungere un millilitro di etanolo al 100% e incubare per due ore per una notte a meno 80 gradi Celsius.

Per far precipitare la centrifuga del DNA, le provette a 16.000 G per 15 minuti. Per pellettare il lavaggio del DNA, il pellet di DNA una volta con etanolo al 70% e asciugare all'aria, il pellet di risospensione, il pellet di DNA in 100 microlitri di acqua distillata in autoclave, purificare il DNA utilizzando kayak, colonne di centrifuga rapida ed eluire in un volume totale di 50 microlitri di tampone di eluizione. Questo DNA è ora pronto per l'uso per l'amplificazione PCR.

L'analisi delle riserve QPCR per ottenere l'arricchimento completo su una regione di controllo non legata è l'aspetto più importante di questo protocollo. Utilizzando il software QPCR, accedere all'editor e contrassegnare i pozzetti contenenti campioni di input di varie diluizioni con i loro valori di curva standard. Etichettare anche i pozzetti con campioni di chip sconosciuti esattamente come è disposta la piastra PCR.

L'uso di una curva standard per interpolare le quantità di DNA nei campioni specifici e isotipi sconosciuti consente la valutazione e l'abbinamento della qualità e dell'efficienza di tutti i set di primer nell'intervallo di concentrazioni trovate nei campioni. Vai all'editor dei sottoinsiemi e contrassegna i sottoinsiemi, inclusi i pozzetti con i campioni di input e i campioni di chip sconosciuti. I campioni incogniti saranno quantificati utilizzando la curva standard generata dalle concentrazioni note dei campioni in ingresso per l'analisi.

Al termine dell'amplificazione PCR, eseguire l'analisi con ABS quant. Derivata seconda max. Selezionare il sottoinsieme per l'analisi e premere. Ok.

Premere il calcolo, che genererà la curva standard utilizzando le concentrazioni note dei campioni di input e visualizzerà la quantità assoluta di DNA presente nei campioni sconosciuti se la qualità del DNA è buona e se i primer si legano specificamente alla regione target, l'efficienza della PCR dovrebbe essere vicina a due. Eseguire un'analisi della curva di fusione con TM che chiama lo stesso sottoinsieme, se disponibile. Un singolo picco indica che è stato amplificato un solo prodotto specifico.

L'amplificazione di DNA specifico può essere testata anche mediante elettro il prodotto PCR, insieme alla scala del DNA attraverso un gel AROS. I dati ottenuti vengono quindi esportati come file di testo delimitato da tabulazioni, che può essere aperto in Microsoft Excel per ulteriori analisi. Dividi la quantità di DNA per l'anticorpo specifico con il controllo isotipografico per i primer mirati.

Ripetere questo passaggio per i primer della regione di controllo. Se più anticorpi dello stesso isotipo vengono utilizzati per diverse precipitazioni immunoimetriche, normalizzare ciascuno di essi con i valori dello stesso controllo isotipo. Inoltre, se vengono utilizzate più coppie di primer mirati, le quantità di DNA di un singolo set di riparazione del primer di controllo devono essere utilizzate per la normalizzazione di ciascun bersaglio.

I valori di output rappresentano l'arricchimento del fold dell'immunoprecipitazione anticorpale specifica in ciascuna posizione rispetto all'anticorpo non specifico L'immunoprecipitazione di fondo divide l'arricchimento del fold per i primer mirati con l'arricchimento del fold per i primer della regione di controllo per ottenere l'arricchimento rispetto a una regione non legata del controllo. È importante notare che, a causa della generazione di curve standard con il DNA totale in ingresso per ciascun campione, ciascuno dei valori di immunoprecipitazione interpolati dallo standard è già normalizzato ed espresso come frazione dell'input totale dal software della macchina. Il protocollo di immunoprecipitazione della cromatina qui dimostrato controlla le differenze, se presenti, nella quantità di DNA utilizzata nella PCR attraverso l'uso di una coppia di primer che amplifica una regione non legata del genoma, fungendo così da controllo del carico.

In questo esempio, la regione codificante del gene beta actina del topo è stata utilizzata come regione non legata alla proteina di interesse e il fattore di trascrizione e il sito di legame del grasso sul topo, il promotore IL due, è stato utilizzato come regione bersaglio. Questa istantanea di un foglio di calcolo Excel illustra l'uso del protocollo di calcolo descritto nei dati di analisi di tre ripetizioni sperimentali nelle caselle colorate di giallo, verde e viola con tre repliche tecniche. Ognuno di essi è stato utilizzato per calcolare l'arricchimento delle pieghe.

L'arricchimento relativo di una proteina legata a diverse regioni del genoma può essere confrontato se si sceglie lo stesso set di controllo isotipo e anticorpi specifici. Se la specificità dell'anticorpo è buona, si osserva tipicamente un arricchimento da due a dieci volte rispetto alla regione di controllo non legata. Questa figura mostra i risultati di un esperimento su chip con quattro cellule T CD convenzionali e quattro cellule T CD regolatorie isolate da topi.

Una piccola frazione di cellule T convenzionali è stata stimolata con PMA e micina ionica per 30 minuti. È stato osservato un arricchimento relativo dei fattori di trascrizione NFA, N grasso C uno e NFA C due al promotore IL due ed è qui raffigurato come arricchimento del fold su una regione non legata Seguendo questa procedura. Altri metodi, come il ChIP-seq, possono essere utilizzati per affrontare l'occupazione globale dei fattori di trascrizione o i cambiamenti globali dei segni epigenetici in risposta a uno stimolo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'immunoprecipitazione della cromatina utilizzando un numero limitato di cellule e analizzare i dati QPCI per determinare il banding del fattore di trascrizione rispetto a una regione di controllo non legata.