Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico
6 novembre 2017
Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.
L'obiettivo generale di questa procedura è preparare la cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla regolazione genica e sulle fibre muscolari scheletriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la preparazione della cromatina di grado ChIP dal muscolo scheletrico del topo.
Un tessuto fisicamente resistente con un alto contenuto di proteine strutturali. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo cercando di caratterizzare i meccanismi molecolari alla base dell'atrofia muscolare dell'uso del glucosio-articolato, che richiede l'identificazione del recettore del glucosio-articolato, dei siti di legame del DNA nelle fibre muscolari scheletriche del topo. A dimostrare la procedura sarà Shilpy Joshi, un post-doc del nostro laboratorio.
Per iniziare questa procedura, recuperare i muscoli degli arti posteriori congelati o appena sezionati. Successivamente, tritare i muscoli in una provetta da due millilitri, contenente un millilitro di tampone ipotonico ghiacciato fino a una preparazione omogenea di piccoli pezzi, utilizzando delle forbici sottili. Successivamente, lasciare agitare il tubo su un agitatore da banco a quattro gradi Celsius per cinque-10 minuti.
Successivamente, trasferire il tessuto sezionato in una provetta a fondo tondo da 14 millilitri contenente quattro millilitri di tampone ipotonico freddo. Omogeneizzare il tessuto tritato, utilizzando un omogeneizzatore meccanico di tessuti per 15-30 secondi. Successivamente, trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 millilitri.
Aggiungere un tampone ipotonico freddo per ottenere 10 millilitri di campione e fissare l'omogeneizzato prima di procedere con il topo successivo. In questa procedura, aggiungere formaldeide al campione per ottenere una concentrazione finale dell'1%. E poi agitare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere glicina per ottenere una concentrazione finale di 0,125 molari in ciascun tubo per interrompere la fissazione. E agitare per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Dopodiché, omogeneizzare il lisato fisso, usando un batuffolo sciolto.
Quindi, trasferirlo in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 1000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere nuclei e detriti cellulari. Dopo cinque minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone ipotonico fresco. Filtrare il lisato attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in una provetta da 50 millilitri.
Utilizzando la punta di una pipetta, lavare il filtro con un millilitro di tampone ipotonico freddo. Successivamente, rifiltrare il filtrato attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Successivamente, trasferire il filtrato in una provetta da 15 millilitri.
E centrifugare a 1000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il pellet nucleare. Dopo aver scartato il surnatante, utilizzare un millilitro di tampone ipotonico per raccogliere i tre pellet e trasferirli in un tubo da 1,5 a due millilitri. Centrifugare a 1000 g per cinque minuti.
Successivamente, valutare il volume del pellet nucleare confrontandolo con tubi contenenti un volume noto di liquido e risospenderlo in un tampone di sonicazione fino a tre o quattro volte il volume nucleare impaccato. Successivamente, sonicare la sospensione per 10-15 minuti a quattro gradi Celsius, utilizzando un sonicatore. Centrifugare il campione sonicato e trasferire il surnatante della cromatina in una provetta fresca da 1,5 millilitri.
Per dereticolare, prendere 30 microlitri di cromatina in una provetta da 1,5 millilitri e aggiungere 20 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e 450 microlitri di acqua. Completare il volume a 500 microlitri e incubare a 65 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, eseguire un trattamento con un microlitro di proteinasi K, 10 microlitri di tris a due molari a pH 6,8 e 10 microlitri di EDTA molare 0,5 per un'ora a 42 gradi Celsius.
Quindi, eseguire una regolare estrazione fenolo-cloroformio cloroformio e precipitare il DNA con un volume di acetato di sodio e due volumi di etanolo al 100% per un'ora a meno 80 gradi Celsius o durante la notte a -20 gradi Celsius. Quindi, pellettare il DNA mediante centrifugazione a 13, 500 g per 15 minuti. Decantare il surnatante e lavare accuratamente il pellet con etanolo freddo al 70% e centrifugare nuovamente per cinque minuti.
Quindi decantare il surnatante e asciugare il pellet all'aria. Successivamente, risospendere il pellet nel volume originale del tampone tris HCl EDTA. Misurare la concentrazione di DNA in uno spettrofotometro mediante assorbenti a 260 nanometri, 280 nanometri.
Successivamente, pipettare da 500 a 1000 nanogrammi di DNA insieme a una scala delle dimensioni di DNA su corsie separate di un gel di agarosio all'1,5%. Ed eseguire l'elettroforesi per valutare la dimensione del frammento della cromatina. Per ottimizzare, l'omogeneizzazione è stata eseguita per 15 secondi o 45 secondi a due velocità, 18.000 e 22.000 giri/min.
In tutte le condizioni, i nuclei potevano essere separati dai detriti di tessuto, ma la resa era ottimale utilizzando una velocità inferiore. I nuclei potevano anche essere preparati doungendoli per tre o cinque minuti. Ma l'omogeneizzazione meccanica è il metodo di scelta in quanto le rese ottimali dei nuclei possono essere raggiunte in soli 15 secondi, consentendo un notevole guadagno di tempo, soprattutto se è necessario elaborare più campioni.
Utilizzando questo protocollo, è possibile isolare fino a 2,7 volte 10 su sette nuclei da 500 milligrammi di tessuto per generare 100 microgrammi di cromatina. La cromatina preparata in questo modo fornisce risultati puliti e di alta qualità negli esperimenti di sequenziamento ChIP. Come illustrato dagli alti livelli di K27 acetilato dell'istone H3 e della RNA polimerasi 2 nel locus di Desmond espresso dal muscolo.
La specificità per la fibra muscolare è dimostrata da un segnale basso o assente nei loci Pecam1 e Vcam1 che non sono espressi nel muscolo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante immergere correttamente la sonda dell'omogeneizzatore nel campione per evitare la formazione di schiuma, pulire la sonda tra i campioni e ottimizzare la frammentazione della cromatina. La cromatina preparata in questo modo è stata utilizzata con successo per ChIP per mappare l'occupazione del fattore di trascrizione dell'intero genoma e dovrebbe anche essere adatta per le tecniche di cattura della conferma della cromatina.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo della genomica, per esplorare la regolazione genica nel muscolo scheletrico dei topi. La procedura può essere applicata anche al muscolo del ratto e alle biopsie di pazienti umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'omogeneizzazione meccanica, seguita dalla purificazione dei nuclei fissati con formaldeide per preparare la cromatina dal muscolo scheletrico per l'immunoprecipitazione.
Non dimenticare che lavorare con formaldeide, fenolo, cloroformio e proteinasi K può essere pericoloso. Devono essere prese precauzioni come indossare guanti e occhiali. Le fasi che coinvolgono questi reagenti devono essere eseguite sotto una cappa.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo protocollo per preparare la cromatina dal muscolo scheletrico di topo adulto, specificamente adattato per studiare la regolazione genica nelle fibre muscolari attraverso la cromatina immunoprecipitazione (ChIP). Il metodo affronta le sfide poste dalla resistenza fisica e dal contenuto proteico strutturale del tessuto muscolare scheletrico.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Regolazione genica
- Cromatina immunoprecipitazione
- Biologia del muscolo scheletrico
Contesto
- La preparazione della cromatina è cruciale per studiare la regolazione genica.
- Il muscolo scheletrico del topo è un tessuto complesso con un elevato contenuto di proteine strutturali.
- Comprendere i meccanismi molecolari nell'atrofia muscolare è essenziale per le strategie terapeutiche.
- L'identificazione dei siti di legame del DNA è necessaria per caratterizzare la regolazione genica.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per preparare la cromatina di grado ChIP dal muscolo scheletrico di topo.
- Facilitare lo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari.
- Indagare sui meccanismi molecolari alla base dell'atrofia muscolare.
Metodi utilizzati
- Preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico di topo adulto.
- Applicazione delle tecniche di immunoprecipitazione della cromatina.
- Caratterizzazione dei recettori gluco-articolati e dei siti di legame del DNA.
- Dimostrazione della procedura da parte di un ricercatore post-dottorato.
Principali risultati
- Preparazione con successo della cromatina di grado ChIP dal tessuto muscolare scheletrico resistente.
- Identificazione di siti di legame del DNA chiave rilevanti per la regolazione genica muscolare.
- Approfondimenti sui meccanismi molecolari dell'atrofia muscolare.
- Validazione dell'efficacia del metodo per future ricerche.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato migliora lo studio della regolazione genica nel muscolo scheletrico.
- Fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la biologia muscolare.
- Le future applicazioni potrebbero portare a una migliore comprensione dell'atrofia muscolare e delle condizioni correlate.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Preparing high-quality chromatin from physically resistant tissues like skeletal muscle remains a bottleneck in epigenetic target validation. This protocol enables reproducible isolation of nuclei and sonication of chromatin suitable for immunoprecipitation, supporting mechanistic de-risking of transcription factor and histone modifier targets in muscle-related disease models. By providing a scalable, standardized approach to ChIP-grade chromatin preparation, it enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on skeletal muscle pathophysiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulation in skeletal muscle fibers to validate targets involved in atrophy and metabolic pathways.
- Operational Value: Delivers consistent chromatin yields from resistant tissue, reducing variability in target engagement assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces ChIP-ready chromatin for high-throughput screening of compounds affecting epigenetic regulators in muscle.
- Operational Value: Standardized nuclei purification and sonication steps support assay reproducibility across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by mapping histone modifications and transcription factor occupancy in disease-relevant muscle models.
- Operational Value: Enables longitudinal chromatin analysis from frozen tissue, supporting preclinical continuity and target validation across study phases.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum by enabling chromatin preparation for target validation, followed by immunoprecipitation and sequencing to inform lead identification and preclinical assessment of epigenetic modulators in skeletal muscle.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene regulatory mechanisms in muscle atrophy and metabolic disease models.
- Screening: Provides standardized chromatin substrate for evaluating compound effects on epigenetic targets.
- Analytics: Generates quantitative ChIP-seq readouts for comparing target binding across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage epigenetic findings to preclinical validation through consistent chromatin preparation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nuclei isolation and chromatin preparation platform for skeletal muscle epigenetics programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing noise from non-muscle cell chromatin in skeletal muscle samples.
- Operational Value: Increases throughput through rapid mechanical homogenization, enabling processing of multiple samples in short timeframes.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions in epigenetic target programs by providing reliable muscle-specific chromatin data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible epigenetic profiling in disease-relevant tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization, nuclei isolation, and chromatin handling to avoid degradation.
- Depends on access to sonication equipment optimized for chromatin fragmentation without overheating.
- Necessitates standardized buffer conditions and filtration steps to ensure reproducibility across users and sites.
- Must account for tissue-specific variables such as fiber type and injury status when applying the protocol to disease models.
- Practical limitations include the need for careful optimization of sonication time and temperature to achieve optimal fragment size.
