Name: Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Impara un protocollo ottimizzato per la preparazione di cromatina ChIP-grade dal muscolo scheletrico di topo adulto. Questo metodo supera le sfide poste dal tessuto resistente e ricco di proteine strutturali per studiare la regolazione genica.

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Ringraziamo tutto il personale della struttura di sequenziamento di IGBMC elevato throughput, un membro del Consorzio "Francia Génomique" (ANR10-INBS-09-08) e tutti i servizi generali di IGBMC in particolare il personale della struttura animale IGBMC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal CNRS, INSERM, l'AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, i francesi dichiarano fondo attraverso l'ANR nell'ambito del programma d'Avenir Investissements etichettati ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e il ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Santiago è stata sostenuta dal Ligue Nationale contre le Cancer, ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U dal Ministère de l'enseignement et de la Recherche. ID è un 'équipe labellisée' della Ligue Nationale contre le Cancer.

topi sono stati mantenuti in conformità con le linee guida istituzionali per quanto riguarda la cura e l'uso degli animali da laboratorio e conformemente alle linee guida nazionali di cura degli animali (Commissione europea direttiva 86/609/CEE; Decreto francese n. 87-848). Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico nazionale francese.
 1. isolamento del tessuto muscolare <ol><li>sacrificio un adulto 6 a 8-settimana-vecchio mouse da dislocazione cervicale. Sterlise l'arto sciacquandolo con etanolo al 70% e sezionare i muscoli dell'arto (Gastrocnemius, Tibialis Anterior, quadricipiti) utilizzando forbici punta fine e forcipe. 
	Nota: Un mouse dovrebbe produrre circa 500 mg di tessuto.</li>
	<li>Tritare i muscoli in una provetta da 2 mL contenente 1 mL di tampone ipotonico ghiacciata ad una preparazione omogenea di piccoli (&#60; 2-3 mm 3) pezzi utilizzando bene le forbici e lasciare il tubo agitazione su un agitatore di panca superiore a 4 ° C per 5-10 min</li>
</ol> 2. Lisi del tessuto Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
<ol><li>Trasferire l'omogeneizzato in una provetta di turno-fondo 14 mL e risospendere in 5 mL di tampone ipotonico freddo (inibitore della proteasi EDTA-free cocktail e PMSF).
	<ol><li>Homogenise tessuto muscolare macinate utilizzando un lisata sciolto (20-30 colpi entro 3 min) o un omogeneizzatore meccanica del tessuto per 15-30 s in tubi di turno-fondo 14 mL. 
		Nota: L'efficienza di lisi può essere valutato in questa fase da microscopia chiara, e se necessario, possono essere eseguite ulteriori disagi.</li>
	</ol></li> <li>Trasferire l'omogeneizzato per provette da 15 mL e riempire il volume a 10 mL utilizzando buffer ipotonico freddo. Difficoltà l'omogeneizzato come descritto di seguito prima di procedere con il prossima mouse.</li>
</ol> 3. Fissazione <ol><li>aggiungere formaldeide all'1% di concentrazione finale e agitare per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M in ogni tubo per fermare la fissazione e agitare per 5-10 min a temperatura ambiente.</li>
</ol> 4. Preparazione di nuclei Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
<ol><li>Homogenise la fissa lisato utilizzando un lisata sciolto (5-10 colpi).
	<ol><li>Trasferimento a un tubo da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C per ottenere nuclei e detriti cellulari.</li>
	</ol></li> <li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in fresco 5 mL di tampone ipotonico. Filtrare il lisato attraverso un colino di cella di 70 µm in una provetta da 50 mL. Filtrare nuovamente il filtrato attraverso un colino di cella di 40 µm.</li>
	<li>Trasferire il filtrato in una provetta da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 ° C per ottenere la pallina nucleare. 
	Nota: In questa fase, i nuclei possono essere immediatamente sonicati o snap congelato come un pellet asciutto in azoto liquido e conservato a -80 ° C.</li>
</ol> 5. Sonicazione <ol><li>valutare il volume del pellet nucleare (circa 50 µ l per meccanici e lisata omogeneizzazione) e risospendere esso in tampone di sonicazione fino a 3 o 4 volte di volume nucleare ricco e trattare con ultrasuoni per 10-15 min a 4 ° C, utilizzando un sonicatore . 
	Nota: La cromatina può essere analizzata immediatamente come descritto di seguito (6) o congelata e conservata a -80 ° C.</li>
</ol> 6. Valutare la dimensione del frammento di cromatina dopo sonicazione Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
<ol><li>a de-reticolare, prendere 30 µ l di cromatina in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 20 µ l 5m NaCl. Completano il volume a 500 µ l e incubare a 65 ° C durante la notte.
	<ol><li>Il giorno successivo, eseguire un trattamento con proteinasi K di 1 µ l (20 mg/mL di brodo), 10 µ l 2 M Tris pH 6,8 e 10 µ l di EDTA 0.5 M per 1 h a estrazione di eseguire un fenolo-cloroformio/cloroformio 42 ° C. e precipitare il DNA con 1 volume di sodio acetato e (3 M) e 2 volumi di etanolo al 100% per una h a-80 ° C, o a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Pellet il DNA mediante centrifugazione a 13.500 x g per 15 min. decantare il supernatante e lavare la pallina accuratamente con etanolo 70% freddo e centrifugare nuovamente per 5 min, decantare il supernatante e asciugare all'aria il pellet.</li>
	<li>Risospendere il pellet in volume originale (30 µ l) di buffer di TE. Misurare la concentrazione di DNA allo spettrofotometro di assorbanza a 260 nm/280 nm. Pipettare 500-1.000 ng di DNA con una scaletta di formato di DNA su corsie separate di un gel di agarosio 1.5% ed eseguire l'elettroforesi per valutare la dimensione del frammento della cromatina. 
	Nota: Dimensione del frammento deve essere compresa tra 200-500 paia di basi e non ci dovrebbe essere nessun frammento rilevabile ad alto peso molecolare corrispondente a non o mal-frammentato DNA. Se necessario, la soluzione della cromatina (passo 5) può essere ri-sonicata per un tempo più lungo e quindi analizzata nuovamente come descritto sopra, fino ad ottenuta la dimensione ottimale.</li>
</ol> 7. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.
<ol><li>Perle di sepharose blocco della proteina G di aliquotare 1 mL del liquame 50% in etanolo. Pellet i branelli mediante centrifugazione a 400 x g per 1 min in un benchtop centrifugare e lavare con 1 mL di TE buffer centrifuga a 400 x g e ripetere il wash.
	<ol><li>Dopo la seconda centrifugazione, risospendere in 1 mL di tampone di diluizione di ChIP con 25 µ l di BSA (stock 20 mg/mL) e 20 µ l lievito tRNA (stock 10 mg/mL). Bloccare le perline per almeno 2 h prima dell'uso di rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C.</li>
		<li>Diluire 50 µ g di cromatina (passo 5) 8-10 volte con tampone di diluizione dei ChIP. Aggiungere 50 µ l di liquami tallone bloccato e incubare per 2 h rotante (40-60 rpm) a 4 ° C. centrifuga a 400 x g a 4 ° C per ottenere pre-sgomberata cromatina e trasferirlo in una nuova provetta.</li>
	</ol></li> <li>Per immunoprecipitazione, aggiungere la quantità appropriata di anticorpo primario (ad es., 1-2 µ g / 10 µ g di cromatina) e incubare per una notte con rotazione a 4 ° C. 
	Nota: La quantità ottimale di anticorpo può essere raccomandata dal fornitore o può essere determinata empiricamente eseguendo ChIP-qPCR con diverse quantità di anticorpo fino ad arricchimento ottima è osservare. Anche proteine G sepharose può essere sostituita da proteina A sepharose a seconda del sottotipo di anticorpo usato.</li>
	<li>Aggiungere le perline bloccate il giorno successivo e incubare per 1 h con rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C. centrifuga a 400 x g per 20-30 s a pellet le perline, rimuovere il supernatante e avviare il ChIP lava.</li>
	<li>ChIP lavaggi: eseguire i seguenti lavaggi con i buffer: una volta con tampone salino di basso e poi due volte con tampone salino elevato, due volte con tampone di LiCl e infine due volte con il tampone TE.
	<ol><li>Eseguire ogni lavaggio per 10 min con rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C e pellet le perline tra ogni lavaggio mediante centrifugazione a 400 x g per 20-30 secondi in una centrifuga da banco.</li>
	</ol></li> <li>Per eluizione, rimuovere l'ultimo lavaggio e risospendere le perle in 250 µ l di tampone di eluizione (preparata) per 15 min a temperatura ambiente agitando.</li>
	<li>Centrifuga a 400 x g e raccogliere l'eluato in una nuova provetta. Eseguire questo passaggio due volte e quindi de-crosslink l'eluato durante la notte con 20 µ l NaCl 5 M e 1 µ l della RNasi A (10 mg/mL), trattare con proteinasi K e cloroformio/del fenolo-cloroformio extragire come nel passaggio 6.</li>
	<li>Risospendere in 50 µ l di buffer di TE e utilizzare le aliquote per ChIP-qPCR secondo protocolli standard 15 per controllare la qualità del ChIP.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li>
<li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAF4%2C+a+subunit+of+transcription+factor+II+D%2C+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613(2014).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530(2010).</li>
<li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOhkawa%2C+Y+%22Myogenesis%3A+Methods+and+protocols%22">Myogenesis: Methods and protocols</a>. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).</li>
<li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513(2012).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li>
<li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li>
<li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Qui descriviamo un romanzo protocollo per la preparazione della cromatina da muscoli scheletrici topo adulto e dimostrano che la cromatina è adatta per gli esperimenti di ChIP che rilevano associazione di fattore di trascrizione e modificazioni istoniche covalente nei nuclei della fibra di muscolo. Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la rottura del tessuto che possa essere eseguita mediante lisata o tosatura meccanica. Cesoia meccanica è più veloce e più riproducibile e pertanto è il metodo di ...

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e sequenziamento ad alta (ChIP-seq) sono diventati i metodi di scelta per lo studio di trascrizione e regolazione epigenetica dell'espressione genica in vari tessuti e tipi di cellule1. Questa tecnica permette di genoma profilatura di modificazioni covalenti della cromatina, occupazione variante dell'istone e fattore di trascrizione associazione2,3.
Mentre l'esecuzione di ChIP da cellule coltivate è ben consolidata, ChIP da tessuti di mammiferi rimane più impegnativo. Preparazione della cromatina per ChIP prevede diversi passaggi critici che devono essere ottimizzate per ogni tipo di tessuti e cellule. Cromatina può essere preparata da lisati cellulari delle cellule coltivate o seguente purificazione dei loro nuclei. Nel caso di tessuti di mammiferi, efficiente Lisi, fissazione di formaldeide e purificazione dei nuclei sono fondamentali al fine di garantire un recupero ottimale della cromatina. Inoltre, la scelta se risolvere i nuclei prima o dopo la loro purificazione deve essere determinato sperimentalmente. Nonostante questi ostacoli, il ChIP è stato eseguito con successo da tessuti quali fegato, testicolo o cervello4,5,6. Nel caso del muscolo scheletrico, la rottura di un tessuto resistente fisicamente, che esibisce un alto contenuto di proteine strutturali e l'isolamento dei suoi nuclei è particolarmente impegnativa. Data questa specificità, protocolli ottimizzati per altri tessuti non danno risultati soddisfacenti per i muscoli scheletrici.
Qui descriviamo un protocollo per isolare la cromatina ChIP-grado da tessuto muscolare scheletrico del mouse che coinvolge fisicamente interrompendo il tessuto, fissazione di formaldeide e quindi l'isolamento dei nuclei e sonicazione. L'efficienza di questo metodo per preparare cromatina adatta per ChIP da questo tessuto è stato dimostrato eseguendo ChIP-qPCR e ChIP-seq per vari fattori di trascrizione, RNA polimerasi II e istone covalente modifiche7.
Questa nuova tecnica è molto più veloce di un protocollo precedentemente segnalati8 composto da lunghi passaggi di digestione della collagenosi durante i quali, cambiamenti nella localizzazione genomica dei fattori di trascrizione e le alterazioni nell'espressione genica possono aver luogo. La rapidità con cui i nuclei sono isolati e fissa rende particolarmente attraente per preparare della cromatina che cattura più fedelmente lo stato nativo occupazione genomico il metodo qui descritto. Inoltre, anche se hanno altri metodi per l'estrazione di isolamento o proteine della cromatina da tessuto muscolare sono stato descritto8,9,10 e utilizzato per esperimenti di ChIP-qPCR su geni selezionati, nessun ChIP-seq dati sono stati segnalati li utilizzano. Il metodo segnalato qui è adatto per la modifica di fattore e istone trascrizione ChIP-seq e quindi dovrebbe anche essere adatto per 3 / 4C o applicazioni di acquisizione di HiC cromatina conformazione.

<table><tbody><tr><td>T 25 digitale ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi Cocktail-EDTA Free</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteina G Perle di sefarosio</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide Grado EM</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific 12091039</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>lievito tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno Blu</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Anticorpo</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Ultrasuoni focalizzati</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Articoli aggiuntivi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi Falcon da 15 ml e 50 ml</td> Tubi <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>a<td>fondo tondo da 14 ml</td></tr><tr><td>Tubi Eppendorf</td><td></td><td></td><td></td>da 1,5 ml e 2 ml</tr><tr><td> m e 40 &mu; filtri cellulari m (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal mouse del muscolo scheletrico

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Descriviamo un protocollo efficiente e riproducibile per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico di topo adulto, un tessuto fisicamente resistente con un alto contenuto di proteine strutturali. Muscoli degli arti sezionati da topi adulti fisicamente sono interrotte da omogeneizzazione meccanica, o una combinazione di macinazione e douncing, in un buffer ipotonico prima della fissazione della formaldeide del lysate delle cellule. I nuclei fissi sono purificati da ulteriori cicli di omogeneizzazione meccanica o douncing e filtrazioni sequenziale per rimuovere i detriti cellulari. I nuclei purificati possono essere sonicati immediatamente o in una fase successiva dopo il congelamento. La cromatina può essere sonicata in modo efficiente ed è adatto per esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina, come illustrato dai profili ottenuto per fattori di trascrizione, la RNA polimerasi II e modificazioni istoniche covalente. L'associazione di eventi rilevati utilizzando la cromatina preparata dal presente protocollo è principalmente quelli che si svolgono nei nuclei della fibra di muscolo nonostante la presenza di cromatina da altro satellite fibra-collegato e cellule endoteliali. Questo protocollo è pertanto adattato per studiare la regolazione genica in muscolo scheletrico del topo adulto.

Per isolare i nuclei, abbiamo effettuato omogeneizzazione meccanica del tessuto del muscolo dissecato e macinate per s o 15 o 45, a 18.000 e 22.000 giri/min (Vedi Tabella materiali). In tutte le condizioni, i nuclei hanno potevano essere separati dai detriti dei tessuti, ma la resa è stata ottima usando la velocità più bassa (Figura 1A-B). I nuclei potrebbero anche essere preparati da douncing per 3-5 min (<strong class="xfig...

Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.

Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare la cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla regolazione genica e sulle fibre muscolari scheletriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la preparazione della cromatina di grado ChIP dal muscolo scheletrico del topo.Un tessuto fisicamente resistente con un alto contenuto di proteine strutturali. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo cercando di caratterizzare i meccanismi molecolari alla base dell'atrofia muscolare dell'uso del glucosio-articolato, che richiede l'identificazione del recettore del glucosio-articolato, dei siti di legame del DNA nelle fibre muscolari scheletriche del topo. A dimostrare la procedura sarà Shilpy Joshi, un post-doc del nostro laboratorio.Per iniziare questa procedura, recuperare i muscoli degli arti posteriori congelati o appena sezionati. Successivamente, tritare i muscoli in una provetta da due millilitri, contenente un millilitro di tampone ipotonico ghiacciato fino a una preparazione omogenea di piccoli pezzi, utilizzando delle forbici sottili. Successivamente, lasciare ag

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Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Descriviamo un metodo robusto per immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule T primarie. Il metodo si basa su approcci standard, ma utilizza uno specifico insieme di condizioni e reagenti che migliorano l'efficienza per una limitata quantità di cellule. Importante, una descrizione dettagliata della fase di analisi dei dati è presentato.

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

Un regolamento messa a punto della trascrizione genica alla base embrionali decisione destino della cellula. Qui, descriviamo immunoprecipitazione della cromatina utilizzati per indagare regolazione epigenetica di entrambi differenziazione cardiaca delle cellule staminali e sviluppo cardiaco di embrioni di topo.

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

Questo lavoro descrive un protocollo per l'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) usando una linea cellulare T-cellula matura. Questo protocollo è idoneo per indagare la distribuzione di marchi specifici di istoni in siti specifici di promozione o nel genoma.

Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

Presentiamo un protocollo basato sulla filtrazione per isolare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico del mouse a croce, in cui abbiamo rimosso la necessità di ultracentrifugazione, rendendola facilmente applicabile. Mostriamo che la cromatina preparata dai nuclei è adatta per l'immunoprecipitazione di cromatina e probabilmente gli studi di sequenza di immunoprecipitazione cromatina.

Un metodo basato sulla filtrazione per preparare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico incrociato per l&#39;immunoprecipitazione cromatina

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Qui, descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione della cromatina degli istoni modificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae. DNA immunoprecipitato viene successivamente utilizzato per PCR quantitativa per interrogare l'abbondanza e la localizzazione di modifiche post-traduzionali degli istoni in tutto il genoma.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae

Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

L'immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell'ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

Questo protocollo si concentra sulla preparazione della cromatina da tessuti congelati a scatto ed è adatto per l'immunoprecipitazione della cromatina reticolante (X-ChIP) seguita da analisi quantitative PCR (X-ChIP-qPCR) o approcci di sequenziamento di nuova generazione (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Di seguito viene presentato un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti di cellule di arto di topo (FACS) attivato dalla fluorescenza, adattato allo studio della regolazione della trascrizione nelle fibre muscolari mediante scissione sotto bersagli e rilascio mediante nucleasi (CUT&amp;RUN).

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&amp;RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Impara un protocollo ottimizzato per la preparazione di cromatina ChIP-grade dal muscolo scheletrico di topo adulto. Questo metodo supera le sfide poste dal tessuto resistente e ricco di proteine strutturali per studiare la regolazione genica.

Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico

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