Automatizzare esperimenti ChIP-seq per generare profili epigenetici su 10.000 cellule HeLa

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire ai ricercatori una piattaforma automatizzata in grado di eseguire esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina su sole 10.000 cellule. Ciò si ottiene preparando prima la cromatina tranciata di alta qualità per l'immunoprecipitazione della cromatina. Nella seconda fase, viene creato un esperimento automatizzato di immunoprecipitazione della cromatina e vengono eseguite librerie automatizzate con il DNA immunoprecipitato.

Il DNA immunoprecipitato viene analizzato mediante PCR quantitativa e sequenziamento di nuova generazione. In definitiva, il successo della tecnologia automatizzata può essere convalidato attraverso il confronto dei profili di sequenza di immunoprecipitazione della cromatina generati sul campione originale di 10.000 cellule con gli esperimenti eseguiti su 100.000 cellule e i set di dati esistenti come riferimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo epigenetico per approfondire la nostra comprensione delle funzioni di specifici biomarcatori in vari tessuti.

Fasi di sviluppo e stati patologici. Questa tecnica ha implicazioni per la diagnosi di molteplici malattie in quanto aiuterà a identificare biomarcatori epigenetici in salute e malattia, accurati e affidabili. Le tecnologie automatiche sono strumenti importanti per i ricercatori nell'analisi epigenetica di specifici tipi di cellule, sottopopolazioni e biopsie.

Per un esperimento di immunoprecipitazione della cromatina standard, si inizia aggiungendo 120 microlitri di tampone di immunoprecipitazione della cromatina H a 100 microlitri di cromatina tranciata da uno a 2 milioni di cellule, riservando da due a 20 microlitri di cromatina per il campione in ingresso. Quindi, per impostare l'esperimento automatizzato sul compatto IP star, selezionare i protocolli e fare clic sull'icona di immunoprecipitazione della cromatina. Scegli il metodo diretto di immunoprecipitazione della cromatina, quindi nella schermata successiva, scegli il protocollo di immunoprecipitazione della cromatina da 200 microlitri e specifica il numero del campione.

Impostare i parametri sperimentali di immunoprecipitazione della cromatina a quattro ore per il rivestimento dell'anticorpo. Passaggio 15 ore per la fase di immunoprecipitazione e cinque minuti per ogni fase di lavaggio. Quindi impostare i reagenti seguendo le istruzioni visualizzate nella schermata delle informazioni sul layout e aggiungere i reagenti appropriati e gli anticorpi di grado ChIP-seq altamente convalidati.

Quindi aggiungere 20 microlitri di proteine, perle magnetiche rivestite A per ogni reazione e i campioni di cromatina dopo il protocollo del chip notturno e la reticolazione inversa sono terminati. Purifica il DNA con un kit di purificazione del DNA basato su biglie magnetiche. Utilizzare un test fluorimetrico commerciale altamente sensibile per quantificare il DNA immunoprecipitato.

Successivamente, utilizzando primer per almeno una regione genomica di controllo positiva e una negativa. Analizzare la qualità del DNA immunoprecipitato mediante PCR quantitativa secondo i parametri appropriati dei materiali per l'analisi. I risultati sono espressi come percentuale del recupero dell'input per il sequenziamento di nuova generazione secondo i protocolli.

Ora fai clic sull'icona di preparazione della libreria, quindi scegli la tecnologia di preparazione della libreria preferita e imposta i reagenti secondo le istruzioni nella schermata delle informazioni sul layout. Ad esempio, in questo esperimento, sono stati generati profili di sequenziamento per sei diverse modificazioni istoniche associate all'espressione genica. L'elevata correlazione di picco osservata tra questi marcatori istonici indica la capacità del sistema automatizzato di generare dati accurati e affidabili.

Inoltre, questi grafici mostrano la distribuzione dei picchi per le diverse modificazioni istoniche in specifiche regioni genomiche. Infine, per un esperimento automatizzato di immunoprecipitazione della cromatina per campioni con un basso numero di cellule, impostare il protocollo di immunoprecipitazione automatizzata della cromatina da 200 microlitri sul sistema di automazione come appena dimostrato. Successivamente, caricare il sistema con il ChIP-seq, gli anticorpi di grado e i reagenti ottimizzano per lavorare su quantità di cromatina comprese tra 10.000 e 100.000 cellule utilizzando solo 10 microlitri di proteine, perle magnetiche rivestite A per ogni reazione.

Dopo il chip, eseguire la preparazione della libreria, selezionare il protocollo di preparazione della libreria micro plex e impostare i reagenti seguendo le istruzioni visualizzate nella schermata delle informazioni sul layout. In questa PCR quantitativa rappresentativa di un'immunoprecipitazione della cromatina da un campione iniziale di 10.000 cellule, sono stati osservati arricchimenti significativi con gli anticorpi anti-istone nelle regioni di controllo positive e segnali trascurabili nelle regioni di controllo negativo. Qui viene mostrata una serie di 10 reazioni di immunoprecipitazione riproducibili e altamente comparabili con un esperimento manuale di immunoprecipitazione della cromatina, dimostrando la capacità del sistema automatizzato di lavorare con basse quantità di cellule senza alcun aumento visibile della variabilità dell'esperimento rispetto all'immunoprecipitazione manuale.

Questi dati illustrano le analisi bioinformatiche delle librerie di sequenze di 10.000 e 100.000. Ha una S3 cellule dopo l'immunoprecipitazione della cromatina, dimostrando risultati eccezionali dai campioni di immunoprecipitazione della cromatina a basso numero di cellule. Questo set di dati, che corrisponde all'esperimento con 10.000 celle di materiale di partenza, contiene un basso rumore di fondo con picchi di arricchimento altamente affidabili che sono confermati sia dal set di dati da 100.000 celle che dal set di dati di riferimento del Broad Institute.

Per il progetto encode, è importante notare che i dati di 10.000 celle dimostrano picchi quasi identici ai dati del Broad Institute con un rapporto di sovrapposizione del 98% del miglior 40% dei picchi classificati in base al punteggio significativo utilizzato nel progetto di codice finale. Il sistema automatizzato IP star richiede un intervento minimo da parte dell'operatore, riducendo il tempo di HandsOn dell'immunoprecipitazione della cromatina a sole una o due ore. Inoltre, il processo automatizzato sostituisce le numerose fasi soggette a errori dell'immunoprecipitazione manuale della cromatina e fornisce risultati altamente coerenti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la buona immunoprecipitazione della cromatina e una buona selezione di anticorpi altamente specifici e sensibili sono fondamentali per il successo dell'esperimento. Questa tecnologia ha aperto la strada ai ricercatori in ogni campo della biologia per migliorare l'accuratezza, la riproducibilità e la coerenza della terapia. Studi di epigenetica.