Automatizzare esperimenti ChIP-seq per generare profili epigenetici su 10.000 cellule HeLa
10 dicembre 2014
I metodi per mappare le interazioni proteina-DNA in vivo stanno diventando cruciali per ogni aspetto della ricerca genomica, ma sono laboriosi, costosi e richiedono tempo. Qui viene presentato un sistema robotico di manipolazione dei liquidi disponibile in commercio che automatizza l'immunoprecipitazione della cromatina per mappare le interazioni proteina-DNA in vivo con quantità limitate di cellule.
L'obiettivo generale di questa procedura è fornire ai ricercatori una piattaforma automatizzata in grado di eseguire esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina su sole 10.000 cellule. Ciò si ottiene preparando prima la cromatina tranciata di alta qualità per l'immunoprecipitazione della cromatina. Nella seconda fase, viene creato un esperimento automatizzato di immunoprecipitazione della cromatina e vengono eseguite librerie automatizzate con il DNA immunoprecipitato.
Il DNA immunoprecipitato viene analizzato mediante PCR quantitativa e sequenziamento di nuova generazione. In definitiva, il successo della tecnologia automatizzata può essere convalidato attraverso il confronto dei profili di sequenza di immunoprecipitazione della cromatina generati sul campione originale di 10.000 cellule con gli esperimenti eseguiti su 100.000 cellule e i set di dati esistenti come riferimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo epigenetico per approfondire la nostra comprensione delle funzioni di specifici biomarcatori in vari tessuti.
Fasi di sviluppo e stati patologici. Questa tecnica ha implicazioni per la diagnosi di molteplici malattie in quanto aiuterà a identificare biomarcatori epigenetici in salute e malattia, accurati e affidabili. Le tecnologie automatiche sono strumenti importanti per i ricercatori nell'analisi epigenetica di specifici tipi di cellule, sottopopolazioni e biopsie.
Per un esperimento di immunoprecipitazione della cromatina standard, si inizia aggiungendo 120 microlitri di tampone di immunoprecipitazione della cromatina H a 100 microlitri di cromatina tranciata da uno a 2 milioni di cellule, riservando da due a 20 microlitri di cromatina per il campione in ingresso. Quindi, per impostare l'esperimento automatizzato sul compatto IP star, selezionare i protocolli e fare clic sull'icona di immunoprecipitazione della cromatina. Scegli il metodo diretto di immunoprecipitazione della cromatina, quindi nella schermata successiva, scegli il protocollo di immunoprecipitazione della cromatina da 200 microlitri e specifica il numero del campione.
Impostare i parametri sperimentali di immunoprecipitazione della cromatina a quattro ore per il rivestimento dell'anticorpo. Passaggio 15 ore per la fase di immunoprecipitazione e cinque minuti per ogni fase di lavaggio. Quindi impostare i reagenti seguendo le istruzioni visualizzate nella schermata delle informazioni sul layout e aggiungere i reagenti appropriati e gli anticorpi di grado ChIP-seq altamente convalidati.
Quindi aggiungere 20 microlitri di proteine, perle magnetiche rivestite A per ogni reazione e i campioni di cromatina dopo il protocollo del chip notturno e la reticolazione inversa sono terminati. Purifica il DNA con un kit di purificazione del DNA basato su biglie magnetiche. Utilizzare un test fluorimetrico commerciale altamente sensibile per quantificare il DNA immunoprecipitato.
Successivamente, utilizzando primer per almeno una regione genomica di controllo positiva e una negativa. Analizzare la qualità del DNA immunoprecipitato mediante PCR quantitativa secondo i parametri appropriati dei materiali per l'analisi. I risultati sono espressi come percentuale del recupero dell'input per il sequenziamento di nuova generazione secondo i protocolli.
Ora fai clic sull'icona di preparazione della libreria, quindi scegli la tecnologia di preparazione della libreria preferita e imposta i reagenti secondo le istruzioni nella schermata delle informazioni sul layout. Ad esempio, in questo esperimento, sono stati generati profili di sequenziamento per sei diverse modificazioni istoniche associate all'espressione genica. L'elevata correlazione di picco osservata tra questi marcatori istonici indica la capacità del sistema automatizzato di generare dati accurati e affidabili.
Inoltre, questi grafici mostrano la distribuzione dei picchi per le diverse modificazioni istoniche in specifiche regioni genomiche. Infine, per un esperimento automatizzato di immunoprecipitazione della cromatina per campioni con un basso numero di cellule, impostare il protocollo di immunoprecipitazione automatizzata della cromatina da 200 microlitri sul sistema di automazione come appena dimostrato. Successivamente, caricare il sistema con il ChIP-seq, gli anticorpi di grado e i reagenti ottimizzano per lavorare su quantità di cromatina comprese tra 10.000 e 100.000 cellule utilizzando solo 10 microlitri di proteine, perle magnetiche rivestite A per ogni reazione.
Dopo il chip, eseguire la preparazione della libreria, selezionare il protocollo di preparazione della libreria micro plex e impostare i reagenti seguendo le istruzioni visualizzate nella schermata delle informazioni sul layout. In questa PCR quantitativa rappresentativa di un'immunoprecipitazione della cromatina da un campione iniziale di 10.000 cellule, sono stati osservati arricchimenti significativi con gli anticorpi anti-istone nelle regioni di controllo positive e segnali trascurabili nelle regioni di controllo negativo. Qui viene mostrata una serie di 10 reazioni di immunoprecipitazione riproducibili e altamente comparabili con un esperimento manuale di immunoprecipitazione della cromatina, dimostrando la capacità del sistema automatizzato di lavorare con basse quantità di cellule senza alcun aumento visibile della variabilità dell'esperimento rispetto all'immunoprecipitazione manuale.
Questi dati illustrano le analisi bioinformatiche delle librerie di sequenze di 10.000 e 100.000. Ha una S3 cellule dopo l'immunoprecipitazione della cromatina, dimostrando risultati eccezionali dai campioni di immunoprecipitazione della cromatina a basso numero di cellule. Questo set di dati, che corrisponde all'esperimento con 10.000 celle di materiale di partenza, contiene un basso rumore di fondo con picchi di arricchimento altamente affidabili che sono confermati sia dal set di dati da 100.000 celle che dal set di dati di riferimento del Broad Institute.
Per il progetto encode, è importante notare che i dati di 10.000 celle dimostrano picchi quasi identici ai dati del Broad Institute con un rapporto di sovrapposizione del 98% del miglior 40% dei picchi classificati in base al punteggio significativo utilizzato nel progetto di codice finale. Il sistema automatizzato IP star richiede un intervento minimo da parte dell'operatore, riducendo il tempo di HandsOn dell'immunoprecipitazione della cromatina a sole una o due ore. Inoltre, il processo automatizzato sostituisce le numerose fasi soggette a errori dell'immunoprecipitazione manuale della cromatina e fornisce risultati altamente coerenti.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la buona immunoprecipitazione della cromatina e una buona selezione di anticorpi altamente specifici e sensibili sono fondamentali per il successo dell'esperimento. Questa tecnologia ha aperto la strada ai ricercatori in ogni campo della biologia per migliorare l'accuratezza, la riproducibilità e la coerenza della terapia. Studi di epigenetica.
Panoramica
Questo articolo presenta una piattaforma automatizzata per l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in grado di elaborare in modo efficiente un numero ridotto di cellule, specificamente 10.000 cellule. Il metodo ha lo scopo di semplificare la mappatura delle interazioni proteina-DNA, fondamentale per la ricerca genomica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Genomica
- Epigenetica
- Tecniche di laboratorio automatizzate
Sfondo
- Le interazioni proteina-DNA sono fondamentali per comprendere la regolazione genica.
- I metodi tradizionali di ChIP sono laboriosi e richiedono un elevato numero di cellule.
- L'automazione può migliorare l'efficienza e la riproducibilità negli esperimenti genomici.
- Questo studio si concentra su un sistema robotico che riduce al minimo l'intervento manuale.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo ChIP automatizzato per un basso numero di cellule.
- Convalidare l'efficacia del sistema automatizzato rispetto ai metodi tradizionali.
- Facilitare l'identificazione di biomarcatori epigenetici nello stato di salute e di malattia.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di cromatina tagliata di alta qualità da 10.000 cellule.
- Automazione del processo ChIP mediante un sistema robotizzato per la manipolazione di liquidi.
- Analisi del DNA immunoprecipitato mediante PCR quantitativa e sequenziamento di nuova generazione.
- Confronto dei risultati con dati ottenuti da campioni cellulari più grandi e set di dati esistenti.
Risultati principali
- Il sistema automatizzato ha prodotto risultati affidabili e riproducibili, paragonabili ai metodi manuali.
- È stato osservato un significativo arricchimento delle modifiche istoniche nelle regioni di controllo positivo.
- Un'elevata correlazione con i set di dati di riferimento ha indicato l'accuratezza dell'approccio automatizzato.
- Un intervento minimo dell'operatore ha ridotto notevolmente il tempo di manipolazione.
Conclusioni
- Il metodo ChIP automatizzato è efficace con un numero ridotto di cellule.
- Questa tecnologia può favorire la ricerca epigenetica e la scoperta di biomarcatori.
- L'automazione migliora la coerenza e l'affidabilità delle analisi genomiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'automazione della ChIP-seq per input cellulari ridotti affronta un collo di bottiglia critico nella validazione di bersagli epigenetici, consentendo una riduzione del rischio meccanicistica delle ipotesi mediante l'uso di popolazioni cellulari primarie scarse o rare. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta generando profili epigenomici riproducibili da campioni limitati, sostenendo la selezione del portafoglio e decisioni guidate da biomarcatori. La tecnologia posiziona i saggi epigenomici come strumenti di scoperta scalabili e riutilizzabili, allineati alla continuità traslazionale dall'identificazione del bersaglio alla validazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche e la chiarificazione di percorsi molecolari mediante il profilo delle modifiche istoniche ottenuto da campioni con basso input.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico e la validazione funzionale dei bersagli generando dati ChIP-seq riproducibili a partire da 10.000 cellule.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio progettuale attraverso letture epigenomiche affidabili che si correlano con set di dati di riferimento e parametri di confronto manuali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo flussi di lavoro ChIP-seq standardizzati e automatizzabili.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione del saggio, riproducibilità e risultati quantitativi mediante automazione basata su microsferette magnetiche e letture qPCR/NGS.
- Scalabilità: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma grazie a un ridotto tempo di manipolazione manuale e a un intervento minimo dell'operatore.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Discute la rilevanza delle malattie attraverso l'identificazione di biomarcatori epigenetici in stati di salute e di malattia utilizzando il sequenziamento ChIP con un numero ridotto di cellule.
- Allineamento Preclinico: Descrive la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo un profilo epigenomico coerente indipendentemente dalle dimensioni del campione.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta le decisioni mediante dati riproducibili e a basso rumore di fondo, confermati rispetto a set di dati di riferimento ottenuti da 100.000 cellule e ad altri dataset di riferimento.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo automatizzato ChIP-seq si integra nel percorso di scoperta che va dalla verifica delle ipotesi all'identificazione dei candidati, consentendo il profilo epigenomico in fasi precoci con quantità limitate di materiale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi generando profili di modifiche istoniche da input con un basso numero di cellule.
- Screening: Garantisce prontezza del saggio e riproducibilità attraverso la preparazione automatizzata delle librerie e metriche quantitative di recupero del DNA.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative delle variabili dipendenti mediante qPCR (% di recupero del DNA iniziale) e correlazione dei picchi in NGS per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso profili epigenomici allineati a biomarcatori, validati rispetto a dataset ortogonali.
- Riutilizzo aziendale: Configura la piattaforma robotica come una capacità riutilizzabile per saggi epigenetici in diversi progetti, riducendo la ridondanza.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi e riduzione dell'ambiguità meccanicistica negli studi sui meccanismi epigenetici.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità ottenute mediante manipolazione automatica dei liquidi e riduzione al minimo dei passaggi manuali.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione del progetto, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie a dati epigenomici affidabili con basso input.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corretti per il rischio, sostenuti da risultati ChIP-seq riproducibili e correlati a riferimenti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione della cromatina, nella validazione degli anticorpi e nell'uso di sistemi automatizzati per la manipolazione di liquidi.
- Necessita di strumentazione inclusa una piattaforma robotica (ad esempio, IP-Star Compact), gestione di microsferette magnetiche e infrastruttura analitica per qPCR/NGS.
- Richiede standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella selezione degli anticorpi, nella frammentazione della cromatina e nei parametri del protocollo per garantire riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si passa da 10.000 a 100.000 cellule o quando si applica a biopsie primarie e sottopopolazioni cellulari.
- I limiti pratici includono la dipendenza da anticorpi altamente specifici e di alta qualità e una frammentazione ottimale della cromatina per il successo con quantità ridotte di campione.
