Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire la marcatura ImmunoGold per determinare la localizzazione ultra strutturale delle proteine sinaptiche nei neuroni parametallici CA one dell'ippocampo di ratto. Ciò si ottiene rimuovendo prima la regione CA uno della fetta organotipica, tagliando l'angolo superiore per ricordare l'orientamento corretto e incubandola in un fissativo privo di osmio su ghiaccio. Il secondo passo consiste nel disidratare il tessuto fissato e lasciarlo indurire infiltrandolo con la resina.

Successivamente le sezioni ultrasottili vengono tagliate da tessuti incorporati nella resina e posizionate su griglie di nichel. Il passaggio finale consiste nell'eseguire l'immunoistochimica sui tessuti della sezione. In definitiva, la microscopia elettronica immunologica viene utilizzata per determinare la localizzazione delle proteine nella sinapsi. Ok.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della plasticità sinaptica, come ad esempio come le localizzazioni delle proteine all'interno delle spine dendritiche possono aiutare a comprendere il loro ruolo nella funzione sinaptica. Sebbene questo metodo sia ottimizzato per le fette di ippocampo organotipico, può essere estremamente prezioso anche per altre preparazioni neuronali, comprese le fette di cervello acute e le colture neuronali primarie. Inizia questa procedura posizionando la fetta organotipica dell'ippocampo in una capsula di Petri di polistirene contenente il tampone fosfato di sorensen ghiacciato fresco.

Aggiungere altri uno o due millilitri di tampone ghiacciato direttamente sopra le fette. Per isolare il sottocampo della fetta del CA uno, utilizzare un bisturi usa e getta per tagliare delicatamente la fetta accanto al giro dentato, che è parallelo allo strato di una cella CA. Quindi tagliare verticalmente la fetta rimanente per rimuovere il sottocampo CA tre e il sulu.

Quindi, taglia un angolo della fetta CA one per aiutare a identificare la superficie superiore del tessuto e rimuovi con cura il tessuto dalla membrana usando la parte posteriore del bisturi. Trasferire delicatamente il fazzoletto in una piastra a 12 pozzetti contenente il tampone di Sorensen ghiacciato. Rimuovere il tampone e aggiungere da 0,5 a un millilitro di fissativo ghiacciato a pH 7,3 diluito nel tampone di Sorensen in modo che copra adeguatamente il campione.

Quindi incubare per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere il fissativo dal pozzetto e lavare i campioni tre volte per 20 minuti in un tampone di sorensen ghiacciato. Quindi incubare il campione in acido tannico all'1% in peso per volume in tampone malato molare 0,1 a un pH di 6,0.

Dopo 40 minuti, sciacquare via l'acido tannico lavando il campione due volte per 20 minuti nel tampone malato. Successivamente, incubare il campione per 40 minuti in acetato di orinatoio all'1% in malato tampone l'acetato di orinatoio è sensibile alla luce ed è radioattivo. Quindi maneggiare con cura e posizionare il campione al buio a quattro gradi Celsius durante l'incubazione.

Dopo l'incubazione, sciacquare i campioni due volte per 20 minuti ciascuno in tampone di malato ghiacciato, quindi incubare per 20 minuti in cloruro di platino allo 0,5% in tampone di detenzione. Infine, sciacquare via eventuali residui di cloruro di platino lavando due volte per 20 minuti. Ogni tampone dei detenuti conserva i campioni in un tampone di malato a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronti per un'ulteriore elaborazione.

Per iniziare l'immunoistochimica, le regioni CA one fisse vengono prima incorporate in resina disidratata e tagliate per ottenere sezioni ultra sottili a 60 nanometri su griglie di nichel come descritto nel protocollo di testo per questo video. Posizionare quindi una goccia di tampone fosfato all'1% tra 20 a pH 7,5 su un pezzo di paraforma pulita. Quindi raccogliere delicatamente la griglia con una pinza pulita e farla galleggiare sul tampone con la sezione rivolta verso il basso, incubare in questo modo per 10 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione, drenare il liquido in eccesso dalla griglia posizionando la sezione con la parte rivolta verso l'alto sulla carta da filtro.

Inoltre, rimuovere qualsiasi soluzione intrappolata tra i bracci della pinza EM assorbendo delicatamente con una scheggia di carta da filtro, assicurandosi che le sezioni non si asciughino completamente. Quindi posizionare una goccia di glicina da 50 millimolari sulla parapellicola e far galleggiare la sezione della griglia con il lato rivolto verso il basso sulla soluzione di glicina a temperatura ambiente. Mentre il campione cova per 15 minuti, aggiungere il 2,5% di siero dell'animale dell'anticorpo secondario a una soluzione al 2,5% di BSA e posizionare una goccia di questa miscela sul parafilm.

Dopo l'incubazione di 15 minuti, asciugare la griglia con carta da filtro e far galleggiare sulla soluzione bloccante per 30 minuti. A temperatura ambiente, preparare la camera di incubazione posizionando le salviette Kim arrotolate lungo l'interno di una capsula di Petri di plastica pulita. Posizionare un pezzo di param pulito al centro della capsula di Petri e poi aggiungere acqua filtrata alle salviette Kim.

Successivamente, posizionare una goccia della soluzione di anticorpi primari sulla paraforma e far galleggiare il campione su di essa a temperatura ambiente o durante la notte A quattro gradi Celsius, è necessario determinare sperimentalmente il tempo e la temperatura ottimali di incubazione, nonché la concentrazione di anticorpi. Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, lavare la griglia tre volte per due minuti ciascuna con tampone fosfato all'1% tween 20. Quindi incubare con anticorpi secondari utilizzando da uno a 20 anti coniglio o anti-US, accoppiati a oro a 10 nanometri dopo un'ora.

A temperatura ambiente, lavare tre volte per due minuti ciascuna con l'1% di tampone fosfato all'1%. Quindi postfissare il campione in glutaraldeide tamponata al 2% per cinque minuti. Rimuovere l'aldeide gluare in eccesso risciacquando tre volte con un tampone all'1% di interpolazione e 20 fosfati, quindi tre volte con acqua filtrata risciacquando per due minuti ogni volta.

Una volta risciacquato, incubare la griglia in acetato di orinatoio al 2% per 10 minuti. Durante l'incubazione, preparare una camera priva di CO2 posizionando un pezzo di paraforma al centro di una capsula di Petri di vetro. Quindi posizionare da 10 a 15 pellet di idrossido di sodio nella capsula attorno al paraforma per assorbire la CO2 nell'aria.

Tenere la parte superiore chiusa per qualche minuto. Quindi, utilizzare una pipetta da pascolo e trasferire rapidamente un piccolo volume di soluzione di citrato di piombo Reynolds appena preparata nella paraforma. Aprire la parte superiore quanto basta per inserire la pipetta da pascolo per ridurre al minimo la reintroduzione di CO2 nella camera.

In tre piccoli becher, preparare acqua calda e deionizzata appena bollita, lavare via l'acetato dell'orinatoio immergendo la griglia nel primo becco e farla roteare delicatamente per 30 secondi. Ripetere questo passaggio negli altri due becher. Una volta risciacquata, aprire la parte superiore della capsula di Petri in vetro quanto basta per posizionare la griglia sulla goccia di soluzione di citrato di piombo Reynolds.

Se possibile, indossare una maschera mentre lo si fa per evitare di respirare con il citrato di piombo e per prevenire la formazione di un precipitato. Dopo 10 minuti, aprire leggermente la parte superiore e rimuovere la griglia. Lavatelo tre volte immergendolo in sequenza in tre bicchieri freschi di acqua distillata calda.

Quindi lasciare asciugare la griglia su un pezzo di carta da filtro in parti rivolte verso l'alto. Il campione è ora pronto per la visualizzazione con il microscopio elettronico: sezioni di tessuto ultrasottili della regione dell'ippocampo, mostrate qui come una micrografia elettronica a trasmissione, contengono dendriti e spine di neuroni parametallici facilmente distinguibili. L'identificazione di sinapsi asimmetriche tra il terminale assonale designato con una T e le spine dendritiche designate con una S è facilitata dalla presenza di densità post-sinaptica e da una membrana plasmatica ben definita.

La distribuzione di neuro Grandin nelle spine dendritiche può essere vista con l'aiuto dell'etichettatura EM ImmunoGold ed è enfatizzata in queste immagini TEM dalle frecce. La distanza radiale di neuro grandin dal centro della colonna vertebrale alla membrana plasmatica della colonna vertebrale può essere misurata come distanza radiale normalizzata. Una distanza pari a zero corrisponde a una particella che giace sulla membrana e un valore di distanza pari a uno rappresenta una particella al centro della colonna vertebrale.

La distanza di neuro grandin dalla spina dendritica può quindi essere mostrata graficamente. Qui la sua distribuzione come distanza radiale normalizzata è mostrata in blu, e confrontata con una distribuzione casuale mostrata in rosa, questo grafico mostra che il neuro Grandin è localizzato vicino alla membrana plasmatica. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori che studiano il sistema nervoso per esplorare la localizzazione e la distribuzione dei recettori, delle proteine che interagiscono con i recettori, dei trasportatori e dei canali ionici e di molti altri in diversi tessuti cerebrali, tra cui la corteccia, il talamo, il bulbo olfattivo e il cervelletto.

Non dimenticare che lavorare con i fissativi può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come indossare guanti e camice da laboratorio e maneggiare i fissativi nel cappuccio della pellicola dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.