Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

L'obiettivo generale di questo esperimento è sviluppare un nuovo approccio per analizzare in modo quantitativo le proteine di membrana nei sinapsi a ribbon retinici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia retinica, come la localizzazione precisa delle proteine nei sinapsi all'interno del circuito. Il vantaggio principale della tecnica è che consente di stimare il numero, la densità e la rapidità di molteplici proteine nei sinapsi a ribbon retinici.

Per illustrare la procedura di sostituzione criogenica e di sezione ultrasottile, abbiamo collaborato con Ron Petralia e Ya-Xian Wang dell'Advanced Imaging Core del NIDCD. Per iniziare questa procedura, dissezionare un bulbo oculare al microscopio. A tale scopo, rimuovere innanzitutto la cornea.

Quindi rimuovere con la pinzetta il cristallino e il corpo vitreo dalla superficie inter-retinica. Successivamente, staccare la sclera fino a quando la retina non è isolata dalla coppa oculare. Tagliare immediatamente la retina in strisce spesse 100-200 micrometri con un rasoio.

Successivamente, mescolare le strisce retiniche in paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M. Quindi, in paraformaldeide al 4% più glutaraldeide allo 0,01% a temperatura ambiente. Dopo diversi lavaggi in tampone fosfato con cloruro di calcio 0,15 millimolare, crioproteggere le strisce retiniche con glicerolo in tampone fosfato 0,1 M, prima della sostituzione criogenica. Prima di posizionare il tessuto congelato negli appositi contenitori piatti per l'inclusione, ritagliare un sottile cerchio da un foglio di plastica trasparente e posizionarlo sul fondo di ogni contenitore per facilitare la rimozione della scatola del campione polimerizzato al termine del procedimento.

Ora, impostare la sequenza automatica nell'AFS. Riempire l'AFS con azoto liquido e posizionare i portaincubazioni piatti nell'AFS. Riempirli con acetato di uranile al 1,5% in metanolo e preraffreddarli.

Per congelare rapidamente le strisce retiniche nel propano liquido a 184 gradi Celsius, utilizzare un pennello fine per posizionare i campioni su piccoli pezzi di nastro adesivo doppio lato fissati sui supporti metallici posti all'estremità delle aste di immersione. Successivamente, asportare il tampone in eccesso utilizzando il pennello. Immergere le aste nel propano liquido per circa cinque secondi.

Quindi, trasferirli nell'AFS utilizzando una piccola camera di trasporto riempita con azoto liquido. Dopo aver posizionato il campione congelato e gli strumenti, pinze e bisturi, nell'AFS, raffreddare gli strumenti nella camera per alcuni minuti prima di toccare il tessuto. In alternativa, raffreddarli immergendo le punte degli strumenti per alcuni secondi nella piccola camera di trasporto contenente azoto liquido.

Successivamente, rimuovere il campione e il nastro dal supporto utilizzando un bisturi fine. Poi, posizionare due frammenti di sezioni congelate in ciascuna delle sette pozzetti del portacampioni in alluminio piano con 1,5% di acetato di uranile in metanolo. Mantenerli a 90 gradi Celsius per almeno 32 ore nell'AFS.

Quindi, aumentare la temperatura gradualmente fino a 45 gradi Celsius secondo la sequenza automatica. Successivamente, lavare i campioni tre volte in metanolo pre-raffreddato. Poi, infiltrare progressivamente i campioni con resine da inclusione a bassa temperatura come mezzo di inclusione.

Il giorno successivo, sostituire nuovamente la resina e regolare il livello della resina in modo da raggiungere il bordo superiore delle pozzette. Posizionare la lampada UV sull'AFS e polimerizzare i campioni con luce UV nell'AFS fino al termine della sequenza automatica. Successivamente, rimuovere i campioni dall'AFS.

Tipicamente, i blocchi campione mostrano ancora una certa tonalità rosa e colore. Posizionare i campioni vicino alla luce fluorescente all'interno della cappa chimica a temperatura ambiente durante la notte, oppure fino a quando non appaiono completamente trasparenti. In questo passaggio, tagliare sezioni ultrasottili di 70 nanometri di spessore mediante un ultramicrotomo e raccoglierle su griglie di nichel rivestite con formvar e carbonio.

Lavare le griglie una volta con acqua distillata, seguito da tre lavaggi con TBS. Successivamente, incubare le griglie in 20 microlitri di BSA al 5% in TBS per 30 minuti, quindi in 20 microlitri di una miscela contenente anti-CTB di capra e un anticorpo contro una subunità del recettore NMDA, durante la notte a temperatura ambiente. Dopo, lavare le griglie tre volte con 20 microlitri di TBS ogni volta a pH 7,6.

Successivamente, lavare le griglie una volta con TBS a pH 8,2 per cinque minuti. Incubare le griglie per due ore con 20 microlitri di una miscela contenente immunoglobulina G anti-coniglio di asino accoppiata a particelle d'oro da 10 nanometri e immunoglobulina G anti-capra di asino accoppiata a particelle d'oro da 18 nanometri. Dopo due ore, lavare le griglie in 20 microlitri di TBS a pH 7,6 per tre volte, seguito da un lavaggio in acqua ultra-pura e quindi far asciugare le griglie all'aria.

Successivamente, controcolorare le griglie con acetato di uranile al 5% in acqua distillata per otto minuti, seguito da citrato di piombo allo 0,3% in acqua distillata per cinque minuti al buio. Per esperimenti di tripla marcatura, incubare le griglie tutta la notte a temperatura ambiente con 20 microlitri di una miscela di anti-capra CTB, anti-topo PSD-95 e anti-coniglio UN2A. Quindi, incubare le griglie per due ore con 20 microlitri di una miscela di IgG coniugate a particelle d'oro di 18, 10 e cinque nanometri.

In questa sezione, impostare innanzitutto la barra di scala. Successivamente, misurare la lunghezza della PSD dei singoli dendriti delle RGC utilizzando il software ImageJ. Quindi, contare le particelle d'oro entro 10 nanometri dalla membrana in base a uno spessore medio compreso tra sette e nove nanometri per la membrana plasmatica.

Calcolare la densità delle particelle come numero di particelle d'oro per micrometro lineare. Quindi, misurare la distanza tra il centro di ciascuna particella d'oro e il centro della PSD per la localizzazione sinaptica, oppure il bordo della PSD per la localizzazione extra-sinaptica. Questa immagine mostra l'etichettatura doppia con immunogold per GluA2/3 e CTB.

Questo è il ribbon pre-sinaptico e le piccole particelle d'oro sono raggruppate nella PSD dei processi delle RGC. Questa immagine mostra l'etichettatura immunoenzimatica doppia con oro colloidale per GluN2B e CTB. Le piccole particelle d'oro si trovano sulla membrana plasmatica extrasinaptica.

Questa immagine mostra l'etichettatura a doppio immunogold per GluN2A e CTB. Simile a GluA2/3, piccole particelle sono raggruppate all'interno della PSD. Qui viene mostrata l'etichettatura a triplo immunogold per GluN2A, PSD-95 e CTB.

I puntini d'oro associati a GluN2A e i puntini d'oro associati a PSD-95 sono co-localizzati all'interno della PSD su singole dendriti di cellule gangliari della retina positive al CTB. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di fissare il tessuto in modo molto delicato, poiché l'antigenicità di alcune proteine, come quella dei recettori NMDA, diminuisce notevolmente con una fissazione intensa e prolungata. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come rilevare e analizzare con grande precisione le proteine di membrana nelle sinapsi a nastro retiniche.