Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di sviluppare un nuovo approccio per analizzare quantitativamente le proteine di membrana nelle sinapsi del nastro retinico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia retinica, come la posizione precisa delle proteine nelle sinapsi all'interno del circuito. Il vantaggio principale della tecnica è che può stimare il numero, la densità e la rapidità di più proteine nelle sinapsi del nastro retinico.

A dimostrazione della procedura di freeze-sostituzione e del sezionamento ultrasottile, abbiamo i dottori Ron Petralia e Ya-Xian Wang del NIDCD Advanced Imaging Core. Per iniziare questa procedura, sezionare un bulbo oculare al microscopio. Per fare ciò, rimuovere prima la cornea.

Quindi rimuovere il cristallino e il vitreo dalla superficie interretinica con una pinza. Successivamente, sbucciare la sclera fino a quando la retina non è isolata dall'oculare. Tagliare immediatamente la retina in strisce spesse 100 200 micrometri con un rasoio.

Successivamente, mescolare le strisce di retina in paraformaldeide al 4% in PB 0,1 molare. Quindi, in 4% di paraformaldeide più 0,01% di glutaraldeide a temperatura ambiente. Dopo diversi lavaggi in PB, con 0,15 millimolari di cloruro di calcio, crioproteggere le strisce retiniche con glicerolo in PB 0,1 molare, prima della freeze-sostituzione. Prima di posizionare il tessuto congelato nei supporti di inclusione piatti, tagliare un cerchio sottile da un foglio di plastica trasparente e posizionarlo sul fondo di ciascun supporto per consentire una più facile rimozione della scatola del campione polimerizzato una volta terminata.

Ora, imposta la sequenza automatica nell'AFS. Riempire l'AFS con azoto liquido e posizionare i supporti da incasso piatti nell'AFS. Riempili con l'1,5% di acetato di uranile in metanolo e pre-raffreddali.

Per congelare le strisce retiniche in propano liquido a 184 gradi Celsius, utilizzare una spazzola fine per posizionare i campioni su piccoli pezzi di nastro biadesivo attaccati ai tronchetti metallici all'estremità delle aste di immersione. Dopodiché, rimuovi il tampone in eccesso usando il pennello. Immergi le barre nel propano liquido per circa cinque secondi.

Quindi, trasferirli nell'AFS utilizzando una piccola camera di trasporto riempita con azoto liquido. Dopo aver posizionato il campione congelato e gli strumenti, la pinza e il bisturi, nell'AFS, raffreddare gli strumenti nella camera per diversi minuti prima di toccare il tessuto. Oppure, raffreddarli posizionando le punte degli strumenti per alcuni secondi nella piccola camera di trasporto riempita di azoto liquido.

Successivamente, rimuovere il campione e il nastro adesivo dal mozzicone utilizzando un bisturi sottile. Quindi, posizionare due pezzi di sezioni congelate in ciascuno dei sette pozzetti nel supporto piatto in alluminio incorporato con l'1,5% di acetato di uranile in metanolo. Tienili a 90 gradi Celsius per almeno 32 ore nell'AFS.

Quindi, aumentare gradualmente la temperatura a 45 gradi Celsius nella sequenza automatica. Successivamente, lavare i campioni tre volte in metanolo pre-raffreddato. Successivamente, infiltrare progressivamente i campioni con resine di inclusione a bassa temperatura come mezzo di inclusione.

Il giorno successivo, cambia nuovamente la resina e regola il livello di resina per raggiungere il bordo superiore dei pozzetti. Impostare la luce UV sull'AFS e polimerizzare i campioni con la luce UV nell'AFS fino alla fine della sequenza automatica. Quindi, rimuovere i campioni dall'AFS.

In genere, i blocchi campione mostrano ancora un po' di rosa e colore. Posizionare i campioni vicino alla luce fluorescente nella cappa chimica a temperatura ambiente per una notte o fino a quando non appaiono completamente limpidi. In questa fase, tagliare con un ultramicrotomo sezioni ultrasottili spesse 70 nonometri e raccoglierle sulle griglie di nichel rivestite di carbonio formvar.

Lavare le griglie in acqua distillata una volta, seguita da tre lavaggi di TBS. Quindi, incubare le griglie in 20 microlitri di BSA al 5% in TBS per 30 minuti, e poi in 20 microlitri di una miscela contenente anti-CTB di capra e un anticorpo contro una subunità NMDAR durante la notte a temperatura ambiente. Dopodiché, lavare le griglie tre volte con 20 microlitri di TBS ogni volta a ph 7,6.

Successivamente, lavare una volta le griglie con TBS a ph 8,2 per cinque minuti. Incubare le griglie per due ore con 20 microlitri di una miscela contenente IGG anti-coniglio d'asino accoppiato a particelle d'oro a 10 nanometri, e IGG anti-capra d'asino accoppiato a particelle d'oro a 18 nanometri. Dopo due ore, lavare le griglie in 20 microlitri di TBS, a ph 7,6 tre volte, quindi lavare in acqua ultrapura e quindi asciugare le griglie all'aria.

Successivamente, controcolorare le griglie con il 5% di acetato di uranile in acqua distillata per otto minuti, seguito da citrato di piombo allo 0,3% in acqua distillata per cinque minuti al buio. Per gli esperimenti di tripla marcatura, incubare le griglie per una notte a temperatura ambiente con 20 microlitri di una miscela di CTB anti-capra, PSD-95 anti-topo e UN2A anti-coniglio. Quindi, incubare le griglie per due ore con 20 microlitri di una miscela di IGG accoppiata a particelle d'oro a 18, 10 e cinque nanometri.

In questa sezione, impostare prima la barra della scala. Quindi misurare la lunghezza del PSD dei singoli dendriti RGC con il software ImageJ. Quindi, conta le particelle d'oro entro 10 nanometri dalla membrana in base a uno spessore medio da sette a nove nanometri per la membrana plasmatica.

Calcola la densità delle particelle come il numero di particelle d'oro per micrometro lineare. Quindi, misurare la distanza tra il centro di ogni particella d'oro e il centro del PSD per la posizione sinaptica, o il bordo del PSD, per la posizione extrasinaptica. Questa immagine mostra la doppia marcatura immunogold di GluA2/3 e CTB.

Questo è il nastro pre-sinaptico e le piccole particelle d'oro sono raggruppate nella PSD dei processi RGC. Questa immagine mostra la doppia marcatura immunogold di GluN2B e CTB. Le piccole particelle d'oro si trovano sulla membrana plasmatica extra-sinaptica.

E questa immagine mostra la doppia marcatura immunogold di GluN2A e CTB. Simile a GluA2/3, piccole particelle sono raggruppate all'interno della PSD. La tripla marcatura immunogold di GluN2A, PSD-95 e CTB è mostrata qui.

particelle d'oro GluN2A e le particelle d'oro PSD-95 sono co-localizzate all'interno della PSD su singoli dendriti RGC CTB-positivi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di fissare il tessuto molto delicatamente, perché alcune proteine antigeniche, come quella dei recettori NMDA, diminuiscono notevolmente con una forte fissazione prolungata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare e analizzare le proteine di membrana con grande precisione nelle sinapsi del nastro retinico.