Name: Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Impara l'analisi quantitativa immunogold ad alta risoluzione dei recettori di membrana nelle sinapsi a nastro retiniche. Questo metodo permette di studiare la localizzazione subcellulare delle proteine sinaptiche con precisione nanometrica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai programmi intramurale del National Institute of Neurological Disorder and Stroke (NINDS) e National Institute on Deafness altri disturbi della comunicazione e (NIDCD), del National Institutes of Health (NIH). Ringraziamo l&#39;impianto NINDS EM e il nucleo NIDCD Advanced Imaging (codice # ZIC DC 000.081-03) per l&#39;assistenza.

Cura e trattamento degli animali erano in conformità con NIH cura degli animali e linee guida del Comitato Usa. Postnatale giorno (P) 15-21 ratti Sprague-Dawley, iniettati con 1-1,2% CTB bilateralmente attraverso il collicolo superiore, sono stati mantenuti su un 12: luce 12-hr: ciclo scuro. 1. Fissazione tessuto retinico <ol><li> Montare i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, 2 pinze con punte molto fini, forbici, carta da filtro di cellulosa, pipetta di plastica e un vetrino da microscopio. </li><li> Anestetizzare ratto in una camera chiusa con 2,0 ml alotano (un anestetico inalante). Determinare un&#39;adeguata anestesia con questi metodi: la mancanza di ritiro della zampa posteriore dopo pizzico punta, o la mancanza di riflesso corneale. Poi decapitare immediatamente con una ghigliottina. Rimuovere gli occhi con un paio di forbici iris e mettere in un piatto di vetro contenente 4% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4. </li><li> Utilizzando il microscopio da dissezione, rimuovere il maisEA tagliando la parte anteriore del bulbo oculare. Rimuovere la lente e vitreale dalla superficie della retina interna con una pinza. </li><li> Sbucciare la sclera con le due pinze fino a quando la retina è isolato dal oculare. </li><li> Tagliare la retina immediatamente in 100 - 200 strisce micron di spessore con un rasoio, e soggetti a fissaggio variazione del pH. </li><li> Fix strisce retina in 4% paraformaldeide in 0.1 M PB a pH 6,0 per 20 - 30 min e poi in 4% paraformaldeide più 0,01% glutaraldeide a pH 10,5 per il 10 - 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Dopo alcuni lavaggi in PB con 0.15 mM CaCl 2 (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect le strisce retinici con glicerolo (60 min ogni a 10%, 20%, 30%, poi O / N a 30%) in 0,1 M PB prima di congelare la sostituzione. </li></ol> 2. Fermo-sostituzione NOTA: Questo metodo freeze-sostituzione viene modificato da un precedente protocollo pubblicato 19,20. Inoltre, è fondamentale che gli strumenti sono molto freddi (indossare guanti); otherwise, il tessuto può scongelare parzialmente quando viene toccato con gli strumenti. Tutti questi passaggi sono fatti all&#39;interno della camera di AFS e gli strumenti sono mai permesso di passare sopra il bordo della camera. Allo stesso modo, il corretto raffreddamento di tutte le sostanze chimiche utilizzate nella AFS è necessario. <ol><li> Tuffatevi-congelare le strisce della retina in propano liquido a -184 ° C in uno strumento EM crioconservazione (CPC). Utilizzando un pennello fine, posizionare i campioni su piccoli pezzi di nastro biadesivo attaccato ai mozziconi di metallo che vanno sulla fine delle aste a strapiombo (stoppino off tampone usando il pennello). </li><li> Plunge le aste in propano liquido e tenere lì per circa 5 secondi, e poi il trasferimento allo strumento freeze-sostituzione automatica (AFS) con una piccola camera di trasporto che viene riempito con azoto liquido ( &#39;LN 2 raffreddato contenitore di trasferimento crio&#39;). </li><li> Dopo aver posizionato il campione congelato e strumenti (pinze e bisturi) nel AFS, raffreddare gli strumenti nella camera per SEminuti veral prima di toccare il tessuto, o raffreddarli ponendo le punte degli strumenti per pochi secondi nella piccola camera di trasporto (riempito con azoto liquido ( &#39;LN 2 raffreddata contenitore di trasferimento crio&#39;)). </li><li> Una volta in AFS, togliere il campione e nastro dalla stub usando una multa bisturi. Inoltre, mantenere il controllo del flusso di gas di azoto, TF (TF è descritto come un &#39;controllo del regolatore per LN 2 vaporizzatore&#39;) aperto durante queste procedure. </li><li> Prima di posizionare il tessuto congelato nei supporti piatti incorporamento (cioè, prima di impostare la AFS), tagliare un cerchio sottile da un foglio di plastica trasparente e posizionarlo nella parte inferiore del supporto in modo da far corrispondere il fondo di ciascun pozzetto. Questo permette relativamente facile rimozione dei blocchi campione polimerizzati quando finito. NOTA: In precedenza, abbiamo utilizzato un metodo alternativo per i titolari di incorporamento piatte, e impiegando doppi Reichert + capsule di gelatina (vedi Petralia e Wenthold, 1999) &lt;sup&gt; 20. </li><li> Utilizzare la seguente sequenza automatica in AFS (usando la terminologia strumento): T1 = -90 ° C per 32 ore, S1 = aumento di temperatura di 4 ° C / ora (11,3 ore), T2 = -45 ° C per 50 ore, S2 = aumento di temperatura di 5 ° C / ora (9 ore), T3 = 0 ° C per 40 ore (totale = 142,3 ore). Si può prendere 2 - 4 ore di inserire campioni nel AFS (a -90 ° C) prima di iniziare la sequenza temporizzata. </li><li> Immergere le sezioni congelate di 1,5% di acetato di uranile in metanolo a -90 ° C per&gt; 32 ore in AFS. Mettere due pezzi di tessuti (in genere) in ciascuno dei sette pozzi nel supporto di alluminio piatto embedding (tre assemblata nel AFS). <ol><li> Posizionare il tessuto + nastro nella acetato di uranile / metanolo nei pozzetti e rimuovere il nastro dopo, appena prima dell&#39;inizio mezzo di inclusione (ad esempio Lowicryl HM20) infiltrazione, se è troppo difficile rimuovere il tessuto dal nastro. </li></ol></li><li> Poi aumentare la graduale della temperatura a -45 ° C (+ 4 ° C per ora; in sequenza automatica). </li><li> Lavare i campioni per tre volte in metanolo pre-raffreddata, utilizzando una pipetta di plastica a punta fine per rimuovere la vecchia soluzione da ciascun titolare piatta-embedding, e quindi utilizzando un&#39;altra pipetta di plastica standard per aggiungere il metanolo fresco preraffreddato. </li><li> Poi, usando lo stesso metodo, infiltrarsi campioni progressivamente con basse resine temperatura incorporamento come mezzo di inclusione (HM20 / metanolo 1: 1 e 2: 1, ciascuno per 2 ore, seguita da resina pura per 2 ore e quindi modificare le resine e mantenere O / N). </li><li> Cambiare la resina nuovamente il giorno successivo, regolando il livello della resina per raggiungere solo al bordo superiore dei pozzetti. </li><li> Polimerizzare i campioni (-45 ° C a 0 ° C in sequenza automatica; + 5 ° C per ora) con luce UV per 40 hr. </li><li> Quindi rimuovere i campioni dal AFS. In genere, i blocchi di esempio mostrano ancora un po &#39;di colore rosa a colori. Posizionare i campioni vicini alla luce fluorescente nella cappa, a RT O / N o più a lungo fino a quando non apporecchio del tutto chiaro. </li></ol> 3. Postembedding EM Immunogold Immunocitochimica NOTA: Postembedding immunocitochimica viene eseguita come descritto 23,24,25. <ol><li> Tagliare 1 micron sezioni con ultramicrotomo, sezioni macchia con 1% toluidina-blu, e li esaminerà per l&#39;orientamento sezione; orientare il blocco di tessuto per ottenere il piano trasversale ottimale di sezionamento. </li><li> Tagliare 70 nm sezioni ultrasottili di spessore con ultramicrotomo e alla loro raccolta di nichel di slot griglie Formvar-carbonio rivestite. </li><li> Lavare griglie una volta in H 2 O distillata O seguita da una soluzione salina tamponata con Tris tre volte (TBS, 0,05 M di tampone Tris, 0.7% NaCl, pH 7,6) lavaggio. </li><li> Incubare griglie 20 gocce microlitri di 5% BSA in TBS per 30 minuti, e poi in 20 gocce microlitri di una miscela contenente capra anti-CTB (1: 3.000) ed un anticorpo per un NMDAR subunità (anti-rabbit GluN2A 01:50 , GluN2B 1:30), o un anti-rabbit GluA2 / 3 (1:30)in TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) con 2% BSA e 0,02 M NaN 3 O / N a RT. </li><li> griglie Lavare su tre gocce separate (20 microlitri) di TBS (pH 7,6) per 10, 10, e 20 minuti, seguiti da TBS (pH 8,2) per 5 min. </li><li> Incubare griglie per 2 ore in gocce (20 mL) di una miscela contenente asino IgG anti-coniglio (1,20) accoppiata a 10 nm particelle d&#39;oro e IgG asino anti-capra (1:20) accoppiata a particelle d&#39;oro 18 nm in TBST (pH 8.2) con 2% BSA e 0,02 M NaN 3. </li><li> Lavare griglie in 20 gocce microlitri di TBS (pH 7,6) per 5, 5, e 10 min, poi in acqua ultrapura e poi asciugare. </li><li> Griglie di contrasto con il 5% di acetato di uranile e lo 0,3% di piombo citrato di H 2 O distillata per 8 e 5 minuti in condizioni di oscurità, rispettivamente. </li><li> Per gli esperimenti triple-etichettatura, incubare le griglie O / N a temperatura ambiente con 20 gocce microlitri di una miscela di anti-capra CTB (1: 3.000), anti-topo PSD-95 (1: 100), e anti-coniglio GluN2A (1 : 50). Poi incubare griglie per 2 ore su 20 gocce microlitri di una miscela di IgG accoppiata a 18, 10 e 5 particelle di oro nm in TBST (pH 8.2) con 2% BSA e 0,02 M NaN 3. Mantenere le stesse procedure doppia marcatura per il lavaggio e controcolorazione tra e dopo l&#39;incubazione degli anticorpi. </li><li> I controlli sono stati eseguiti in cui gli anticorpi secondari sono stati applicati solo. </li><li> Vedi griglie su un EM e digitalizzare immagini. Elaborare dati definitivi in Adobe Photoshop 6.0 ​​solo per la luminosità ed il contrasto se necessario 24. </li></ol> 4. Quantificazione <ol><li> Selezionare manualmente aree del livello plessiforme interno (IPL), senza buchi o crepe a 8,000X ingrandimento, quindi fotomontaggio a caso tutta la profondità di IPL a 25,000X ingrandimento. </li><li> Identificare dendriti RGC a cono diadi bipolari quando a) contengono il segnale CTB retrograda trasportato (grandi particelle d&#39;oro), b) mostrano ben definito membrane, crepacci, e densità post-sinaptici, c) contengono almeno due piccola parte in oroicles all&#39;interno del PSD, o più di una piccola particella d&#39;oro lungo la membrana plasmatica extrasinaptica. </li><li> Raccogliere 45 - 55 dendriti RGC, sulla base di criteri di cui sopra, per l&#39;analisi quantitativa. </li><li> Misurare le lunghezze del PSD e la membrana plasmatica extrasinaptica dei singoli dendriti RGC con il software NIH ImageJ. Conteggio particelle d&#39;oro entro 10 nm della membrana come associata alla membrana, basato su uno spessore medio di 7 - 9 nm per la membrana plasmatica 26. </li><li> Calcolare la densità di particelle come il numero di particelle d&#39;oro per micrometro lineare (oro / micron). Misurare la distanza tra il centro di ogni particella oro e la metà del PSD (per la posizione sinaptica) o il bordo del PSD (per la posizione extrasinaptica). </li><li> Effettuare analisi statistiche da parte del software. Utilizzare due code t-test per confrontare le medie. Concludere significato quando P &lt;0,05. Se non diversamente indicato, i valori di rapporto come media ± SEM 18. </li></ol>

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<li>Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+a+type+of+peripheral+glutamate+synapse%3A+the+afferent+synapses+of+hair+cells+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear.</a> Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).</li>
<li>Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21, 545-559 (1998).</li>
<li>Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+expression+of+AMPA+and+NMDA+receptors+in+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses.</a> Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).</li>
<li>Grimes, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inhibitory+microcircuitry+regulates+retinal+signaling+near+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold.</a> J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).</li>
<li>Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+ionotropic+glutamate+receptors+at+dendrodendritic+synapses+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno divulgazioni.

Abbiamo descritto quattro tecniche per il successo post-embedding immunogold EM quantitativa: 1) fissazione breve e debole, 2) freeze-sostituzione, 3) post-embedding colorazione immunogold, e 4) la quantificazione. EM immunogold permette il rilevamento di proteine ​​specifiche in sezioni di tessuto ultrasottili. Gli anticorpi marcati con particelle d&#39;oro possono essere visualizzati direttamente usando EM. Mentre potente nel rilevare la localizzazione subsinaptico di un recettore di membr...

Il glutammato è il principale neurotrasmettitore eccitatorio nella retina 1. Cellule gangliari della retina (RGCs), che ricevono in ingresso sinaptica glutammatergica da cellule bipolari 2, sono i neuroni di uscita della retina che inviano le informazioni visive al cervello. Studi fisiologici hanno mostrato che l&#39;eccitazione sinaptica di RGCs è mediata da recettori NMDA postsinaptica (NMDARs) e recettori AMPA (AMPARs) 3,4,5. Anche se le correnti post-sinaptiche eccitatorie (EPSCs) in RGCs sono mediate da AMPARs e NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs miniatura spontanee (mEPSCs) su RGCs mostrano solo una componente AMPARs mediata 4,5,9. Tuttavia, la riduzione del glutammato captazione rivelato una componente NMDAR in EPSCs spontanee 5, suggerendo che NMDARs su dendriti RGC possono essere situati al di fuori delle sinapsi eccitatorie. Associata alla membrana guanilato chinasi (MAGUKs) come PSD-95 che i recettori grappolo neurotrasmettitori, tra cui i recettori del glutammato e canale ionicos nei siti sinaptici, mostrano anche diversi modelli di espressione subsinaptico 10,11,12,13,14. Negli ultimi decenni, immunoistochimica confocale e l&#39;incorporamento di pre-microscopio elettronico immunoistochimica (EM) sono stati impiegati per studiare l&#39;espressione del recettore di membrana. Anche se immunostaining confocale rivela ampi schemi di espressione dei recettori, la sua risoluzione più bassa rende impossibile l&#39;utilizzo di distinguere posizione subcellulare. -Embedding Pre studi EM in retina di mammifero indicano che subunità NMDAR sono presenti negli elementi post-sinaptici a cono bipolari sinapsi nastro cellule 15,16,17. Questo è in evidente contrasto con prove fisiologica. Tuttavia, la diffusione del prodotto di reazione è un artefatto noto nel metodo dell&#39;immunoperossidasi pre-embedding. Quindi, questo approccio di solito non dà dati statisticamente affidabili e può escludere distinzione tra la localizzazione di membrana sinaptica contro 18,19,20,21 membrana extrasinaptica. SopraD&#39;altra parte, i dati fisiologici e anatomici sono coerenti con una localizzazione sinaptica di AMPARs su RGCs 3,5,7,9,22. Così, i recettori del glutammato e MAGUKs a sinapsi nastro retinica sono localizzate non solo al postsinaptica ma anche ai compartimenti di membrana perisynaptic o extrasinaptica. Tuttavia, è ancora necessaria una ad alta risoluzione analisi quantitativa di queste proteine ​​di membrana in una sinapsi nastro della retina. Qui, abbiamo sviluppato una tecnica postembedding EM immunogold per esaminare la localizzazione subsinaptico di subunità NMDAR, subunità Ampar e PSD-95 seguita da stimare il numero, la densità e la variabilità di queste proteine ​​a livello delle sinapsi Onto RGCs ratto etichettati utilizzando tossina colerica subunità B (CTB) metodi di tracciamento retrogrado.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Glutarraldeide</td><td>EMS</td><td>16019</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-8106</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>JT Baker</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Gibco BRL</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lowicryl HM 20</td><td>Polysciences</td><td>15924-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>04997-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GluN2A</td><td>Millipore</td><td>AB1555P</td><td>Diluizione 1/50</td></tr><tr><td>Anti-GluN2B</td><td>Millipore</td><td>AB1557P</td><td>Diluizione 1/30</td></tr><tr><td>Anti-GluA2/3</td><td>Millipore</td><td>AB1506</td><td>Diluizione 1/30</td></tr><tr><td>Anti-PSD-95</td><td>Millipore</td><td>MA1... 046</td><td>Diluizione 1/100</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio IgG-10 nm particelle d'oro</td><td>EMS</td><td>25704</td><td>Diluizione 1/20</td></tr><tr><td>Asino anti-topo IgG-10 nm particelle d'oro</td><td>EMS</td><td>25814</td><td>Diluizione 1/20</td></tr><tr><td>Asino anti-topo IgG-5 nm particelle d'oro</td><td>EMS</td><td>25812</td><td>Diluizione 1/20</td></tr><tr><td>Asino anti-capra IgG-18 nm particelle d'oro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-215-147</td><td>Diluizione 1/20</td></tr><tr><td>Formvar-Griglie a fessura in nichel rivestite in carbonio.</td><td>EMS</td><td>FCF2010-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>EMS</td><td>22400-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>EMS</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di piombo</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM AFS</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM CPC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL 1200 EM</td><td>Azoto liquido JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roberts Ossigeno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propano</td><td>Roberts Ossigeno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTB</td><td>Elenco Laboratori Biologici</td><td>104</td><td>1 - 1,2%</td></tr><tr><td>Elenco Anti-CTB</td><td>Laboratori Biologici</td><td>703</td><td>Diluizione 1/4.000</td></tr></tbody></table>

risoluzione alta analisi quantitativa immunogold di recettori di membrana a retina nastro sinapsi

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Le cellule gangliari retiniche (RGC) ricevono input glutammatergici eccitatori dalle cellule bipolari. L'eccitazione sinaptica delle RGC è mediata postsinapticamente dai recettori NMDA (NMDAR) e dai recettori AMPA (AMPAR). I dati fisiologici hanno indicato che i recettori del glutammato nelle RGC sono espressi non solo nei compartimenti di membrana postsinaptici, ma anche perisinaptici o extrasinaptici. Tuttavia, non sono state determinate posizioni anatomiche precise per i recettori del glutammato nelle sinapsi RGC. Sebbene sia ampiamente impiegata un'analisi quantitativa ad alta risoluzione dei recettori del glutammato nelle sinapsi centrali, questo approccio ha avuto solo un successo limitato nella retina. Abbiamo sviluppato un metodo immunogold post-embedding per l'analisi dei recettori di membrana, che consente di stimare il numero, la densità e la variabilità di questi recettori nelle sinapsi a nastro retinico. Qui descriviamo gli strumenti, i reagenti e i passaggi pratici necessari per: 1) preparazione di successo della fissazione retinica, 2) sostituzione a freddo, 3) immunocitochimica al microscopio elettronico (EM) immunogold post-inclusione e 4) visualizzazione quantitativa dei recettori del glutammato nelle sinapsi a nastro.

I risultati qui presentati dimostrano sorprendentemente diversi modelli di localizzazione subsinaptico di GluA 2/3 e NMDARs sui dendriti RGC in retina di ratto, come descritto in precedenza 24,25. 77% di GluA 2/3 particelle immunogold in RGC profili dendritiche erano situati all&#39;interno del PSD (Figura 1A), simile alla maggior sinapsi centrali. Tuttavia, NMDARs erano situati sia sinapticamente o extrasynaptically. 83% di particelle immunogold GluN2A stati ...

Il metodo immunogold post-inclusione è uno dei modi più efficaci per fornire analisi ad alta risoluzione della localizzazione subcellulare di molecole specifiche. Qui descriviamo un protocollo per analizzare quantitativamente i recettori del glutammato nelle sinapsi del nastro retinico.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è sviluppare un nuovo approccio per analizzare in modo quantitativo le proteine di membrana nei sinapsi a ribbon retinici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia retinica, come la localizzazione precisa delle proteine nei sinapsi all'interno del circuito. Il vantaggio principale della tecnica è che consente di stimare il numero, la densità e la rapidità di molteplici proteine nei sinapsi a ribbon retinici.Per illustrare la procedura di sostituzione criogenica e di sezione ultrasottile, abbiamo collaborato con Ron Petralia e Ya-Xian Wang dell'Advanced Imaging Core del NIDCD. Per iniziare questa procedura, dissezionare un bulbo oculare al microscopio. A tale scopo, rimuovere innanzitutto la cornea.Quindi rimuovere con la pinzetta il cristallino e il corpo vitreo dalla superficie inter-retinica. Successivamente, staccare la sclera fino a quando la retina non è isolata dalla coppa oculare. Tagliare immediatamente la retina in strisce spesse 100-200 micrometri con un rasoio.Successivamente, mescolare le strisce retiniche in paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M. Quindi, in parafo

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In questo video ci dimostra come etichettare e visualizzare singole esocitosi delle vescicole sinaptiche e la tratta di pesci rossi cellule bipolari della retina mediante fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia.

Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF

Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.

Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

Fonte: Schönherr, S., et. al. Immunomarcatura combinata optogenetica e replica di frattura da congelamento per esaminare la disposizione specifica dell'input dei recettori del glutammato nell'amigdala di topo. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra l'immunomarcatura di repliche fratturate da congelamento di tessuto cerebrale di topo per la microscopia elettronica. Le repliche fratturate e rivestite vengono digerite per esporre i recettori. Gli anticorpi primari e secondari marcati con oro...

Immunomarcatura delle proteine della membrana neuronale in un campione di tessuto cerebrale di topo con frattura da congelamento

Fonte: Zhang, J., et al. Analisi quantitativa ad alta risoluzione dell'immunooro dei recettori di membrana nelle sinapsi del nastro retinico. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra una tecnica di microscopia elettronica per visualizzare la localizzazione del recettore dei neurotrasmettitori nelle sinapsi retiniche. Le sezioni retiniche contengono cellule gangliari retiniche che esibiscono recettori dei neurotrasmettitori legati alla membrana e sono marcate con la subunità B della tossina del...

Imaging ad alta risoluzione dei recettori dei neurotrasmettitori nelle sinapsi retiniche

Il protocollo qui descritto è per la valutazione strutturale di una preparazione retinica a montaggio intero. Ciò include le descrizioni della dissezione tissutale, il montaggio su un inserto di membrana in politetrafluoroetilene idrofilizzato (PTFE), il caricamento del bolo con marcatori fluorescenti e un confronto della fissazione con carbodiimmide e paraformaldeide per l'analisi immunoistochimica dei componenti cellulari e sinaptici.

Protocollo ottimizzato per la preparazione dell'intero montaggio retinico per l'imaging e l'immunoistochimica

Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

Questo articolo illustra come l'espressione dei recettori dei neurotrasmettitori possa essere quantificata e il pattern analizzato nelle sinapsi con elementi pre e postsinaptici identificati utilizzando una combinazione di trasduzione virale di strumenti optogenetici e la tecnica di immunomarcatura della replica della frattura da congelamento.

Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell&#39;amigdala mouse

Qui presentiamo un protocollo per adattare il metodo CLARITY dei tessuti cerebrali per retine a montaggio intero per migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retini e delle loro strutture subcellulari.

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

Questo protocollo delinea le fasi dettagliate della microscopia immunoelettronica pre-incorporamento, con particolare attenzione all'esplorazione dei circuiti sinaptici e della localizzazione delle proteine nella retina.

Studio dei circuiti retinici e della localizzazione molecolare mediante microscopia immunoelettronica pre-incorporata

Questo protocollo fornisce una procedura di preparazione ottimizzata ed elaborata per campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione. È adatto per applicazioni che prevedono l'analisi delle sinapsi in organoidi retinici maturi.

Preparazione di campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto &lt; 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Impara l'analisi quantitativa immunogold ad alta risoluzione dei recettori di membrana nelle sinapsi a nastro retiniche. Questo metodo permette di studiare la localizzazione subcellulare delle proteine sinaptiche con precisione nanometrica.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

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