Name: Pyrosequencing per identificazione microbica e caratterizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Impara la pirosintesi per identificare batteri tramite analisi del DNA ribosomiale 16S. Questo metodo consente la caratterizzazione microbica e il rilevamento di mutazioni genetiche associate alla resistenza antimicrobica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo progetto è stato di supporto in parte dalla Johns Hopkins University, Ufficio del prevosto tramite il gateway Science Initiative e Qiagen Inc.

Introduzione: Una singola colonia batterica dovrebbe essere utilizzata per inoculare un appropriato brodo di coltura che viene incubata per una notte. Un pellet batterico viene quindi elaborato per purificare il DNA genomico usando un kit di isolamento genomico disponibile in commercio. Il DNA genomico purificato deve avere un rapporto di 260/280 (nm)&gt; 1.8 per assicurare che il campione sia esente da contaminazione proteica. La quantità di DNA genomico richiesto per la generazione del modello pirosequenziamento è 10-20 ng. A. Amplificazione del Template (PyroMark PCR Handbook; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / manuali</a> 1) Impostazione della reazione di PCR Nota: Una mano di fondo deve essere biotinilato alla sua estremità 5 &#39;, e si raccomanda che sia HPLC purificato per la preparazione del modello. Si consiglia l&#39;PyroMark Assay Software Design 2.0 per PCR e SEprogettazione Primer sequenza che sono ottimizzati per il sequenziamento di breve lettura, tuttavia, Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> ) da NCBI può anche essere utilizzato per la progettazione primer. <ol><li> Scongelare tutte le soluzioni necessari (elencati nella Tabella 1) e mescolare ogni accuratamente. Impostare la reazione in base alla tabella 1. Tutto il lavoro può essere fatto a temperatura ambiente. </li></ol> Nota: La PCR Master Mix contiene MgCl 2 per una concentrazione finale di 1,5 mM, che fornisce risultati soddisfacenti nella maggior parte dei casi. Se un maggiore Mg 2 + è richiesta concentrazione, fino a 3,5 ml di 25 mM MgCl2 può essere aggiunto a una reazione. <ol start="2"><li> Mescolare bene la miscela di reazione pipettando gentilmente su e giù, poi Versare volumi appropriati in provette PCR. </li><li> Aggiungi tEmPLate DNA per ogni provetta PCR. Si consiglia di 10 ng di DNA genomico. </li><li> Programmare il termociclatore secondo la Tabella 2. Una presa finale a 4 ° C è raccomandato per convenienza. Se si utilizza un termociclatore senza coperchio riscaldato, reazioni di sovrapposizione con 100 ml di olio minerale. </li><li> Mettere le provette PCR nel termociclatore e avviare il programma di ciclismo. </li></ol> B. Vacuum Workstation protocollo Immobilizzare i prodotti di PCR biotinilato <ol><li> Fare un master mix secondo la Figura 4. </li></ol> Nota: Prima di pipettaggio, agitare delicatamente la bottiglia di streptavidina perline rivestite Sepharose per garantire una sospensione omogenea. <ol start="2"><li> A seconda del volume del prodotto di PCR utilizzato, dispensare 60-75 microlitri master mix in ciascun pozzetto di una piastra per PCR per ottenere un volume totale di 80 microlitri per pozzetto. </li><li> Aggiungere 5-20 ml di prodotto PCR biotinilato a ciascun pozzetto. </li><li> Sigillare i pozzetti con la striscia di caps e agitare la piastra PCR a 1.400 rpm per 5-10 minuti a temperatura ambiente (15-25 ° C) con un agitatore orbitale. </li></ol> Denaturazione del DNA e l&#39;aggiunta di sequenziamento Primer <ol><li> Diluire i primer di sequenziamento a 0.3 mM tampone con ricottura e dispensare 25 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra di reazione. Posizionare la piastra sulla workstation. </li><li> Riempire gli abbeveratoi workstation secondo il diagramma di Figura 5. </li><li> Accendere la pompa del vuoto, e assicurarsi che l&#39;interruttore sullo strumento vuoto è impostato su (Figura 6). Lavare le sonde filtro con acqua ad elevata purezza (Milli-Q 18,2 MW x cm o equivalente) in depressione 5 (Figura 5). Riempire la vasca con acqua ad alta purezza fresco da utilizzare nel passaggio 12. </li><li> Lavorare velocemente, posizionare la piastra di PCR con perline sulla workstation. Assicurarsi che entrambi i piatti sono lo stesso orientamento di quando sono stati caricati i campioni. </li><li> Con il vacuostato ON, abbassare il vuotoutensile nei pozzetti della piastra PCR per 20 secondi o finché tutto volume è stato aspirato. Le perle vengono catturati dallo strumento vuoto (Figura 7). </li><li> Con il vuoto ancora ON, lavare lo strumento con il 70% di etanolo (attraverso 1) per 20 secondi o fino a che tutto il volume è stato aspirato. </li><li> Con vuoto ON, lavare lo strumento con la soluzione di denaturazione (trogolo 2) per 20 secondi o fino a che tutto il volume è stato aspirato. </li></ol> Nota: La soluzione di denaturazione contiene idrossido di sodio, che è un occhio e irritante per la pelle. Indossare sempre un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi. <ol start="8"><li> Con vuoto ON, lavare lo strumento con tampone di lavaggio (depressione 3) per 20 secondi o fino a che tutto il volume è stato aspirato. </li><li> Con vuoto ON, sollevare lo strumento vuoto per oltre 90 ° in verticale per 5 secondi, per consentire a tutti di liquido di defluire fuori dello strumento vuoto. Spegnere la pompa e allineare lo strumento di vuoto con la piastra di reazione. Abbassare l&#39;attrezzo di vuoto nelpozzi e scuotere delicatamente da un lato all&#39;altro per liberare le perline nei pozzetti contenenti Primer di sequenziamento. </li><li> Per pulire lo strumento vuoto, agitare le sonde filtro in acqua ad alta purezza (depressione 4) per 10 sec. </li><li> Spegnere il vuoto e lavare lo strumento con acqua ad alta purezza (depressione 5) per 20 secondi o fino a che tutto il volume è stato aspirato. </li><li> Sollevare lo strumento vuoto per oltre 90 ° C verticale per 5 secondi, quindi passare l&#39;aspirapolvere OFF e memorizzare nella posizione &quot;parcheggio&quot;. </li></ol> Ricottura Primer di sequenziamento di filamenti di DNA <ol><li> Posizionare la piastra di reazione in un supporto piatto preriscaldato. </li><li> Riscaldare la piastra su una piastra riscaldante a 80 ° C per 2 min. </li><li> Rimuovere la piastra dal supporto e posto sul bancone a raffreddare a temperatura ambiente per 5 min. </li></ol> Pyromark Q24 Funzionamento Nota: Accendere l&#39;apparecchio con l&#39;interruttore di alimentazione che si trova sopra il cavo di alimentazione. Stellatup può richiedere fino a 1 min. <ol><li> Riempire una cartuccia seguendo le istruzioni fornite nella PyroMark Oro Q24 Reagenti Manuale 2. Per determinare i volumi necessari, impostare un file di correre nel software dello strumento, e sotto il menu Strumenti selezionare Pre Informazioni Run </li><li> Se lo strumento è già acceso, assicurarsi che non sta eseguendo una corsa e quindi aprire il coperchio. Un segnale acustico viene emesso se il coperchio è aperto, quando non è sicuro di farlo. </li><li> Aprire la porta della cartuccia e inserire la cartuccia con l&#39;etichetta rivolta in avanti (Figura 8). Assicurarsi che la cartuccia sia inserita correttamente (una linea dovrebbe essere visibile nella parte anteriore) e chiudere il cancello. </li><li> Aprire il telaio piastra-holding e posizionare la piastra con i campioni all&#39;interno dello strumento. </li><li> Chiudere il telaio reggipiatti e il coperchio dello strumento (Figura 9). </li></ol> Avvio di una corsa <ol><li> Inserire la chiavetta USB con il file di esecuziones creato con il software dello strumento alla porta USB sulla parte anteriore dello strumento. </li><li> Selezionare &quot;Esegui&quot; nel menu principale e premere &quot;OK&quot;. </li><li> Utilizzare le frecce di scorrimento per selezionare il file di esecuzione desiderato e premere &quot;Seleziona&quot;. </li></ol> Nota: Lo strumento inizia la dispensazione reagenti durante tutta la pressione preimpostata e livelli di temperatura raggiunti (l&#39;operazione potrebbe richiedere alcuni minuti). Durante una corsa, lo schermo dello strumento visualizza la pyrogram del ben selezionati in tempo reale. Utilizzare le frecce di scorrimento per visualizzare l&#39;pyrogram di altri pozzi. Completamento di una corsa <ol><li> Quando lo strumento conferma che la corsa è finita e il file di esecuzione è stato salvato sulla chiavetta USB, premere &quot;Chiudi&quot;. </li><li> Rimuovere la chiavetta USB. Se è stata rimossa prima che finito la corsa, inserire la chiavetta USB. Selezionare &quot;Amministrazione&quot; e poi &quot;Copy viene eseguito non salvati&quot;. </li><li> Eseguire il file può essere aperto e analizzato con il software dello strumento e confrontatoa una libreria di microbi conosciuti utilizzando il software Identifire. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PyroMark+PCR+Handbook%22">PyroMark PCR Handbook</a>. , [about 27p.]. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.qiagen.com/handbooks">http://www.qiagen.com/handbooks</a> (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PyroMark+Q24+User+Manual%22">PyroMark Q24 User Manual</a>. , [about 27p.]. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.qiagen.com/handbooks">http://www.qiagen.com/handbooks</a> (2012).</li>
<li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Bio%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li>
<li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li>
<li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120(2007).</li>
<li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology%3A+From+genes+to+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li>
<li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li>
<li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li>
<li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+A+simple+method+for+accurate+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630(2008).</li>
<li>Rothberg, J. W., Heinz,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li>
<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li>
<li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li>
<li>Sequencing Technology | Sequencing by Synthesis | Illumina [Internet]. , Illumina. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn">http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn</a> (2012).</li>
</ol>

Produzione e libero accesso a questo articolo è sponsorizzato da Qiagen. Autori Ahmed, Durocher, Jessen e Vardi sono dipendenti di Qiagen Inc. che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Sono stati commercializzati diversi nuovi metodi di sequenziamento di nuova generazione. Tre dei metodi più usati sono ioni semiconduttori sequenziamento, di singola molecola tempo reale sequenziamento, e sequenziamento per sintesi (SBS). 3-11 Ciascuno di questi metodi dipende sequenziamento per sintesi ma impiegano piattaforme innovative per la rilevazione dei nucleotidi incorporati. In ione semiconduttori sequenziamento, un singolo filamento di DNA serve come modello per il filamento sequenziamento. Polimerasi e 12 nucleotidi vengono aggiunti sequenzialmente come nella pyrosequencing. Quando viene aggiunto un nucleotide al filamento di DNA crescente, uno ione idrogeno viene rilasciato. Lo ione idrogeno viene rilevata da un sensore basato transistor ad effetto di campo. Molecola singola tempo reale sequenziamento dipende dalla modalità di guida d&#39;onda zero (ZMW). 13 La ZMW è una piccola struttura dove una singola molecola polimerasi è attaccata al fondo del pozzo. Viene illuminato in modo tale che un floreprofumo molecola può essere rilevato. Ogni nucleotide è etichettato con una molecola fluorescente. Come un nucleotide fluorescente con tag è incorporato, un rivelatore identifica il nucleotide. Quando è aggiunto il seguente nucleotide, la molecola fluorescente viene scissa. 14 Sequenziamento per sintesi (SBS) utilizza un metodo unico per amplificare il DNA bersaglio tale che i gruppi di sequenze uniche sono generati. 15 singoli modelli stranded sono generati e quindi il filamento complementare è sintetizzato. Ciascun nucleotide è etichettato con una molecola fluorescente e dopo ogni aggiunta di base la fluorescenza la base aggiunta è registrato.

Pyrosequencing è un metodo rapido e preciso per gli acidi nucleici di sequenza che si basa sul principio di &quot;sequenziamento per sintesi&quot;. &quot;Sequencing per sintesi&quot; comporta l&#39;uso di un singolo filamento stampo di DNA per sintetizzare il filamento complementare una base alla volta, e rilevando la base incorporata (A, T, G, o C) ad ogni passo per rilevamento di un segnale chemiluminescente. La reazione pirosequenziamento comprende DNA stampo, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA polimerasi, ATP sulfurilasi, luciferina, luciferasi, e apyrase. La reazione di sintesi è iniziata con l&#39;aggiunta di uno dei quattro dNTP e DNA polimerasi al DNA stampo singolo filamento biotinilato. DNA polimerasi incorpora il dNTP complementare sulla dima, con il successivo rilascio di pirofosfato (Figura 1). ATP sulfurilasi converte proporzionalmente il pirofosfato di ATP. ATP agisce come un catalizzatore per la conversione luciferasi-mediata di luciferina ad oxyluciferin, chegenera luce (Figura 2). L&#39;intensità della luce è proporzionale al numero di nucleotidi incorporati e determina se è presente sul filamento stampo in sequenza (Figura 3) uno o più specifici di dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP o). Ogni dNTP non incorporata è degradata dalla apyrase prima dell&#39;aggiunta del successivo dNTP per la continuazione della reazione di sintesi. Questa &quot;sequenziamento mediante sintesi&quot; reazione viene ripetuto con aggiunta di ciascuno dei quattro dNTP finché la sequenza di DNA del template DNA a singolo filamento è determinata. Per visualizzare un&#39;animazione della reazione pyrosequencing <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere film</a> .

<table><tbody><tr><td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>CoralLoad Concentrate, 10x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>Q-Solution, 5x Qiagen</td><td></td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, 25 mM</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>Primer Qiagen 129112</td><td></td><td></td><td></td>acqua priva di RNasi</tr><tr><td></td><td>I primer Qiagen</td><td>978776 o 978777</td><td>devono essere acquistati da un produttore di oligonucleotidi affermato (es QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, ecc.). I primer liofilizzati devono essere disciolti in TE per fornire una soluzione madre di 100 &mu;M.</td></tr><tr><td>Reagenti Pyromark Gold Q24</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ad alta purezza (Milli-Q 18,2 M&Omega; x cm o equivalente)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perline di streptavidina sefarosio ad alte prestazioni GE</td><td>Healthcare</td><td>17-5113-07</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Tampone di ricottura</td><td>Qiagen</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di denaturazione PyroMark</td><td>Qiagen</td><td>979007</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Wash Buffer</td><td>Qiagen</td><td>979008</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>9001514</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Cartuccia</td><td>Qiagen</td><td>979202</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q96 HS Scatola porta punte</td><td>Qiagen</td><td>979105</td> PyroMark Q24 Vacuum Workstation Qiagen 9001516 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Plate Holder</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>9022273</tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Fisher</td><td>11-675-297</td><td></td></tr><tr><td>Blocco termico</td><td>Fisher</td><td>11-718Q</td><td></td></tr></tbody></table>

pyrosequencing per identificazione microbica e caratterizzazione

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing è una tecnica versatile che facilita microbica sequenziamento del genoma che può essere utilizzato per identificare le specie batteriche, discriminare ceppi batterici e rilevare mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli agenti antimicrobici. I vantaggi di pyrosequencing per applicazioni di microbiologia includono rapido e affidabile high-throughput screening e l&#39;identificazione accurata di microbi e mutazioni del genoma microbici. Pyrosequencing comporta sequenziamento del DNA sintetizzando il filamento complementare un&#39;unica base alla volta, mentre la determinazione dell&#39;essere nucleotidica specifica incorporati durante la reazione di sintesi. La reazione avviene in immobilizzata singolo filamento DNA stampo dove vengono aggiunti sequenzialmente le quattro deoxyribonucleotides (dNTP) e le dNTP non incorporati sono degradati enzimaticamente prima dell&#39;aggiunta del successivo dNTP alla reazione di sintesi. Individuazione della base specifica incorporato nel modello viene monitorata da generazione di chemilumsegnali inescent. L&#39;ordine dei dNTP che producono i segnali chemiluminescenti determina la sequenza di DNA del modello. La capacità sequenziamento tempo reale di tecnologia pyrosequencing consente una rapida identificazione microbica in un singolo test. Inoltre, lo strumento pyrosequencing, in grado di analizzare la piena diversità genetica di anti-resistenza ai farmaci antimicrobici, compresi tipizzazione di SNPs, mutazioni puntiformi, inserzioni e delezioni, nonché la quantificazione delle copie multiple del gene che possono verificarsi in una certa resistenza antimicrobica modelli.

I risultati di una tipica corsa pyrosequencing utilizzando il software mostra la posizione dei primer forward e reverse utilizzati per la generazione amplicone, e il primer sequenziamento utilizzato per la reazione pyrosequencing all&#39;interno della sequenza conservata ribosomiale 16S (Figura 10). La sequenza ipervariabile tra il primer siti permette di identificazione batterica di un gran numero di specie batteriche utilizzando il primer di sequenziamento conservata (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Come controllo qualità interno, la sequenza di DNA della regione bracketing variabile può essere controllato per assicurare che la regione di DNA corretta è stata analizzata . Il software pirosequenziamento permette la comparazione e l&#39;allineamento della sequenza generata da un database interno di sequenze ribosomali batteriche di identificazione batterica. Inoltre, una sequenza può essere analizzato per determinare mutazioni che conferiscono resistenza agli antibiotici. Per esempio, l&#39;analisi di mutazioni nei geni 23S ribosomiale Helicobpylori tere dimostra due modelli di mutazione (GAA o AGA) che conferiscono resistenza agli antibiotici (Figura 11). Analisi di isolati multipli dello stesso paziente può essere contemporaneamente analizzati per monitorare la comparsa di resistenza ai farmaci nel tempo per aiutare nelle indagini epidemiologiche microbiche focolai di resistenza ai farmaci. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Figura 1. Biotinilato prodotto della PCR è utilizzato come modello per incorporare dNTPs dalla DNA polimerasi, che porta alla generazione di pirofosfato (PPi). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Figura 2. ATP sulfurilasi converte proporzionalmente pirofosfato di ATP. ATP agisce come un catalizzatore per la conversione luciferasi-mediata di luciferina ad oxyluciferin, che genera luce che è proproporzionale alla quantità di ATP. La luce viene registrato come picco sulla traccia pyrogram e indica l&#39;incorporazione di nucleotidi. I dNTPs non incorporati sono degradati da apyrase prima di aggiungere il successivo dNTP per la continuazione della sintesi. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Figura 3. L&#39;intensità della luce generata indica se è stata costituita una o più specifiche di dNTP (dATP, dTTP, dGTP, o dCTP) sul filamento stampo in modo sequenziale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Figura 4. Diagramma di flusso per la preparazione della Master Mix per immobilizzare il prodotto di PCR biotinilato. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;always&quot;&gt; Figura 5. PyroMark postazione di lavoro, con la piastra PCR, piastra PyroMark, e sedi di valle. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> Figura 6. Posizioni dell&#39;interruttore di vuoto posizioni ON e OFF. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Figura 7. Strumento di vuoto. Corretta gestione dello strumento vuoto. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Figura 8. Cancello cartuccia aperta con cartuccia in posizione. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> Figura 9. Cartuccia inserita correttamente con cancello chiuso. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> La figura 10. Pirosequenziamento risultati di identificazione batterica based. Primer PCR sono progettati per regioni conservate del DNA stampo, e il primer di sequenziamento è posizionato immediatamente a monte di una sequenza di DNA che identifica ipervariabile ben caratterizzato all&#39;interno amplicone (in blu). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> Figura 11. Rilevamento di antibiotico resistenza in Helicobacter pylori mediante pyrosequencing. Analisi di mutazioni nei geni 23S che conferiscono resistenza antibatterica in Helicobacter pylori contenente GAA o sequenze di AGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Componente </td><td> Volume per reazione </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 ml </td><td> 1x </td></tr><tr><td> CoralLoad Concentrato, 10x </td><td> 2,5 microlitri </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM di MgCl2 (opzionale) </td><td> Variabile </td><td> ≥ 1.5 mM </td></tr><tr><td> Q-Solution, 5x (opzionale) </td><td> 5 microlitri </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / B Primer </td><td> Variabile / Variabile </td><td> 0.2 μM/0.2 mM </td></tr><tr><td> Acqua RNase-free </td><td> Variabile </td><td> - </td></tr><tr><td> Volume totale (dopo l&#39;aggiunta di DNA stampo) </td><td> 25 pl </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. PCR miscela di reazione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Ulteriori commenti </td></tr><tr><td> Iniziale fase di attivazione PCR </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA polimerasi è attivato </td></tr><tr><td> 3 step ciclismo: denaturazione </td><td> 30 sec </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Ricottura </td><td> 30 sec </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Per il DNA genomico Per bisolfito DNA convertito </td></tr><tr><td> Estensione </td><td> 30 sec </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Numero di cicli </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estensione finale </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. PCR Specifiche ciclabili.

Pyrosequencing è una tecnica versatile che facilita microbica sequenziamento del genoma che può essere utilizzato per identificare le specie batteriche, discriminare ceppi batterici, e rilevare mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli agenti antimicrobici. In questo video, verrà dimostrata la procedura per la generazione microbica amplicone, amplicone pyrosequencing, e l&#39;analisi di sequenza del DNA.

Pyrosequencing per identificazione microbica e caratterizzazione

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare un batterio mediante analisi della sequenza del DNA ribosomiale 16S utilizzando la metodologia di pirosequenziamento. Questo viene ottenuto innanzitutto amplificando il DNA bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) con un primer biotinilato. L'amplicone biotinilato viene quindi immobilizzato mediante perle sferiche rivestite di streptavidina e purificato utilizzando soluzioni di lavaggio.Successivamente, l'amplicone viene denaturato e i primer per il sequenziamento del ribosoma 16 s si legano alle singole catene di DNA. L'obiettivo di questo passaggio è preparare il DNA per il sequenziamento. Infine, la reazione di sequenziamento del DNA avviene mediante pirosequenziamento, un metodo rapido e accurato per sequenziare gli acidi nucleici basato sul principio del sequenziamento per sintesi.L'aliquna biotinilata viene utilizzata come stampo dalla DNA polimerasi per incorporare i DNTP un nucleotide alla volta, portando alla generazione di pirofosfato. L'ATP sulfuriase converte in modo proporzionale il pirofosfato in ATP. L'ATP catalizza la conversione mediata dalla luciferasi della luciferina in ossiluciferina, processo che genera luce proporzionale alla quantità di ATP. La luce viene registrata come un picco sul tracciato pirosequenziale e indica l'incorporazione del nucleotide. I DNTP non incorporati vengono degradati dall'apirasi prima che venga aggiunto il successivo DNTP per proseguire la sintesi.Il segnale chemiluminescente registrato sul programma permette di determinare la sequenza del DNA. I risultati ottenuti sono sequenze di DNA ribosomiale 16S, che vengono utilizzate per identificare il batterio mediante confronto con un database di riferimento di DNA ribosomiale. Il pirosequenziamento è una tecnica versatile che facilita il sequenziamento del genoma microbico e può essere impiegata per identificare specie batteriche, discriminare ceppi batterici e rilevare mutazioni genetiche responsabili della resistenza agli agenti antimicrobici.In questo video, verrà illustrata la procedura per la generazione di ampliconi batterici, il sequenziamento tramite pirosequenza e l'analisi delle sequenze di DNA. Per iniziare la procedura di amplificazione del templato, scongelare tutte le soluzioni necessarie e miscelarle accuratamente. Tutte le operazioni possono essere eseguite a temperatura ambiente. Impostare la reazione PCR secondo questa tabella.Si noti che una concentrazione finale di cloruro di magnesio pari a 1,5 millimolare fornirà risultati soddisfacenti nella maggior parte dei casi. Tuttavia, se è richiesta una concentrazione maggiore di magnesio, è possibile aggiungere fino a 3,5 microlitri di cloruro di magnesio 25 millimolare a una reazione. Uno dei primer deve essere biotinilato al suo estremo 5', e si raccomanda che il primer sia purificato accuratamente mediante HPLC.Mescolare la miscela di reazione aspirando e dispensando delicatamente con una pipetta, quindi distribuire i volumi appropriati in provette per PCR. Successivamente, aggiungere il DNA stampo in ogni provetta per PCR. Si raccomandano 10 nanogrammi di DNA genomico per reazione.Posizionare le provette PCR in un termociclatore e avviare questo programma di ciclaggio prima di preparare il mix maestro. Agitare delicatamente il flacone di streptavidina e perle sieriche rivestite per garantire una sospensione omogenea. Preparare un mix maestro seguendo questo diagramma di flusso.Combinare perline, buffer di legame e acqua ad alta purezza in un tubo da microcentrifuga. A seconda del volume del prodotto PCR utilizzato, distribuire da 60 a 75 microlitri di mix master in ciascun pozzetto di una piastra PCR in modo che il volume totale sia di 80 microlitri per pozzetto. Aggiungere da cinque a venti microlitri di prodotto PCR biotinilato in ciascun pozzetto.Il volume per pozzetto deve ora essere di 80 microlitri. Sigillare i pozzetti con tappi a striscia e agitare la piastra PCR a 1.400 giri al minuto per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente utilizzando un agitatore orbitale. Iniziare questa procedura diluendo i primer di sequenziamento fino a 0,3 micromolare con un buffer apposito e dispensando 25 microlitri in ciascun pozzetto della piastra di reazione.Posizionare la piastra sulla stazione di vuoto. Riempire le vaschette della stazione secondo questo schema: 50 millilitri di etanolo al 70% nella vaschetta uno, 40 millilitri di soluzione di denaturazione nella vaschetta due, 50 millilitri di buffer di lavaggio nella vaschetta tre, 50 millilitri di acqua ad alta purezza nella vaschetta quattro e 70 millilitri di acqua ad alta purezza nella vaschetta cinque.Accendere la pompa a vuoto e assicurarsi che l'interruttore dello strumento a vuoto sia impostato su "on" per lavare le sonde del filtro con acqua ad alta purezza. Nella vaschetta cinque, posizionare la piastra PCR con le perle sulla stazione di lavoro, verificando che sia la piastra PCR sia la piastra di reazione siano orientate nello stesso modo. Abbassare lo strumento a vuoto nei pozzetti della piastra PCR.Per 20 secondi o fino a quando tutto il volume sarà stato aspirato, le perle verranno trattenute dallo strumento a vuoto con il vuoto ancora attivo. Risciacquare lo strumento con etanolo al 70% per 20 secondi o fino a quando tutto il volume sarà stato aspirato. Successivamente, risciacquare lo strumento con soluzione di denaturazione per 20 secondi o fino a quando tutto il volume sarà stato aspirato.Successivamente, risciacquare lo strumento con tampone di lavaggio per 20 secondi o fino a quando tutto il volume è stato aspirato, mantenendo ancora acceso il vuoto. Sollevare lo strumento a vuoto oltre i 90 gradi rispetto alla verticale per cinque secondi, in modo che tutto il liquido defluisca. Spegnere ora la pompa e allineare lo strumento a vuoto con la piastra di reazione a tre pozzetti.Abbassare lo strumento a vuoto nei pozzetti. Quindi agitare delicatamente da un lato all'altro per circa 10 secondi per rilasciare le perle nei pozzetti contenenti il primer di sequenziamento. Posizionare lo strumento a vuoto nel lavandino per la pulizia per consentire l'appaiamento del primer di sequenziamento al DNA.Posizionare la piastra della reazione in un supporto per piastre preriscaldato. Riscaldare la piastra a 80 gradi Celsius per due minuti. Rimuovere la piastra dal supporto e posizionarla sul bancone per farla raffreddare a temperatura ambiente per cinque minuti.Avviare questa procedura accendendo lo strumento tramite l'interruttore di alimentazione situato sopra il cavo di alimentazione, per determinare i volumi necessari. Configurare un file di esecuzione nel software dello strumento e, nel menu Strumenti, selezionare le informazioni preliminari all'esecuzione. Riempire una cartuccia seguendo le istruzioni riportate nella pagina delle informazioni preliminari all'esecuzione.Inserire la punta della pipetta nell'angolo di ogni pozzetto il più in basso possibile, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria. Aprire il cassetto e inserire la cartuccia con l'etichetta rivolta in avanti. Assicurarsi che la cartuccia sia correttamente inserita e chiudere il cassetto.Aprire il telaio di bloccaggio della piastra e posizionare la piastra di reazione all'interno dello strumento. Chiudere il telaio di bloccaggio della piastra e il coperchio dello strumento. Inserire la chiavetta USB contenente i file di esecuzione creati con il software dello strumento nella porta USB situata sul lato anteriore dello strumento.Ok per visualizzare il menu dei file di esecuzione desiderati. Utilizzare le frecce di scorrimento per selezionare il file di esecuzione desiderato e premere seleziona. Quando tutti i livelli preimpostati di pressione e temperatura sono stati raggiunti, lo strumento inizierà a dispensare i reagenti durante l'esecuzione.Lo schermo dello strumento mostra in tempo reale il piro della pozzetta selezionata. Utilizzare le frecce di scorrimento per visualizzare i piro delle altre pozzette. Quando lo strumento conferma che l'esecuzione è terminata e che il file di esecuzione è stato salvato sulla chiavetta USB, premere chiudi.Rimuovere la chiavetta USB. Di seguito sono mostrati i risultati di un tipico esperimento di pirosequenziamento. I primer PCR forward e reverse sono progettati per regioni conservate del modello di DNA, ovvero la sequenza ribosomiale 16 s.In questo esempio, il primer di sequenziamento è posizionato immediatamente a monte di una sequenza ipervariabile del DNA ben caratterizzata e identificativa, contenuta nell'amplicone mostrato in blu. Questa sequenza ipervariabile consente l'identificazione batterica di un ampio numero di specie batteriche; utilizzando il primer di sequenziamento conservato come controllo interno di qualità, è possibile verificare la sequenza del DNA adiacente alla regione variabile per assicurare che sia stata analizzata la corretta regione del DNA. Il software di pirosequenziamento permette il confronto e l'allineamento della sequenza ottenuta con un database interno di sequenze ribosomiali batteriche per l'identificazione dei batteri.Inoltre, una sequenza può essere analizzata per determinare le mutazioni che conferiscono resistenza ai farmaci antibiotici. Ad esempio, l'analisi delle mutazioni nei geni ribosomiali 23 s di Helicobacter pylori rivela due pattern di mutazione, GAA o una GA, che conferiscono resistenza agli antibiotici. Il pirosequenziamento è una tecnica versatile che facilita il sequenziamento del genoma microbico.I vantaggi del sequenziamento pirosequenziale in applicazioni di microbiologia includono lo screening rapido e affidabile ad alto rendimento e l'identificazione accurata di microrganismi e mutazioni del genoma microbico. Inoltre, la metodologia del pirosequenziamento può analizzare l'intera diversità genetica della resistenza ai farmaci antimicrobici, compresa la tipizzazione di mutazioni puntiformi SNP, inserzioni e delezioni, nonché la quantificazione di copie multiple di geni che possono verificarsi in alcuni modelli di resistenza antimicrobica. Grazie per aver guardato questo video e buona fortuna con i vostri esperimenti di sequenziamento.

pyrosequencing-for-microbial-identification-and-characterization

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pirosequenziamento (R) è uno dei metodi più approfondita ma semplice fino ad oggi utilizzato per analizzare polimorfismi. Questo metodo ha portato a un rapido ed efficiente a singolo nucleotide valutazione polimorfismo tra cui molti polimorfismi clinicamente rilevanti. La tecnica e la metodologia della Pyrosequencing è spiegato.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

La comunità batterica attivo associato con l'intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l'identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all'interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.

Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell&#39;intestino del generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosio

Caratterizzare la comunità microbica è stato un obiettivo di lunga data nella microbiologia ambientale. I metodi di sequenziamento di nuova generazione consentono ora la caratterizzazione delle comunità microbiche a una profondità senza precedenti, con costi e manodopera minimi. Descriviamo qui il nostro approccio al sequenziamento dei geni dell'RNA ribosomiale batterico 16S utilizzando un sequenziatore da banco.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) e le tecniche molecolari (sequenziamento genico dell'rRNA 16S) consentono l'identificazione di patogeni batterici rari nella diagnostica di routine. L'obiettivo di questo protocollo risiede nella combinazione di entrambe le tecniche che porta a dati più accurati e affidabili.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

Presentiamo il processo di isolamento, propagazione e caratterizzazione dei batteri che degradano gli idrocarburi dagli habitat acquatici. Il protocollo delinea l'isolamento batterico, l'identificazione con il metodo 16S rRNA e il test del loro potenziale di degradazione degli idrocarburi. Questo articolo aiuterebbe i ricercatori a caratterizzare la biodiversità microbica nei campioni ambientali e in particolare a selezionare i microbi con potenziale di biorisanamento.

Isolamento, propagazione e identificazione di specie batteriche con proprietà metabolizzanti di idrocarburi da habitat acquatici

I saggi di pirosequenziamento consentono la genotipizzazione robusta e rapida dei polimorfismi a singolo nucleotide del DNA mitocondriale in cellule o tessuti eteroplasmatici.

Polimorfismi genotidici a singolo nucleotide nel genoma mitocondriale mediante pirosequenziamento

Il presente articolo si propone di fornire protocolli dettagliati e adeguati per l'isolamento di funghi endofiti associati alle piante, la conservazione a lungo termine degli isolati, la caratterizzazione morfologica e l'estrazione del DNA totale per la successiva identificazione molecolare e analisi metagenomica.

Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

Utilizzando glicosidasi specifico per rimuovere gli zuccheri da glicoproteine ​​seguita da SDS-PAGE è un metodo valido per individuare modifiche glycan su campioni di proteine ​​ed è una buona scelta per gli studi Glycobiology iniziale. Seguenti modifiche deglycosylation possono essere rilevati come spostamenti della mobilità gel o con la colorazione glycan reagenti sensibili.

Identificazione e caratterizzazione di glicosilazione delle proteine ​​con specifiche endo-e exoglycosidases

Impara la pirosintesi per identificare batteri tramite analisi del DNA ribosomiale 16S. Questo metodo consente la caratterizzazione microbica e il rilevamento di mutazioni genetiche associate alla resistenza antimicrobica.

Pyrosequencing per identificazione microbica e caratterizzazione

Esplora altri video