Pyrosequencing per identificazione microbica e caratterizzazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare un batterio attraverso l'analisi della sequenza di DNA ribosomiale 16 s utilizzando la metodologia del pirosequenziamento. Ciò si ottiene amplificando prima il DNA bersaglio attraverso una reazione a catena della polimerasi utilizzando un primer biotinilato. L'amplicone biotinilato viene quindi immobilizzato utilizzando perle di spheros rivestite di streptavidina e purificato utilizzando tamponi di lavaggio.

Successivamente, l'amplicone viene denaturato e i primer di sequenziamento ribosomiale a 16 s vengono ELL ai singoli filamenti di DNA. L'obiettivo di questa fase è preparare il DNA per il sequenziamento. Infine, la reazione di sequenziamento del DNA avviene mediante pirosequenziamento, un metodo rapido e accurato per sequenziare gli acidi nucleici basato sul principio del sequenziamento per sintesi.

L'alicon biotinilato viene utilizzato come stampo dalla DNA polimerasi per incorporare DN TPS una base alla volta, portando alla generazione di pirofosfato. Un TP Sul ureasi converte proporzionalmente il pirofosfato in A-T-P-A-T-P catalizza la conversione mediata dalla luciferasi di Lucifero in Lucifero, che genera luce proporzionale alla quantità di un TP. La luce viene registrata come un picco sulla traccia pirotifosa e indica l'incorporazione dei nucleotidi. I DN NTP non incorporati vengono degradati da apras prima che venga aggiunto il DNTP successivo per continuare la sintesi.

Il segnale chemiluminescente registrato sul rogramma consente di determinare la sequenza del DNA. I risultati ottenuti sono sequenze di SDNA ribosomiali 16, che vengono utilizzate per identificare il batterio confrontandole con un database di riferimento del DNA ribosomiale. Il pirosequenziamento è una tecnica versatile che facilita il sequenziamento del genoma microbico e può essere utilizzata per identificare specie batteriche, discriminare ceppi batterici e rilevare mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli agenti antimicrobici.

In questo video, verrà dimostrata la procedura per la generazione di ampliconi batterici, il pirosequenziamento dell'amplicone e l'analisi della sequenza del DNA Per iniziare la procedura per l'amplificazione del modello, scongelare tutte le soluzioni necessarie e mescolarle accuratamente. Tutti i lavori possono essere eseguiti a temperatura ambiente. Impostare la reazione PCR secondo questa tabella.

Si noti che una concentrazione finale di cloruro di magnesio di 1,5 millimolari fornirà risultati soddisfacenti nella maggior parte dei casi. Tuttavia, se è richiesta una concentrazione di magnesio più elevata fino a 3,5 microlitri di 25 millimolari, il cloruro di magnesio può essere aggiunto a una reazione. Un primer deve essere biotinilato alla sua estremità di cinque primi e si raccomanda che il primer sia accuratamente purificato HPLC.

Miscelare la miscela di reazione pipettandola delicatamente su e giù, quindi erogare i volumi appropriati nelle provette per PCR. Quindi, aggiungi il DNA modello a ciascuna provetta PCR. Si consigliano 10 nanogrammi di DNA genomico per reazione.

Posizionare le provette per PCR in un ciclatore e avviare questo programma di ciclo prima di preparare la miscela master. Agitare il flacone di perle di siero rivestite e rivestite per garantire una sospensione omogenea. Prepara un mix master secondo questo diagramma di flusso.

Combinazione di perline, tampone legante e acqua ad alta purezza in una provetta per microcentrifuga. A seconda del volume di prodotto PCR utilizzato, erogare da 60 a 75 microlitri di miscela master in ciascun pozzetto di una piastra PCR in modo che il volume totale sia di 80 microlitri per pozzetto. Aggiungere da cinque a 20 microlitri di prodotto Biotinilato PCR in ogni pozzetto.

Il volume per pozzetto dovrebbe ora essere di 80 microlitri. Sigillare i pozzetti con tappi a strisce e agitare la piastra PCR a 1.400 giri/min per cinque-10 minuti a temperatura ambiente utilizzando un agitatore orbitale. Iniziare questa procedura diluendo i primer di sequenziamento a 0,3 micromolari con un tampone in ginocchio ed erogando 25 microlitri in ciascun pozzetto della piastra di reazione.

Posizionare la piastra sulla postazione di aspirazione. Riempire le vasche della postazione di lavoro secondo questo diagramma. 50 millilitri di etanolo al 70% in un trogolo, 40 millilitri di soluzione di denaturazione in un trogolo due, 50 millilitri di tampone di lavaggio in tre, 50 millilitri di acqua ad alta purezza in quattro trogoli e 70 millilitri di acqua ad alta purezza in cinque trogole.

Accendere la pompa del vuoto e assicurarsi che l'interruttore sullo strumento di aspirazione sia impostato su on per sciacquare le sonde del filtro con acqua ad alta purezza. Nella vasca cinque, posizionare la piastra PCR con le perle sulla stazione di lavoro assicurandosi che sia la PCR che le piastre di reazione siano nello stesso orientamento. Abbassare lo strumento per il vuoto nei pozzetti della piastra PCR.

Per 20 secondi o fino a quando tutto il volume è stato aspirato, le perle verranno catturate dall'aspiratore con l'aspirapolvere ancora acceso. Sciacquare l'utensile con etanolo al 70% per 20 secondi o fino a quando tutto il volume non è stato aspirato. Quindi, sciacquare lo strumento con la soluzione di denaturazione per 20 secondi o fino a quando tutto il volume non è stato aspirato.

Successivamente, sciacquare l'utensile con il tampone di lavaggio per 20 secondi o fino a quando tutto il volume non è stato aspirato con l'aspirapolvere ancora acceso. Sollevare l'aspirapolvere a oltre 90 gradi in verticale per cinque secondi per consentire a tutto il liquido di defluire dall'aspirapolvere. Ora spegni la pompa e allinea lo strumento di aspirazione con tre piastre di reazione.

Abbassare lo strumento di aspirazione nei pozzetti. Quindi agitare delicatamente da un lato all'altro per circa 10 secondi per rilasciare le perle nei pozzetti contenenti il primer di sequenziamento. Posizionare lo strumento di aspirazione nell'abbeveratoio per la pulizia per aneel il primer di sequenziamento al DNA.

Posizionare la piastra di reazione in un supporto per piastre di preriscaldamento. Scaldare la piastra a 80 gradi Celsius per due minuti. Togliete il piatto dal supporto e posizionatelo sul bancone per raffreddarlo a temperatura ambiente per cinque minuti.

Iniziare questa procedura accendendo lo strumento utilizzando l'interruttore di alimentazione situato sopra il cavo di alimentazione per determinare i volumi necessari. Impostare un file di esecuzione nel software dello strumento e, nel menu degli strumenti, selezionare le informazioni pre-esecuzione. Riempire una cartuccia seguendo le istruzioni fornite nella pagina delle informazioni pre-esecuzione.

Posizionare il puntale della pipetta nell'angolo di ciascun pozzetto il più in basso possibile, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria. Aprire lo sportello della cartuccia e inserire la cartuccia con l'etichetta rivolta in avanti. Assicurarsi che la cartuccia sia inserita correttamente e chiudere il cancello.

Aprire il telaio porta piastra e posizionare la piastra di reazione all'interno dello strumento. Chiudere il telaio portatarga e il coperchio dello strumento. Inserire la chiavetta USB con i file di esecuzione creati con il software dello strumento nella porta USB nella parte anteriore della pressa dello strumento.

Va bene vedere il menu dei file di esecuzione desiderati. Utilizzare le frecce di scorrimento per selezionare il file di esecuzione desiderato e premere seleziona. Quando vengono raggiunti tutti i livelli di pressione e temperatura preimpostati, lo strumento inizierà a erogare i reagenti durante una seduta.

Lo schermo dello strumento visualizza in tempo reale il piro del pozzo selezionato. Usa le frecce di scorrimento per visualizzare i piro di altri pozzi. Quando lo strumento conferma che la seduta è terminata e il file di corsa è stato salvato sulla chiavetta USB, premere Chiudi.

Rimuovere la chiavetta USB. I risultati di una tipica corsa di pirosequenziamento sono mostrati qui. I primer PCR diretti e inversi sono progettati per le regioni conservate del modello di DNA, che è la sequenza ribosomiale a 16 s.

In questo esempio, il primer di sequenziamento è posizionato immediatamente a monte di una sequenza di DNA ipervariabile ben caratterizzata all'interno dell'amplicone mostrato in blu. Questa sequenza ipervariabile consente l'identificazione batterica di un gran numero di specie batteriche utilizzando il primer di sequenziamento conservato come controllo di qualità interno, la sequenza di DNA che circonda la regione variabile può essere controllata per garantire che sia stata analizzata la regione di DNA corretta. Il software di pirosequenziamento consente il confronto e l'allineamento della sequenza generata a un database interno di sequenze ribosomiali batteriche per l'identificazione batterica.

Inoltre, una sequenza può essere analizzata per determinare le mutazioni che conferiscono resistenza ai farmaci antibiotici. Ad esempio, l'analisi delle mutazioni nei 23 geni ribosomiali dell'helicobacter pylori rivela due modelli di mutazione, GAA o GA, che conferiscono resistenza agli antibiotici. Il pirosequenziamento è una tecnica versatile che facilita il sequenziamento del genoma microbico.

I vantaggi del pirosequenziamento dalle applicazioni microbiologiche includono uno screening rapido e affidabile ad alto rendimento e l'identificazione accurata di microbi e mutazioni del genoma microbico. Inoltre, la metodologia di pirosequenziamento può analizzare l'intera diversità genetica della resistenza ai farmaci antimicrobici, compresa la tipizzazione delle mutazioni puntiformi degli SNP, le inserzioni e le delezioni, nonché la quantificazione di più copie geniche che possono verificarsi in alcuni modelli di resistenza antimicrobica. Grazie per aver guardato questo video e in bocca al lupo per i vostri esperimenti di sequenziamento.