Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

La ricerca genetica ha tratto grande beneficio dalla pubblicazione della sequenza del genoma umano. Il pirosequenziamento è un sistema unico che consente l'analisi della variazione genetica, nonché dello squilibrio allelico dell'RNA, del DNA, dello stato di metilazione e del numero di copie geniche. In questo video, mostriamo una reazione di base di pirosequenziamento per l'analisi genetica.

Ciao, sono Kristy King del laboratorio del Dottor Charles Eby e del Dottor Brian Gage del Dipartimento di Medicina Interna della Washington University School of Medicine. Oggi vi mostreremo una procedura per il pirosequenziamento. Questa procedura è utile perché rappresenta uno dei metodi più accurati e al contempo semplici per analizzare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP).

Il pirosequenziamento si basa sul sequenziamento per sintesi, sfruttando il rilascio di pirofosfato ogni volta che un nucleotide viene incorporato in un filamento di DNA con estremità tre prime libera. Una volta caricata la piastra, i nucleotidi vengono incorporati in base a una sequenza fornita dal software. Una volta rilasciato, il pirofosfato viene utilizzato in una reazione che porta al rilascio di ATP, il quale viene utilizzato dalla luciferasi per convertire la luciferina in oxiluciferina, generando l'emissione di luce. La luce emessa viene raccolta da una camera CCD e registrata come picchi, noti anche come pirogrammi.

I nucleotidi non incorporati nel filamento di DNA vengono degradati dalla AP pyra per prevenire rumore di fondo. Questa procedura comprende i seguenti passaggi: progettazione del saggio, elettroforesi su gel PCR per il controllo di qualità e pirosequenziamento.

Iniziamo con il sequenziamento pirosequenziale. Per eseguire il pirosequenziamento, è necessario prima preparare un prodotto di PCR. La PCR per il pirosequenziamento richiede un numero maggiore di cicli rispetto alla maggior parte delle PCR, al fine di assicurare l'esaurimento completo del primer, circa 50 cicli.

Il pirosequenziamento richiede inoltre che uno dei primer PCR sia biotinilato. Infine, è importante notare che è necessario anche un primer interno. Un design efficiente del saggio può essere eseguito utilizzando il software fornito insieme al pirosequenziamento, al fine di garantire l'assenza di contaminazioni.

E per confermare la presenza del prodotto PCR, è necessario eseguire un gel su alcuni campioni, insieme a un controllo negativo. Per preparare la piastra per il sequenziamento pirosequenziale, aggiungere 12 microlitri della miscela di primer per pirosequenziazione alla piastra da 96 pozzetti per pirosequenziazione. Questo richiede una miscela di 43,2 microlitri di primer interno, insieme a 1396,8 microlitri di un buffer tampone; coprire quindi la piastra per pirosequenziazione con un film adesivo.

Se l'allestimento richiede più di 50 minuti per ogni pozzetto della piastra PCR a 96 pozzetti, aggiungere 70 microlitri di SRO speed mix contenente 240 microlitri di sero speeds rivestiti con streptavidina, 560 microlitri di buffer di legame, costituito da tris cloruro di sodio, EDTA e tween 20, e 3.600 microlitri di acqua, quindi richiudere accuratamente il coperchio. Posizionare la piastra PCR a 96 pozzetti con la miscela di microsfera su un agitatore per piastre per cinque minuti a temperatura ambiente.

Assicurarsi che il coperchio sia ben chiuso per evitare qualsiasi contaminazione incrociata tra le pozzette. Questo passaggio permetterà un'efficiente legatura degli sferi rivestiti con streptavidina alle perle sferiche tramite il marcatore biotinico situato sul primer PCR. Allestire una postazione di lavoro per la preparazione delle piastre.

Questo include i serbatoi dei reagenti, la piastra per la miscela di prodotto PCR e perline e la piastra dei primer per il pirosequenziamento. Assicurarsi che la piastra della miscela di prodotto PCR e perline e la piastra dei primer per il pirosequenziamento siano correttamente allineate in modo che le negatività abbiano la stessa orientazione. Prima di trasferire i campioni, agitare lo strumento a vuoto, spento, in acqua pulita per rimuovere eventuali perline o detriti che potrebbero essere presenti.

Scartare l'acqua rimanente, riempire nuovamente la vaschetta e accendere il vuoto. Lasciare lo strumento a vuoto nella vaschetta fino a quando tutta l'acqua non è stata rimossa, circa 30 secondi. Inserire le punte filtro dello strumento a vuoto nei pozzetti della piastra contenente la miscela di perle PCR e lasciarlo fino a quando tutto il liquido non è stato eliminato dalla piastra.

Un leggero movimento oscillatorio può essere utilizzato per prevenire la tensione superficiale. Posizionare il vuoto nel canale contenente etanolo al 70% quando il liquido inizia a scorrere attraverso il tubo. Lasciare che le punte filtranti aspirino l'etanolo per cinque secondi.

Ripetere per l'idrossido di sodio 0,2 molare, che denatura il DNA in singoli filamenti per la PCR, e per il tampone di lavaggio. Per purificare e neutralizzare il prodotto della PCR. Scollegare il tubo del vuoto dallo strumento a vuoto e posizionare lo strumento a vuoto nella piastra per pirosequenziamento contenente il primer per pirosequenziamento in una miscela tampone in posizione inginocchiata.

Se il tubo del vuoto è ancora collegato, quando viene inserito nella piastra per il sequenziamento pirosequenziale, la miscela di primer verrà aspirata attraverso le punte, causando la perdita del prodotto PCR. Agitare delicatamente o oscillare le punte del vuoto nei pozzetti della piastra per il pirosequenziamento per distribuire il prodotto PCR.

Rimuovere lo strumento a vuoto dalla piastra di sequenziamento pirosequenziale al termine dell'agitazione o dell'oscillazione, quindi ricollegare lo strumento a vuoto al tubo e immergerlo in acqua pulita per pulirlo prima dell'utilizzo sulla piastra successiva. Posizionare la piastra di pirosequenziamento su un blocco riscaldato per due minuti a 80 gradi Celsius. Trascorsi due minuti, rimuovere la piastra dal blocco riscaldato e posizionarla su una superficie fredda.

Dopo il raffreddamento, si può utilizzare un film adesivo per coprire la piastra, a meno che la corsa non debba essere eseguita entro 15 minuti per prevenire l'evaporazione. Ora è il momento di iniziare il sequenziamento pirosequenziale. Il primo passaggio del pirosequenziamento consiste nell'inserire i dettagli del saggio nel computer.

Nella voce simplex, selezionare la nuova voce e inserire le informazioni del saggio, inclusi un nome ID e la sequenza da analizzare, forniti dal software di progettazione del saggio e necessari per il controllo di qualità; selezionare quindi l'ordine di dispensazione, che fornisce la sequenza intorno al SNP più le basi di controllo. Infine, selezionare gli istogrammi per ottenere una rappresentazione visiva dell'aspetto che dovrebbe avere il tuo pigram. Ora è il momento di avviare un'analisi snip.

Nella sezione snip e nella scheda generale, inserire un nome per la corsa e selezionare i parametri dello strumento per la corsa. Nella scheda impostazione, selezionare la voce del saggio e fare clic tenendo premuto per trascinare sulla piastra. Per inserire il saggio desiderato nella propria piastra, è importante notare che non è necessario utilizzare l'intera piastra, in quanto è possibile disattivare diversi pozzetti per l'analisi, e inoltre possono essere eseguiti molti saggi diversi sulla stessa piastra.

Fare clic sulla scheda visualizzazione e quindi selezionare Esegui. Questa pagina elenca i volumi appropriati di nucleotidi, enzima e substrato necessari per l'esecuzione. Pulire sia i nucleotidi o la capillare che le punte del reagente prima dell'uso.

Riempire le punte con acqua ed applicare pressione sulla parte superiore della punta per verificare la presenza di ostruzioni. Se l'acqua non fuoriesce dalla parte inferiore della punta, svuotare e riempire diverse volte nel tentativo di forzare il passaggio dell'acqua. In alternativa, è possibile sottoporre le punte a sonificazione se queste rimangono ostruite.

Scartare e utilizzare nuove punte. L'enzima e il substrato devono essere risospesi in acqua prima dell'uso. Se si agitano, potrebbero formarsi bolle d'aria che causano ostruzioni delle punte o una dispensazione non uniforme; l'enzima e il substrato risospesi non utilizzati possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius.

Per un uso futuro delle punte per dispensazione capillare in una provetta da microcentrifuga, effettuare una diluizione uno a uno con i nucleotidi e il tampone te P otto. Mescolare accuratamente prima dell'uso. Riempire le punte di nucleotidi e reagenti con i volumi appropriati in base alle quantità suggerite dal software.

Dispensare delicatamente il liquido lungo i lati delle punte per evitare di aspirare bolle d'aria che potrebbero causare ostruzioni. Accertarsi di controllare la presenza di bolle d'aria nelle punte di dispensazione dei nucleotidi. Se sono presenti bolle d'aria, basta battere leggermente sui lati delle punte finché le bolle non salgono in superficie oppure rimuoverle con una punta di pipetta pulita.

Eseguire una piastra di prova dopo aver riempito la cartuccia. Posizionare la cartuccia nell'apparecchio di sequenziamento pirosequenziale e la piastra di prova sulla piattaforma per piastre a 96 pozzetti. Applicare un film adesivo sulla piastra per permettere di osservare facilmente l'erogazione dei reagenti e dei nucleotidi.

Selezionare la scheda dello strumento sul lato sinistro dello schermo, quindi fare clic su "gestisci". Selezionare lo strumento dal menu a discesa. Fare clic su "test", e verrà visualizzato un avviso.

Chiedere di verificare che la piastra di prova sia stata inserita nello strumento. Fare clic su OK. Al termine, rimuovere la piastra di prova e al centro della piastra dovrebbero essere presenti gocce di liquido su sei pozzetti, che rappresentano i quattro nucleotidi, l'enzima e il substrato.

Se sono presenti meno di sei puntini piccoli, si è verificato un otturamento e le punte devono essere controllate e liberate da eventuali ostruzioni. Posizionare la piastra sulla piattaforma per sequenziamento pirosequenziale a 96 pozzetti. Chiudere tutte le leve e fare clic su esegui per la singola piastra.

Avviare l'allestimento: l'enzima, il substrato e i nucleotidi verranno dispensati in un ordine predeterminato. Una volta che il run è stato analizzato dal pirosequenziatore, è il momento di esaminarne i risultati. I pozzetti blu rappresentano un genotipo e un pirogramma validi.

Le pozzette arancioni richiedono un intervento umano e possono essere modificate facendo clic sulla pozzetta di interesse e aprendo l'istogramma previsto. Un genotipo può essere approvato, respinto o verificato, e lo stesso genotipo può essere modificato opportunamente. Una volta modificata una pozzetta, verrà visualizzato un cerchio scuro sulla mappa della piastra.

I controlli negativi devono essere valutati come negativi. Possono esserci picchi non specifici nei pozzetti negativi, tuttavia, ciò è tipicamente causato dal ripiegamento del primer interno. Abbiamo appena mostrato come eseguire il sequenziamento di una polimorfia nel genoma umano.

Il pirosequenziamento del DNA è utile rispetto ad altre procedure di sequenziamento perché è adattabile a un'ampia gamma di applicazioni. È inoltre sufficientemente robusto da gestire il DNA proveniente da qualsiasi fonte, inclusi DNA a bassa concentrazione e DNA degradato. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di iniziare con un prodotto PCR pulito e di buona qualità.

Includere un controllo negativo per ogni saggio e assicurarsi che tutti i reagenti siano idonei. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.