Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

La ricerca genetica ha beneficiato enormemente del rilascio della sequenza del genoma umano. Il pirosequenziamento è un sistema unico che consente l'analisi della variazione genetica, nonché dello squilibrio allelico dell'RNA, del DNA, dello stato di metilazione e del numero di copie geniche. In questo video, dimostriamo una reazione di pirosequenziamento di base per l'analisi genetica.

Ciao, sono Kristy King del laboratorio del Dr.Charles Eby e del Dr.Brian Gage nel Dipartimento di Medicina Interna della Washington University School of Medicine. Oggi vi mostreremo una procedura per il pirosequenziamento. Questa procedura è utile perché è uno dei metodi più approfonditi ma semplici utilizzati per analizzare gli SNP.

Il pirosequenziamento si basa sul sequenziamento per sintesi, sfruttando il rilascio di pirofosfato ogni volta che un nucleotide viene incorporato in un filamento di DNA aperto a tre prime. Una volta caricata una piastra, i nucleotidi vengono incorporati in base a una sequenza fornita dal software. Una volta rilasciato, il pirofosfato viene utilizzato in una reazione che provoca il rilascio di un TP, che viene utilizzato dalla luciferasi per convertire Lucifero in ossi Lucifero con conseguente emissione di luce. La luce ammessa viene raccolta da una telecamera CCD e registrata come picchi, noti anche come piros.

Tutti i nucleotidi non incorporati nel filamento di DNA vengono degradati da AP pyra per prevenire il rumore di fondo. Questa procedura prevede i passaggi seguenti. Progettazione del test, elettroforesi su gel PCR per il controllo qualità e il pirosequenziamento.

Iniziamo quindi con il pirosequenziamento. Per eseguire il pirosequenziamento, è necessario prima preparare un prodotto PCR. La PCR per il pirosequenziamento richiede più cicli rispetto alla maggior parte delle PCR per garantire che tutto il primer venga utilizzato fino a circa 50 cicli.

Il pirosequenziamento richiede anche che uno dei primer PCR sia biotinilato. Infine, è importante notare che è necessario anche un primer interno. La progettazione efficiente del saggio può essere eseguita con il software fornito tramite pirosequenziamento per garantire che non sia presente contaminazione.

E per confermare la presenza di un prodotto PCR, è necessario eseguire un gel su alcuni campioni e un controllo negativo. Per realizzare la piastra di pirosequenziamento aggiungere 12 microlitri della miscela di primer per il pirosequenziamento alla piastra di pirosequenziamento a 96 pozzetti. Ciò richiede una miscela di 43,2 microlitri di primer interno, insieme a 1396,8 microlitri di un tampone inginocchiato per coprire la piastra di pirosequenziamento con una pellicola adesiva.

Se l'installazione deve richiedere più di 50 minuti per ciascun pozzetto del prodotto PCR a 96 pozzetti, aggiungere 70 microlitri di miscela di velocità SRO che contiene 240 microlitri di velocità sierologiche rivestite di streptavidina. 4, 560 microlitri di tampone legante, che è composto da cloruro di sodio triss, EDTA e tra 20 e 3, 600 microlitri di acqua e riposizionare saldamente il coperchio. Posizionare la piastra del prodotto PCR a 96 pozzetti con la miscela di perle in uno shaker per piastre per cinque minuti a temperatura ambiente.

Assicurarsi che il coperchio sia fissato per evitare qualsiasi contaminazione incrociata tra i pozzetti. Questo passaggio consentirà un inginocchiamento completo dello streptococco ENC, perline spheros rivestite sull'etichetta di biotina che si trova sul primer PCR. Allestire una postazione di lavoro per la preparazione delle piastre.

Ciò include le vasche per i reagenti, il vassoio per il prodotto PCR e la vaschetta per la miscelazione delle perle e la vaschetta per il primer per il sequenziamento pirotecnico. Assicurarsi che il prodotto PCR e la piastra di miscelazione delle microsfere, nonché il vassoio del primer per il sequenziamento pirotecnico siano allineati correttamente in modo che i negativi abbiano lo stesso orientamento. Prima di trasferire i campioni, agitare lo strumento di aspirazione, che è spento in acqua pulita, per rilasciare eventuali perline o detriti che potrebbero essere presenti su di esso.

Scartare l'acqua rimanente, riempire l'abbeveratoio e accendere l'aspirapolvere. Lasciare l'aspirapolvere nell'abbeveratoio fino a quando tutta l'acqua non è stata rimossa, ovvero circa 30 secondi. Posizionare le punte del filtro dello strumento per vuoto nei pozzetti della piastra di miscelazione delle perle PCR e lasciarle riposare fino a quando tutto il liquido non è stato rimosso dalla piastra.

È possibile utilizzare un leggero dondolio per prevenire la tensione superficiale. Posizionare il vuoto nella vasca di etanolo al 70% quando il liquido inizia a fluire attraverso il tubo. Lasciare che le punte del filtro aspirino l'etanolo per cinque secondi.

Ripetere per l'idrossido di sodio 0,2 molare, che denatura il DNA in PCR a singolo filamento, e per il tampone di lavaggio. Per detergere e neutralizzare il prodotto PCR. Scollegare il tubo di aspirazione dall'utensile per l'aspirazione e posizionare l'utensile per l'aspirazione nella piastra di pirosequenziamento contenente il primer per il sequenziamento dei pirolidi in una miscela tampone per l'inginocchiamento.

Se il tubo di aspirazione è ancora collegato, quando viene inserito nella piastra di pirosequenziamento, la miscela di primer verrà aspirata. Le punte che ti causano la perdita del tuo prodotto PCR. Agitare delicatamente o far oscillare le punte dell'aspirapolvere nei pozzetti della piastra di pirosequenziamento per disperdere il prodotto PCR.

Rimuovere l'aspiratore dalla piastra di pirosequenziamento una volta completato lo scuotimento o l'oscillazione, ricollegare l'aspiratore al tubo e immergerlo nell'acqua pulita per pulirlo per la piastra successiva. Posizionare la piastra di sequenza pirolitica su un blocco termico per due minuti a 80 gradi Celsius. Dopo due minuti, rimuovere la piastra dal blocco termico e posizionarla su una superficie fredda.

Una volta raffreddata, la pellicola adesiva può essere utilizzata per coprire la lastra, a meno che la lastra non venga fatta funzionare entro 15 minuti per evitare l'evaporazione. E ora è il momento di iniziare il Pyro Sequencing. Il primo passo del pirosequenziamento consiste nell'inserire i dettagli del test nel computer.

Nella voce simplex, selezionare la nuova voce e inserire le informazioni sul test, tra cui un nome ID e la sequenza da analizzare, che viene fornita dal software di progettazione del saggio e consente il controllo di qualità selezionando l'ordine di dispensazione, che fornisce la sequenza attorno all'SNP più le basi di controllo. Infine, seleziona gli istogrammi per fornire un'immagine di come dovrebbe apparire il tuo pigramma. Ora è il momento di entrare in una corsa di taglio.

Nelle esecuzioni di taglio e nella scheda generale, immettere un nome per la corsa e selezionare i parametri dello strumento per la corsa. Nella scheda di configurazione, selezionare la voce del saggio e fare clic e trascinare sulla piastra. Per inserire il test di scelta nella piastra, è importante notare che non è necessario utilizzare l'intera piastra, in cui è possibile inattivare diversi pozzetti per l'analisi, così come molti saggi diversi possono essere eseguiti sulla stessa piastra.

Fare clic sulla scheda Visualizza e quindi selezionare. Correre. Questa pagina elenca i volumi appropriati di nucleotidi, enzima e substrato necessari per la corsa. Pulire sia il nucleotide o il capillare che le punte dei reagenti prima dell'uso.

Riempi le punte con acqua e applica pressione sulla parte superiore della punta per verificare la presenza di eventuali ostruzioni della punta. Se l'acqua non schizza dal fondo della punta, svuotare e riempire più volte per cercare di forzare il passaggio dell'acqua. Oppure puoi sonicare le punte se la punta rimane bloccata.

Scarta e ottieni nuovi suggerimenti. L'enzima e il substrato devono essere risospesi con acqua prima dell'uso. Se potrebbero verificarsi bolle d'aria agitate che causano ostruzioni della punta o un'erogazione incoerente, l'enzima risospeso e il substrato inutilizzati possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius.

Per un uso futuro per i puntali di erogazione capillari in un tubo per microfuge, effettuare una diluizione uno a uno con i nucleotidi e il tampone P otto. Mescolare bene prima dell'uso. Riempire i puntali nucleotidici e i reagenti con i volumi appropriati in base alle quantità suggerite dal software.

Erogare delicatamente il liquido lungo i lati dei puntali per evitare che il pipettaggio vi penetri bolle d'aria e causi ostruzioni. Assicurati di controllare la presenza di bolle d'aria nelle punte di erogazione dei nucleotidi. Se sono presenti bolle d'aria, è sufficiente picchiettare i lati dei puntali fino a quando le bolle d'aria non vengono a galla o rimuoverle con un puntale per pipetta pulito.

Eseguire una piastra di prova dopo aver riempito la cartuccia. Posizionare la cartuccia nello strumento di pirosequenziamento e la piastra di prova nella piattaforma della piastra a 96 pozzetti. Il posizionamento di una pellicola adesiva sulla piastra consente di vedere facilmente il reagente e l'erogazione dei nucleotidi.

Seleziona la scheda dello strumento sul lato sinistro dello schermo, quindi fai clic su Gestisci. Selezionare lo strumento dal menu a discesa. Fare clic su test e verrà visualizzato un avviso.

Chiede di controllare che la piastra di prova sia stata inserita nello strumento. Fare clic su OK. Una volta completata, rimuovere la piastra di prova e al centro della piastra dovrebbero esserci punti liquidi su sei dei pozzetti che rappresentano quattro nucleotidi, enzima e substrato.

Se ci sono meno di sei piccoli punti, si è verificato un blocco e le punte devono essere controllate e rimosse da eventuali ostruzioni. Posizionare la piastra nella piattaforma per piastre a 96 pozzetti per il sequenziamento pirotecnico. Chiudere tutte le leve e fare clic su Esegui sulla singola piastra.

Esegui, imposta il substrato enzimatico e i nucleotidi verranno erogati nell'ordine predeterminato. Una volta che la corsa è stata analizzata dal piro sequenziatore, è il momento di esaminarla. I pozzi blu rappresentano un genotipo di passaggio e un piro.

I pozzetti arancioni richiedono l'intervento umano e possono essere modificati facendo clic sul pozzetto di interesse e aprendo l'istogramma previsto. Un genotipo può essere superato, fallito o controllato, così come il genotipo stesso può essere modificato in modo appropriato. Una volta che un pozzo è stato modificato, sulla mappa della piastra verrà visualizzato un cerchio scuro.

I controlli negativi devono essere valutati come negativi. Potrebbero esserci picchi non specifici nei pozzetti negativi, tuttavia, in genere sono causati dall'avvolgimento del primer interno. Quindi ti abbiamo appena mostrato come sequenziare un polimorfismo nella genomica umana.

Il sequenziamento del DNA Pyro è utile rispetto ad altre procedure di sequenziamento perché è adattabile a un'ampia gamma di applicazioni. È anche abbastanza robusto da gestire il DNA da qualsiasi fonte, compreso il DNA a bassa concentrazione e degradato. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di iniziare con un buon prodotto PCR pulito.

Includi un controllo negativo per ogni test e assicurati che tutti i tuoi reagenti siano buoni. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.