Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una retina Protesi per Localized istopatologico Analysis: Part 2 epiretinica impianti con retina aderenze

Le protesi retiniche con componenti metallici rigidi non sono compatibili con i tradizionali processi istologici. Qui descriviamo tecniche per valutare lo stato di salute dell'occhio direttamente adiacente a un impianto retinico fissato in posizione epiretinica mediante una T metallica. Questo viene ottenuto innanzitutto nucleando e fissando l'occhio secondo il protocollo descritto in un video correlato, quindi dissezionando un campione di tessuto che include l'impianto e la T retinica. Il secondo passaggio consiste nel disidratare progressivamente il campione di tessuto e successivamente incorporarlo in una resina epossidica nell'orientamento desiderato, mediante un processo di inclusione in due fasi. Successivamente, il blocco finale di resina viene montato in un apposito supporto e levigato gradualmente fino a quando una sezione trasversale attraverso l'impianto e il tessuto oculare circostante viene esposta al livello desiderato.

L'ultimo passaggio consiste nella colorazione superficiale del tessuto esposto, seguita da acquisizione di immagini e fotografie mediante un microscopio stereoscopico ad alta potenza per visualizzare l'architettura cellulare adiacente alla protesi impiantata. Questi passaggi vengono quindi ripetuti più volte secondo necessità. Alla fine, viene raccolta una serie di immagini a sezione trasversale del campione di tessuto, compresa la protesi in situ, che possono essere utilizzate per perfezionare il design del dispositivo o dell'intervento chirurgico, nonché per supportare la valutazione della sicurezza della particolare protesi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'istologia con taglio tradizionale mediante lama, è che gli oggetti impiantati nel cuore, inclusi componenti metallici, possono rimanere in situ durante la procedura, consentendo la visualizzazione dell'interfaccia tra impianto e tessuto. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo delle protesi retiniche, ad esempio valutando l'integrità strutturale del tessuto oculare delicato adiacente a una protesi retinica impiantata. Dopo l'enucleazione dell'occhio e la fissazione come descritto in un video JoVE associato, visualizzare l'impianto e il punto in cui è fissato all'esterno dell'occhio.

Utilizzando una lama di 15 gradi, effettuare un'incisione transcorneale circonferenziale e rimuovere il cappuccio corneale per esporre l'interno del bulbo oculare. Si noti che il cristallino è stato precedentemente asportato durante la lensectomia-vitrectomia, che fa parte della procedura chirurgica per questo impianto epiretinico.

Quindi disinfettare, inserire l'iride e qualsiasi fibra Z residua del cristallino per esporre la camera posteriore con l'impianto epiretinico e il metallo T in situ. A seconda dell'impianto e dello studio in corso, rimuovere le componenti estranee prima di proseguire la dissezione. Nell'esempio attuale, l'array epiretinico in esame è costituito da un prototipo ermetico, con un elettrodo in diamante e un pacchetto di elettronica alloggiati all'interno di un supporto in silicone conformale.

Dissezionare con attenzione un campione che includa il chiodo e il tessuto circostante nell'orientamento desiderato. Utilizzare forbici da dissezione fini per tagliare strisce a tutto spessore dalla parte posteriore dell'occhio, inclusa la sclera, la coroide e la retina. Estrarre quindi con cura il pacchetto dell'elettrodo a diamante mediante una dissezione fine con il bisturi.

Lasciare il corpo in silicone dell'impianto insieme al puntino retinico e ai residui del cablaggio in platino. Prelevare un campione che fornisca una sezione trasversale longitudinale del puntino, mostrando tutti gli strati retinici adiacenti al puntino. Quindi reinserire il campione in etanolo al 70%.

Disidratare il campione per tre giorni in stadi progressivi di etanolo. Inizialmente, disidratare il campione in etanolo al 70% per due ore, due volte. Successivamente, disidratare il campione in etanolo all'80% per due ore, due volte, e poi il giorno successivo proseguire con la disidratazione in etanolo al 90% per due ore, due volte, lasciando inoltre in disidratazione tutta la notte. Procedere quindi con la disidratazione del campione in etanolo al 100% per due ore, due volte, e poi nuovamente tutta la notte.

Infine, disidratare il campione in acetone al 100% per due ore, due volte. Rimuovere il campione dall'acetone e osservarlo al microscopio ottico mentre si asciuga all'aria a temperatura ambiente. La rimozione del liquido dai tessuti molli provoca il collasso delle cellule e il restringimento.

Il campione verrà trasferito nell'epossidico poco prima che inizi ad arricciarsi e collassare. L'esperienza permette di riconoscere il momento in cui avviene l'arricciamento e il collasso del tessuto. Per incorporare il campione in una resina epossidica trasparente, immergere il tessuto oculare nell'epossidico liquefatto all'interno di un contenitore sigillabile adeguato.

Depurare delicatamente l'epossidica in una camera a vuoto e lasciarla polimerizzare tutta la notte a temperatura ambiente. Prestare attenzione a incapsulare il campione nell'orientamento desiderato, ridimensionando il blocco di epossidica polimerizzata e il campione con una sega a nastro e una lamina. Posizionare il blocco ridimensionato contenente il tessuto oculare in una nuova quantità di epossidica liquefatta in modo che l'asse longitudinale del campione sia orientato parallelamente al fondo dello stampo. Utilizzare una goccia di colla istantanea per fissare saldamente il campione ridimensionato al fondo del portacampione.

Riempire il portacampioni con l'epossidico liquefatto e sottoporlo a degasaggio come in precedenza, quindi lasciarlo polimerizzare tutta la notte. Montare quindi la resina in un portacampioni per rettifica e rettificare manualmente il campione a 230-250 giri/min con acqua in circolo utilizzando carta abrasiva al carburo di silicio. Per la colorazione, immergere la superficie rettificata nella soluzione di blu di toluidina per tre-cinque minuti o fino a quando non si sviluppa la colorazione.

Dopo aver sciacquato il campione con acqua del rubinetto, acquisire un'immagine della superficie levigata del campione utilizzando un microscopio stereoscopico ad ingrandimento superiore. Per visualizzare i livelli cellulari della retina, applicare una goccia di acqua distillata sulla superficie superiore dell'epossidica appena sopra il campione. Per ridurre la diffrazione all'interfaccia aria-epossidica.

Utilizzare una sorgente luminosa a fibra ottica con collo d'oca per illuminare il campione. Ripetere i passaggi di macinazione e acquisizione delle immagini ogni volta che si rimuove uno spessore preimpostato di campione. L'incremento minimo di macinazione preciso e riproducibile del portacampione è di 20 micron.

Questo processo viene ripetuto in modo incrementale fino a quando una sezione trasversale attraverso l'impianto e il tessuto oculare circostante viene esposta al livello desiderato. Qui di seguito sono mostrate immagini di esempio di tessuto retinico visualizzato immediatamente adiacente a un chiodo retinico in titanio in diversi punti durante il processo di levigatura. Le immagini mostrano sezioni longitudinali del chiodo che penetra attraverso l'occhio ed esce dalla sclera, con retina adiacente in silicone e colorata o non colorata con blu di toluidina.

Distacchi retinici e piegature non artefatti possono essere osservati su entrambi i lati del silicone sia a basso che ad alto ingrandimento. L'asta dello spilluccio è visibile incorporata nel silicone, e la testa dello spilluccio ha penetrato la retina e la sclera. In questo caso è evidente la presenza di distacco retinico non artefatto nella retina non colorata su entrambi i lati del silicone, osservato sia a basso che ad alto ingrandimento.

L'esempio ha mostrato un disordine retinico adiacente al punto di fissaggio e una compressione della retina su un lato dovuta a un angolo di inserzione obliquo. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di inserire, orientare e montare attentamente il campione, in modo che le superfici ottenute per abrasione risultino allineate nel piano desiderato. Inoltre, dovrebbero essere acquisite molteplici fotografie a ogni stadio di abrasione, poiché i campioni abrasi non possono essere recuperati oggi.

Questo metodo può fornire informazioni sull'istologia della protesi retinica. Può inoltre essere applicato per visualizzare l'interfaccia tra dispositivo e tessuto in altri sistemi che utilizzano componenti impiantati rigidi, come impianti cerebrali profondi, stent vascolari o protesi ortopediche.