Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Questa procedura prevede la colonizzazione del nasofaringe murino con Streptococcus pneumoniae e il successivo isolamento dei batteri colonizzatori, nonché delle cellule aderenti o reclutate. Questo viene effettuato preparando innanzitutto un inocolo batterico della ceppo di S. pneumoniae di interesse.

I batteri vivi vengono quindi somministrati per via intranasale a topi anestetizzati mentre si trovano in un apparato di contenimento. Dopo il periodo desiderato di colonizzazione, i topi vengono soppressi e vengono effettuate lavande nasali canulando le trachee esposte e lavando il contenuto attraverso il naso. Il numero di batteri presente nelle lavande nasali può essere quantificato mediante tecniche microbiologiche. In alternativa, le risposte immunitarie possono essere analizzate utilizzando tecniche di citometria a flusso per definire il fenotipo delle cellule reclutate o tecniche di PCR quantitativa.

Per misurare i livelli di mRNA espressi di interesse prima di iniziare, sarà necessario preparare dei contenitori per topi per la fase di colonizzazione intranasale della procedura e aghi canulati per le lavande nasali. Un contenitore per topi può essere preparato semplicemente tagliando la punta conica di una provetta falcon da 50 millilitri. Una volta creato l'apertura, assicurarsi di utilizzare le forbici per smussare eventuali bordi taglienti.

Per la preparazione di aghi canulati, saranno necessari i seguenti materiali: tubo in polietilene PE 20 con un diametro interno di 0,38 millimetri. Una siringa da un mil è dotata di aghi smussati da 26 e da tre ottavi di calibro, un paio di forbici da iride fini e affilate e un paio di pinze. Tagliare il tubo PE 20 con le forbici fini in pezzi di circa 2,5 centimetri o un pollice di lunghezza, assicurandosi che ogni estremità presenti una punta smussata.

Utilizzando la pinzetta, inserire con attenzione uno di questi pezzi sulla punta dell'ago. Evitando di perforare il lato del tubicino, gli aghi canulati possono essere conservati in etanolo al 70% fino al momento dell'uso e devono essere risciacquati con PBS immediatamente prima dell'impiego. Per la colonizzazione intranasale dei topi con S pmo, si raccomanda di utilizzare una concentrazione di 10 alla nona unità formanti colonie per millilitro somministrata in 10 microlitri.

Per una dose finale di 10 alla settima UFC, mantenere l'inoculo sul ghiaccio fino immediatamente prima dell'uso e assicurarsi di agitare tra una colonizzazione e l'altra. Oltre all'inoculo, saranno necessarie una pipetta P10 o P20, punte sterili per pipetta e il dispositivo di contenimento per topi. Isolare un topo singolo per la coda e immobilizzarlo inserendolo nell'apparato di contenimento per topi precedentemente preparato.

Se si ha difficoltà a indirizzare il mouse nel dispositivo di contenimento, può essere utile posizionarlo davanti e sopra l'animale, consentendo all'animale di arrampicarsi verso l'alto. Una volta che il mouse è all'interno del dispositivo di contenimento, fissatelo alla base del corpo spingendolo delicatamente verso l'alto in modo che il naso sporga dall'estremità conica del dispositivo. Utilizzando una pipetta P 10 o P 20, inoculare ogni mouse depositando 10 microlitri della coltura preparata, distribuendola uniformemente tra entrambe le narici.

Lasciare che l'inoculo goccioli nel naso pulsando gradualmente l'inoculazione, prendendosi il tempo necessario perché il topo inali l'inoculo. È normale che il topo starnutisca parte dell'inoculo fuori dal naso. Si noti che i topi devono essere anestetizzati durante questa procedura per garantire che i batteri rimangano localizzati nella nasofaringe e non si diffondano alle vie respiratorie inferiori.

Per gli scopi di questa dimostrazione, stiamo inoculando con PBS, ma ogni volta che si lavora con batteri vivi, assicurarsi di condurre la procedura secondo le linee guida approvate dall'istituto. Ad esempio, la maggior parte degli istituti richiederà che la colonizzazione venga effettuata all'interno di una cappa a sicurezza biologica di livello due. Se si utilizzano indicatori ponderali come parte del metodo di monitoraggio dell'endpoint, dopo la colonizzazione, monitorare i topi ogni 12-24 ore per rilevare sintomi clinici come letargia, pelo arruffato e perdita di peso.

Dopo che i topi sono stati colonizzati, mantenerli per il periodo desiderato. Al termine di questo periodo, i topi verranno soppressi e verrà eseguita una lavanda nasale, poiché la dislocazione cervicale potrebbe danneggiare potenzialmente la trachea. Questo metodo di soppressione deve essere evitato.

Prima di eseguire le lavande nasali, assicurarsi di avere a portata di mano quanto segue: aghi canulati preparati in precedenza, etanolo acquoso al 70%, una pinzetta, un paio di forbici da iride fini e affilate, soluzione salina tampone al fosfato, buffer di lisi dell'RNA e tubi da un mil e inor. Una volta pronti per iniziare, posizionare l'animale supino in posizione piatta e, utilizzando etanolo acquoso al 70%, sterilizzare la parte anteriore del pelo, in particolare la zona del collo.

Avendo cura di evitare che l'etanolo entri nelle narici. Eseguire un singolo taglio longitudinale lungo la linea mediana del collo dell'animale, creando così un'apertura che permetta di visualizzare la trachea. Staccare con attenzione la pelle ai lati, esponendo il tessuto del collo sottostante.

A questo punto, la trachea dovrebbe essere visibile, circondata da muscoli longitudinali su entrambi i lati. Tagliare con attenzione questi ultimi per ottenere una visione chiara della trachea stessa, avendo cura di non recidere la vascolarizzazione circostante. Nel caso in cui si tagli accidentalmente la vascolarizzazione e sia presente sangue nella zona prima di procedere.

Attendere che l'arresto dell'emorragia e quindi detergere la zona più volte dispensando PBS sterile ed utilizzando garza sterile per assorbire delicatamente l'eccesso di umidità. Una volta esposta correttamente la trachea, praticare un'incisione semilunare trasversale nella trachea all'incirca a metà altezza. Aggiungere PBS sterile in una siringa canulata.

Inserire la cannula nella trachea dirigendola verso il naso, mantenendo il bordo smussato rivolto verso il basso per facilitare l'inserimento. Una volta posizionata la cannula, ruotarla di 180 gradi ed esplorare delicatamente verso l'alto fino a percepire una leggera resistenza. Posizionare il tubo EEND DPH designato per il campionamento appena sotto il naso del topo.

Verificare la corretta posizione della cannula rilasciando una minima quantità di fluido di lavaggio PBS. Successivamente, se la cannula è posizionata correttamente, dovrebbe formarsi una goccia di liquido attorno all'apertura nasale del mouse. Se il PBS di prova fuoriesce direttamente dalla bocca dell'animale, ritirare leggermente la cannula e riposizionarla avanzando delicatamente fino a quando si avverte una lieve resistenza.

Attenzione a non spingere il cannula troppo oltre questa resistenza, altrimenti la si sposterà oltre il palato nasale e la si farà passare nella cavità orale. Una volta confermata la corretta posizione del cannula, procedere con la somministrazione rapida di 200 microlitri di PBS per favorire lo spostamento e raccogliere la massima quantità di cellule. Il contenuto dovrebbe fuoriuscire attraverso le narici del topo e riversarsi nel tubo di raccolta.

Posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio. Questi campioni possono successivamente essere analizzati per determinare il carico batterico e il reclutamento cellulare. Per raccogliere campioni per l'analisi dell'RNA, utilizzare un ago cannulato separato contenente 500 microlitri di buffer di lisi per l'RNA per eseguire un lavaggio nasale secondario.

Si noti che il buffer di lisi per l'RNA rimuoverà l'epitelio e distruggerà i tessuti circostanti. Pertanto, è necessario fare attenzione ad evitare il contatto con organi come i polmoni. Se si desidera mantenere questi tessuti per quantificare il carico batterico nasofaringeo, saranno necessari i seguenti elementi.

Provette Epicor, piastre microbiologiche contenenti triptico soia uovo vengono integrate con il 5% di sangue di pecora. Un agitatore vortex, punte di pipetta sterili per PBS e pipette P20 e P200. Prima di lavorare in una cappa BSL due, preparare una serie di diluizioni seriali per ogni campione di lavaggio nasale mirin.

In generale, ci si può aspettare che le concentrazioni di S pneumoniae nel nasofaringe siano comprese tra zero e 10 alla quattro UFC. Pertanto, effettuare tre diluizioni seriali decrescenti, aggiungere 10 microlitri del campione di lavaggio nasale neat al primo tubo per ottenere una concentrazione di 10 alla meno uno UFC per ml e continuare in modo discendente fino ad aver diluito eccessivamente tre campioni, vortexando accuratamente tra ciascuna diluizione. Si noti che questo video ha esclusivamente scopo dimostrativo.

Tecnica di laboratorio corretta, inclusa la sostituzione dei puntali della pipetta tra una diluizione e l'altra, deve essere sempre rispettata. Utilizzando un pennarello indelebile, dividere il retro della piastra in quadranti e etichettare ciascun quadrante con la corrispondente diluizione da seminare. Seminare tre gocce da 10 microlitri di ciascuna diluizione sulla piastra di agar. Lasciare asciugare per 15-30 minuti a piatto scoperto, quindi coprire le piastre e posizionarle capovolte in un'incubatrice batterica alle condizioni ottimali per la crescita del pneumococco, tipicamente 37 gradi Celsius e 5% CO2.

Incubare queste piastre per 24-48 ore. Trascorso questo periodo, rimuovere le piastre e determinare il numero di batteri colonizzanti calcolando la media delle colonie formate sulla piastra. Per ogni diluizione, le colonie di animo possono essere identificate dal caratteristico colore beige e dalle zone di emolisi alfa, che appaiono come piccoli aloni attorno a ciascuna colonia, prodotti dalla digestione batterica del supplemento di sangue nell'agar.

E infine, grazie a piccole depressioni al centro di ciascuna colonia che le conferiscono l'aspetto di un eritrocita. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una solida comprensione di come stabilire un'esposizione nasofaringea a un patogeno, della colonizzazione in un topo, di come isolare batteri e cellule dalla nasofaringe di un topo dopo la colonizzazione, mediante lavaggio nasale, e di come quantificare il carico batterico corrispondente utilizzando tecniche microbiologiche. Speriamo che i metodi descritti in questo video vi incoraggino a utilizzare un modello di colonizzazione intranasale per studiare le risposte dell'ospite ai patogeni nel contesto di questa regione poco studiata.