Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Questa procedura prevede la colonizzazione del rinofaringe di Murn con polmonite da streptococco e la successiva estrazione di batteri colonizzatori e di cellule aderenti o reclutate. Ciò si ottiene preparando prima un inoculo batterico della polmonite S. Ceppo di interesse.

I batteri vivi vengono quindi somministrati per via intranasale a topi anestetizzati mentre si trovano in un apparato di contenzione. Dopo la durata desiderata della colonizzazione, i topi vengono soppressi e vengono eseguiti lavaggi nasali incannulando le trachee esposte e lavando il contenuto attraverso il nas. Il numero di batteri presenti nelle lavande nasali può essere quantificato utilizzando tecniche microbiologiche. In alternativa, le risposte immunitarie possono essere analizzate utilizzando tecniche di citometria a flusso per fenotipizzare le cellule reclutate o tecniche di PCR quantitativa.

Per misurare i livelli di mRNA espresso di interesse prima di iniziare, è necessario preparare sistemi di ritenuta per topi per la parte di colonizzazione intranasale della procedura e aghi cannulati per le lavande nasali. Un sistema di ritenuta per topi può essere preparato semplicemente tagliando la punta affusolata di un tubo di falco da 50 millilitri. Una volta creata l'apertura, assicurati di usare le forbici per lucidare le estremità affilate.

Per la preparazione degli aghi cannulati, avrai bisogno del seguente tubo in polietilene PE 20 con un diametro interno di 0,38 millimetri. Una siringa da un mil è tappata con aghi smussati da 26 e tre calibro otto, un paio di iride affilate e fini, forbici e un paio di pinze. Taglia il tubo PE 20 con le forbici fini in pezzi di circa 2,5 centimetri di lunghezza, assicurandoti che ogni estremità abbia una punta smussata.

Usando la pinza, fai scorrere con cautela uno di questi pezzi sulla punta dell'ago. Evitando di forare il lato del tubo, gli aghi cannulati possono essere conservati in etanolo al 70% fino al momento del bisogno e lavati con PBS direttamente prima dell'uso. Per la colonizzazione intranasale di topi con S pmo, si consiglia di utilizzare una concentrazione di 10 per le nove unità formanti colonie per mil erogate in 10 microlitri.

Per una dose finale da 10 a sette CFU, mantenere l'inoculo in ghiaccio fino a poco prima dell'uso e assicurarsi di agitare tra ogni colonizzazione. Oltre all'inoculo, avrai bisogno anche di una pipetta P 10 o P 20 sterilizzata con puntali per pipette e del tuo sistema di ritenuta per topi. Isolare un singolo topo per la coda e trattenerlo inserendolo nell'apparato di contenimento del topo precedentemente preparato.

Se hai problemi a dirigere il mouse nel sistema di ritenuta, potrebbe essere utile posizionarlo davanti e sopra il mouse, consentendo all'animale di strisciare verso l'alto. Una volta che il mouse è all'interno del sistema di ritenuta, fissarlo per la base del corpo spingendolo delicatamente verso l'alto in modo che il naso emerga dall'estremità affusolata del sistema di ritenuta. Utilizzando una pipetta P 10 o P 20, inoculare ogni topo depositando 10 microlitri della coltura preparata, distribuendola uniformemente tra entrambi. Narici.

Lasciare che l'inoculo goccioli nel naso pulsando gradualmente l'inoculazione, prendendosi il tempo necessario al topo per inalare l'inoculo. Il topo può starnutire parte dell'inoculo dal naso, il che è previsto. Si noti che i topi devono essere anestetizzati per questa procedura per garantire che i batteri rimangano localizzati nel rinofaringe e non si diffondano al tratto respiratorio inferiore.

Ai fini di questa dimostrazione, stiamo inoculando con PBS, ma ogni volta che lavoriamo con batteri vivi, assicurati di condurre la procedura secondo le linee guida approvate dall'istituto. Ad esempio, la maggior parte delle istituzioni richiederà che la colonizzazione sia condotta in un cappuccio di livello due di biosicurezza. Se si utilizzano indicatori di peso come parte del metodo di monitoraggio degli endpoint, MA subito dopo la colonizzazione, monitorare i topi ogni 12-24 ore per sintomi clinici tra cui letargia, pelo arruffato e perdita di peso.

Una volta che i topi sono stati colonizzati, conservali per il periodo di tempo desiderato. Al termine di questo periodo, i topi saranno soppressi e verrà eseguita la lavanda nasale poiché la lussazione cervicale può potenzialmente danneggiare la trachea. Questo metodo di eutanasia deve essere evitato.

Prima di eseguire le lavande nasali, assicurarsi di avere a portata di mano quanto segue. Aghi cannulati precedentemente preparati, etanolo acquoso al 70%, un paio di pinze, un paio di forbici affilate per l'iride, fosfato, soluzione salina tamponata, tampone per lisi dell'RNA e provette da un millimetro. Una volta che sei pronto per iniziare, stendi l'animale sulla schiena e, usando etanolo acquoso al 70%, sterilizza la parte anteriore del pelo, in particolare la zona del collo.

Facendo attenzione a evitare che l'etanolo raggiunga le narici. Fai un unico taglio longitudinale lungo la linea mediana del collo dell'animale, permettendoti di creare un'apertura per visualizzare la trachea. Staccare con cura la pelle su entrambi i lati rivelando il tessuto del collo sottostante.

A questo punto, la trachea dovrebbe essere visibile circondata da muscoli longitudinali su entrambi i lati. Tagliali con cura per fornire una visione chiara della trachea stessa, facendo attenzione a non recidere il sistema vascolare circostante. Nel caso in cui si tagli accidentalmente il sistema vascolare e il sangue è presente nella regione prima di procedere.

Lasciare che l'emorragia si fermi e quindi pulire l'area più volte erogando PBS sterile e utilizzando una garza sterile per assorbire delicatamente l'umidità in eccesso. Una volta che la trachea è correttamente esposta, fare un taglio semilunare trasversale nella trachea circa a metà strada. Far cadere il PBS sterile in una siringa cannulata.

Inserire la cannula nella trachea verso il naso, mantenendo il bordo smussato rivolto verso il basso per facilitarne l'inserimento. Una volta posizionata la cannula, ruotare di 180 gradi e sondare delicatamente verso l'alto fino a quando non si avverte una leggera resistenza. Posizionare la provetta EEND DPH designata per la raccolta del campione appena sotto il naso del topo.

Testare il corretto posizionamento della cannula erogando una quantità minima di liquido di lavaggio PBS. Successivamente, una goccia di liquido dovrebbe formarsi attorno al NAS del mouse se la cannula è posizionata correttamente. Se il PBS di prova fuoriesce direttamente dalla bocca dell'animale, tirare indietro la cannula e riposizionarla nuovamente sondando delicatamente in avanti fino a quando non si avverte una resistenza molto leggera.

Fai attenzione a non spingere troppo la cannula oltre questa resistenza, poiché la sposterai oltre il palato nasale e attraverso la cavità orale. Una volta confermato che la cannula è posizionata correttamente, procedere all'erogazione rapida di 200 microlitri di PBS per aiutare a spostare e raccogliere la massima quantità di cellule. Il contenuto dovrebbe fluire attraverso le narici del topo e nel tubo di raccolta.

Posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio. Questi campioni possono essere successivamente analizzati per la carica batterica e il reclutamento cellulare. Per raccogliere i campioni per l'analisi dell'RNA, utilizzare un ago cannulato separato contenente 500 microlitri di tampone di lisi dell'RNA per eseguire un lavaggio nasale secondario.

Si noti che il tampone di lisi dell'RNA denuderà l'epitelio e distruggerà il tessuto circostante. Quindi bisogna fare attenzione per evitare il contatto con organi come i polmoni. Se si desidera la ritenzione di questi tessuti per quantificare la carica batterica nasofaringeo, è necessario quanto segue.

Le provette Epicor, piastre microbiologiche contenenti trittico di uova di soia, sono integrate con il 5% di sangue di pecora. Un miscelatore a vortice, puntali per pipette sterili PBS e pipette P 20 e P 200. Lavorando prima in una cappa BSL a due cappe, preparare una serie di diluizioni seriali per ogni campione di lavaggio nasale mirin.

In generale, ci si può aspettare che le concentrazioni di S pneumoniae nel rinofaringe siano comprese tra zero e 10 rispetto ai quattro CFU. Pertanto, eseguire tre diluizioni seriali di dieci volte, aggiungere 10 microlitri del campione di lavaggio nasale pulito alla prima provetta fino a una concentrazione di 10 al meno uno CFU per mil e continuare verso il basso fino a quando non si sono diluiti tre campioni eccessivamente vorticosamente tra ogni diluizione. Si prega di notare che questo video è solo a scopo dimostrativo.

La corretta tecnica di laboratorio, compreso il cambio dei puntali delle pipette tra una diluzione e l'altra, deve essere sempre rispettata Utilizzando un pennarello, dividerlo nuovamente sulla piastra logica in quadranti ed etichettare i quadranti con la diluizione corrispondente da colorare su di esso. Spianare tre gocce di campioni da 10 microlitri di ciascuna delle diluizioni sulla piastra di agar. Lasciarli asciugare per 15-30 minuti scoperti, quindi coprire le piastre e metterli capovolti in un incubatore batterico con condizioni ottimali per la crescita dello pneumococco, in genere 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Incubare queste piastre per 24-48 ore. Trascorso questo periodo di tempo, rimuovere le piastre e determinare il numero di batteri colonizzatori facendo la media delle colonie formate sulla piastra. Per ogni diluizione, le colonie di animo possono essere identificate dal loro caratteristico colore beige, dalle loro zone di emolisi alfa, che sono piccoli aloni attorno a ciascuna colonia, creati dalla digestione batterica dell'integratore di sangue nell'agar.

E infine, da piccole depressioni al centro di ogni colonia che le conferiscono l'aspetto di un eritrocita. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una solida comprensione di come stabilire un peso nasofaringeo, la colonizzazione in un topo, come isolare batteri e cellule dal rinofaringe di un topo dopo la colonizzazione, utilizzando un lavaggio nasale e come quantificare la carica batterica corrispondente utilizzando tecniche microbiologiche. Ci auguriamo che i metodi descritti in questo video vi incoraggino a utilizzare un modello intranasale di colonizzazione per studiare le risposte dell'ospite ai patogeni nel contesto di questa regione poco studiata.