Name: Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Scopri la marcatura metabolica di LRRK1 e LRRK2 con fosfato radioattivo per quantificare i livelli di fosforilazione cellulare. Questo metodo consente analisi accurate anche senza anticorpi fosfo-specifici.

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Siamo anche grati alla Michael J. Fox Foundation a sostegno di questo studio. Ringraziamo la Fondazione di Ricerca - Fiandre FWO (progetto FWO G.0666.09, ricercatore senior fellowship a JMT), l&#39;IWT SBO/80020 progetto Neuro-TARGET, la KU Leuven (OT/08/052A e IOF-KP/07 / 001) per il loro sostegno. Questa ricerca è stata sostenuta anche in parte dal Fondo Druwé-Eerdekens gestiti dalla Fondazione Re Baldovino a JMT.

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<li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16(2010).</li>
<li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li>
<li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.Mol.Genet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento fornisce un protocollo di base per saggiare il livello di fosforilazione generale di LRRK1 e LRRK2 in linee cellulari mediante marcatura metabolica con 32 P-ortofosfato. La strategia generale è semplice. Affinity etichettato LRRK proteine ​​sono espresse in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente 32 P-ortofosfato. Il 32 P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo poche ore di incubazione e di tutte le molecole nella cellula contiene fosfati sono...

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi multidominio che condividono un&#39;organizzazione dominio simile. Entrambe le proteine ​​codificano una sequenza GTPasi simile alla famiglia di GTPasi Ras (Ras di proteine ​​complesse, o ROC), nonché un terminale C della ROC dominio (COR), classificando efficacemente entrambe le proteine ​​della famiglia di proteine ​​ROCO 5,6. N-terminale del dominio tandem ROC-COR, entrambe le proteine ​​codificare un dominio ripetizione ricca di leucina e un dominio ankyrin simile, mentre solo LRRK2 codifica un armadillo supplementare domein 6-8. C-terminale della ROC-COR, entrambe le proteine ​​condividono un dominio chinasi serina-treonina mentre solo LRRK2 codifica un dominio WD40 nella regione C-terminale 8. I ruoli cellulari precise LRRK1 e LRRK2 devono ancora essere chiariti, tuttavia LRRK1 è stato implicato in tirosina chinasi recettore segnalazione 1,2, mentre evidenze genetica ad un ruolo per LRRK2 nella patogenesi della malattia di Parkinson 3,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; La fosforilazione di proteine ​​è un meccanismo di regolazione comune nelle cellule. Ad esempio, la fosforilazione può essere essenziale per l&#39;attivazione di enzimi o per l&#39;assunzione di proteine ​​per un complesso di segnalazione. La fosforilazione cellulare di LRRK2 è stato ampiamente caratterizzato e mappatura phosphosite ha mostrato una maggioranza dei siti di fosforilazione cellulare a verificarsi in un cluster tra la ripetizione ankyrin e leucina domini ripetuti ricchi 9-11. Anche se LRRK1 siti di fosforilazione cellulare devono ancora essere mappato, evidenze da studi che utilizzano phosphoprotein colorazione delle macchie di proteine ​​LRRK1 immunoprecipitata da cellule COS7 suggerisce che la proteina LRRK1 è fosforilata nelle cellule 12. Questo documento fornisce un protocollo di base per saggiare il livello di fosforilazione generale di LRRK1 e LRRK2 in linee cellulari mediante marcatura metabolica con 32 P-ortofosfato. La strategia generale è semplice. Affinity tagged LRRK prins sono espressi in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente 32 P-ortofosfato. Il 32 P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo poche ore di incubazione e di tutte le molecole nella cellula contiene fosfati sono così marcato radioattivamente. Il tag di affinità (3xflag) viene quindi utilizzata per isolare le proteine ​​LRRK da altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia (32 segnale P) e rilevamento occidentale (segnale proteina) delle proteine ​​sulle macchie.

<table><tbody><tr><td>Radionuclide al fosforo-32, 1 mCi, tampone disodicofosfato in 1 ml di acqua</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquido (ad alto contenuto di glucosio)</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>Questo medium non contiene fosfati</td></tr><tr><td>Anti Flag M2 affiinty gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Per un prodotto equivalente con gel di colore rosso (utile per visualizzare più facilmente le perline), utilizzare il cat. N. F2426.</td></tr><tr><td>Filtro assorbente extra denso</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolica etichettatura di leucina rich repeat chinasi 1 e 2 con radioactive fosfato

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucina chinasi ricco ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi che condividono un dominio simile organizzazione, compreso un dominio chinasi serina-treonina, un complesso di Ras dominio proteine ​​(ROC), un C-terminale del dominio ROC (COR), e ricco di leucina e ripetizioni ankyrin simile al N-terminale. I ruoli cellulari precise LRRK1 e LRRK2 devono ancora essere chiariti, tuttavia LRRK1 è stato implicato in tirosina chinasi recettore segnalazione 1,2, mentre LRRK2 è implicato nella patogenesi della malattia di Parkinson 3,4. In questa relazione, vi presentiamo un protocollo per etichettare le proteine ​​LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i livelli di fosforilazione complessivi di queste due proteine ​​nelle cellule. In breve, l&#39;affinità etichettato LRRK proteine ​​sono espresse in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente 32 P-ortofosfato. Il 32 P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo pochiore di incubazione e tutte le molecole nella cella contenente fosfati sono così marcato radioattivamente. Via il tag di affinità (3xflag) le proteine ​​LRRK sono isolati dagli altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia (32 segnale P) e rilevamento occidentale (segnale proteina) delle proteine ​​sulle macchie. Il protocollo può essere facilmente adattato per monitorare la fosforilazione di qualsiasi altra proteina che può essere espresso in cellule e isolato mediante immunoprecipitazione.

<html> Al fine di confrontare i livelli di fosforilazione complessivi di LRRK1 e LRRK2 nelle cellule, 3xflag etichettato LRRK1 e LRRK2 sono stati espressi nelle cellule HEK293T 15. Le cellule sono state coltivate in piastre da 6 pozzetti e marcate con 32P ed analizzati come descritto sopra nel testo protocollo. Figura 1 mostra risultati rappresentativi per marcatura metabolica di LRRK1 e LRRK2 in cellule HEK293T. Incorporazione di fosfato radioattivo viene osservata sia per LRRK1 e ...

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine ​​multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di marcare le proteine di interesse con fosfati radioattivi al fine di quantificare i livelli di fosforilazione cellulare delle proteine. Ciò si ottiene coltivando cellule in presenza di fosforo 32 per marcare radioattivamente le modifiche del fosfato delle proteine espresse nelle cellule. In una seconda fase, le cellule marcate vengono lisate e i lisati vengono incubati con una perla di affinità per l'immunopurificazione delle proteine da analizzare.Successivamente, i campioni di proteine marcate e purificate vengono analizzati su sodio do desal solfato, elettroforesi su gel di poliacrilammide e sottoposti a membrane di fluoruro di poliolaina. Al fine di rilevare l'incorporazione radioattiva del fosfato e i livelli proteici, si ottengono risultati che mostrano che le chinasi ripetute una e due ricche di leucina, abbreviate L rrk uno e L rrk due, sono fosforilate nelle cellule a livelli comparabili sulla base dell'autoradiografia e del rilevamento immunologico. Uno dei principali vantaggi della tecnica di marcatura metabolica rispetto ad altre tecniche come il fosfo, l'immuno blotting, è che questa tecnica consente la determinazione dei livelli di fosforilazione cellulare totale delle proteine, comprese le proteine per le quali non sono disponibili anticorpi fosfo.Il secondo grande vantaggio di questa tecnica è che è possibile eseguire confronti quantitativi tra diverse proteine nei loro livelli totali di fosforilazione cellulare. A dimostrare la procedura sarà F gao, un tecnico del nostro laboratorio per iniziare la coltura di linee cellulari HEC 2 93 T secondo le condizioni di coltura standard in dcos modified eagle, medium o DMM con l'8% di vitello fetale, siero e gentamicina. Espandere la piastra ed esprimere la proteina L rrk two con tripla bandiera tramite trasfezione o trasduzione mediata da vettore lentivirale come discusso nel protocollo di testo.Quando le celle sono confluenti dall'80 al 100%, sciacquarle con dmm preriscaldato senza fosfati. Sotto un flusso laminare, preparare una provetta di falco con 2,1 millilitri di DM privo di fosfati per m per piastra di cellule a sei pozzetti da marcare con fosforo. 32 ortofosfato.Preparare il banco presso il quale verranno eseguiti gli esperimenti con le radiazioni ionizzanti. Lo spazio di lavoro è coperto da un tappetino di raccolta su cui è posizionato un rivestimento protettivo di materiale assorbente. Prevedere anche un barattolo di perspex sull'area di lavoro e posizionare il tubo di terreno privo di fosfati all'interno.Estrarre dal frigorifero il contenitore rivestito di piombo con la fiala di ortofosfato marcato con fosforo 32 e portarlo al banco di radioattività. Monitorare il contenitore per la contaminazione radioattiva esterna utilizzando un contatore Geiger diluire l'ortofosfato marcato con fosforo 32 nella provetta di dmem privo di fosfati. Aggiungere una concentrazione di 24 micro curie per millilitro.Conservare il tubo nel barattolo di perspex. Chiudere il contenitore con il resto dell'ortofosfato etichettato con fosforo 32 prima di rimetterlo in frigorifero. Quindi, rimuovere le piastre a sei pozzetti con le celle da etichettare dall'incubatore e posizionarle sul banco di radioattività.Rimuovere il surnatante medio e scartarlo. Quindi aggiungere due millilitri di terreno privo di fosfati contenente fosforo. 32 ortofosfato marcato per pozzetto.Posizionare le piastre di coltura in una scatola di perspex e quindi monitorare il contenitore per la contaminazione radioattiva esterna utilizzando un contatore geiger. Quindi trasferire la scatola di perspex con le cellule in un incubatore di cellule eucariotiche dedicato alla marcatura metabolica isotopica e incubare le cellule da una a 20 ore. A questo punto del protocollo, le cellule possono essere trattate con un composto, se lo si desidera, come indicato nel protocollo di testo Dopo il trattamento e l'incubazione delle cellule, rimuovere il terreno dalle cellule e gettarlo in una provetta per la raccolta dei rifiuti che viene posta nel barattolo di perspex.Sciacquare le celle due volte con due millilitri di soluzione salina tamponata tris ghiacciata. Gettare la soluzione di risciacquo nel tubo di raccolta dei rifiuti. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tampone di lisi per immunoprecipitazione ghiacciata a ciascun pozzetto e raccogliere il lisato pipettandolo su e giù.Per allentare tutte le cellule lisate, trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga e incubare su ghiaccio almeno 10 minuti prima della centrifusione come indicato nel protocollo di testo per isolare la proteina di interesse mediante immunopurificazione. Per prima cosa, trasferire le provette per microcentrifuga con lisati da centrifuga nel ghiaccio. Quindi pipettare il surnatante in provette da microcentrifuga contenenti 10 microlitri di volume del letto di bandiera M a due velocità.Equilibrati come discusso nel protocollo di testo, trasferire le provette per microcentrifuga in una provetta da 50 millilitri. Dopo aver trasferito le provette per microcentrifuga in provette da 50 millilitri etichettate su ghiaccio, posizionare i campioni su un dispositivo rotante dietro uno schermo in perspex nell'area designata di una cella frigorifera per la miscelazione end-over end a quattro gradi Celsius per una o 20 ore dopo l'incubazione, far girare la bandiera legata alle proteine M due perle aro in provette per microcentrifuga dopo aver scartato il surnatante in una provetta per la raccolta dei rifiuti. Procedere al lavaggio delle perline come discusso nel protocollo di testo.Quindi risospendere le perle lavate in 40 microlitri di tampone di caricamento SDS del campione IP Riscaldare i campioni nel tampone di caricamento a 95 gradi Celsius per due minuti prima di centrifugare per un minuto a più di 1000 volte g per pellettare le perle Preparare il modulo di elettroforesi su gel proteico sul banco di radioattività dietro uno schermo perspec. Caricare i campioni su gel di pagina SDS da tre a 8% di acetato di tris T, incluso un marcatore di peso molecolare adatto a discernere le dimensioni delle proteine ad alto peso molecolare prima di eseguire l'elettroforesi. Dopo l'elettroforesi, rimuovere il gel dal suo involucro di plastica e trasferirlo in un contenitore con tampone di trasferimento Western blotting.A seguire la preparazione del gel e della membrana in PVDF. Preparare il sandwich di tamponamento sulla superficie del modulo di tamponamento semi-asciutto come descritto nel protocollo di testo. Trasferire le proteine a 15 volt per una o due ore dopo il trasferimento.Rimuovere la membrana in PVDF con le proteine tamponate dal modulo di blotting e asciugare la membrana per eseguire l'autoradiografia. Innanzitutto, esporre la membrana a una piastra di fosforescenza per un periodo compreso tra uno e cinque giorni. Leggere il fosforo 32 dalla piastra di fosforescenza esposta utilizzando uno scanner di fosforescenza e salvare l'immagine come tiff ad alta risoluzione per rilevare i livelli di proteine tramite rilevamento immunologico.Reidratare le membrane immergendole brevemente nel metanolo e poi trasferendole in un recipiente di incubazione poco profondo con PBS. Bloccare le membrane in PBST contenente il 5% di latte. Incubare i blot con anticorpi anti LR K two o anticorpi Anti-Flag e procedere ulteriormente con le opportune fasi di lavaggio e l'incubazione secondaria degli anticorpi.Dopo l'applicazione degli anticorpi, eseguire il rilevamento della chemiluminescenza per confermare i livelli relativi di proteina di LRRK due. Infine, quantificando la corporazione del fosforo 32 in LRK 2 utilizzando l'analisi diametrale come descritto nel protocollo di testo Qui sono mostrati i risultati rappresentativi per la marcatura metabolica di L Rrk uno e L Rrk 2 due in cellule HEC 2 93 T. Qui raffigurato è un radiogramma automatico rappresentativo dell'incorporazione del fosforo 32 e un blot occidentale rappresentativo del rilevamento di L Rrk uno e L Rrk due tramite le loro etichette a tripla bandiera.L'incorporazione di fosfato radioattivo è osservata sia per L rrk uno che per L rrk 2. Dopo la quantificazione dei livelli di fosforo 32 normalizzati ai livelli proteici misurati mediante analisi metrica della densità del rilevamento immunologico con anticorpo Anti-Flag. È stato riscontrato che L rrk one aveva un livello medio di fosforilazione che è inferiore a L rrk 2 nelle condizioni testate, sebbene la significatività statistica non sia raggiunta, Non dimenticare che il lavoro con la radioattività può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come dispositivi di protezione individuale molto forti e lavorare secondo le procedure fornite dal dipartimento di sicurezza del tuo istituto dovrebbero sempre essere prese attraverso l'esecuzione di questo protocollo.

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Fosfoinositidi stanno segnalando lipidi la cui abbondanza relativa cambia rapidamente in risposta a vari stimoli. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'abbondanza di fosfoinositidi dalle cellule metabolicamente marcatura con 3 H- myo-inositolo, seguita da estrazione e deacilazione. Estratti glycero-inositides sono quindi separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione e quantificati dal flusso scintillazione.

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Descriviamo qui un metodo per identificare fosforilazioni multiple di una proteina intrinsecamente disordinata mediante Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), utilizzando la proteina Tau come caso di studio. La Tau ricombinante viene arricchita isotopicamente e modificata in vitro da una chinasi prima dell'acquisizione e dell'analisi dei dati.

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Le chinasi di proteine ​​sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell'attività di chinasi mediante l'uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

I test di concorrenza del peptide sono ampiamente usati in una varietà di esperimenti molecolari ed immunologici. Questo documento descrive un metodo dettagliato per un test in vitro di oligopeptide-concorrenza e le relative procedure di convalida, che possono essere utili per trovare siti specifici di fosforilazione.

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Lo studio presente descrive un metodo semplice per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione dalla leucina-ricche ripetere chinasi 2.

Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

Abbiamo caratterizzato una nuova proteina della chinasi utilizzando robusti approcci biochimici: analisi Western Blot con un anticorpo specifico dedicato su diverse linee cellulari e tessuti, interazioni con esperimenti di coimmunoprecipitazioni, attività della chinasi rilevata da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico per ilfosforo e con l'etichettatura ATP di z[32 P].

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Questo protocollo descrive un saggio nonradioattivo per misurare l'attività della chinasi delle chinasi polinucleotide (PNKs) su piccoli substrati di DNA e RNA.

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Questo video mostra le tecniche per l'etichettatura delle cellule staminali embrionali umane e cellule staminali mesenchimali con coloranti fluorescenti. Questa tecnica può essere utilizzata per un monitoraggio in vivo di cellule staminali trapiantate con imaging ottico e per le correlazioni istopatologiche con microscopia a fluorescenza.

Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

Scopri la marcatura metabolica di LRRK1 e LRRK2 con fosfato radioattivo per quantificare i livelli di fosforilazione cellulare. Questo metodo consente analisi accurate anche senza anticorpi fosfo-specifici.

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

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