Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine ​​multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con ³² P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di marcare le proteine di interesse con fosfati radioattivi al fine di quantificare i livelli di fosforilazione cellulare delle proteine. Ciò si ottiene coltivando cellule in presenza di fosforo 32 per marcare radioattivamente le modifiche del fosfato delle proteine espresse nelle cellule. In una seconda fase, le cellule marcate vengono lisate e i lisati vengono incubati con una perla di affinità per l'immunopurificazione delle proteine da analizzare.

Successivamente, i campioni di proteine marcate e purificate vengono analizzati su sodio do desal solfato, elettroforesi su gel di poliacrilammide e sottoposti a membrane di fluoruro di poliolaina. Al fine di rilevare l'incorporazione radioattiva del fosfato e i livelli proteici, si ottengono risultati che mostrano che le chinasi ripetute una e due ricche di leucina, abbreviate L rrk uno e L rrk due, sono fosforilate nelle cellule a livelli comparabili sulla base dell'autoradiografia e del rilevamento immunologico. Uno dei principali vantaggi della tecnica di marcatura metabolica rispetto ad altre tecniche come il fosfo, l'immuno blotting, è che questa tecnica consente la determinazione dei livelli di fosforilazione cellulare totale delle proteine, comprese le proteine per le quali non sono disponibili anticorpi fosfo.

Il secondo grande vantaggio di questa tecnica è che è possibile eseguire confronti quantitativi tra diverse proteine nei loro livelli totali di fosforilazione cellulare. A dimostrare la procedura sarà F gao, un tecnico del nostro laboratorio per iniziare la coltura di linee cellulari HEC 2 93 T secondo le condizioni di coltura standard in dcos modified eagle, medium o DMM con l'8% di vitello fetale, siero e gentamicina. Espandere la piastra ed esprimere la proteina L rrk two con tripla bandiera tramite trasfezione o trasduzione mediata da vettore lentivirale come discusso nel protocollo di testo.

Quando le celle sono confluenti dall'80 al 100%, sciacquarle con dmm preriscaldato senza fosfati. Sotto un flusso laminare, preparare una provetta di falco con 2,1 millilitri di DM privo di fosfati per m per piastra di cellule a sei pozzetti da marcare con fosforo. 32 ortofosfato.

Preparare il banco presso il quale verranno eseguiti gli esperimenti con le radiazioni ionizzanti. Lo spazio di lavoro è coperto da un tappetino di raccolta su cui è posizionato un rivestimento protettivo di materiale assorbente. Prevedere anche un barattolo di perspex sull'area di lavoro e posizionare il tubo di terreno privo di fosfati all'interno.

Estrarre dal frigorifero il contenitore rivestito di piombo con la fiala di ortofosfato marcato con fosforo 32 e portarlo al banco di radioattività. Monitorare il contenitore per la contaminazione radioattiva esterna utilizzando un contatore Geiger diluire l'ortofosfato marcato con fosforo 32 nella provetta di dmem privo di fosfati. Aggiungere una concentrazione di 24 micro curie per millilitro.

Conservare il tubo nel barattolo di perspex. Chiudere il contenitore con il resto dell'ortofosfato etichettato con fosforo 32 prima di rimetterlo in frigorifero. Quindi, rimuovere le piastre a sei pozzetti con le celle da etichettare dall'incubatore e posizionarle sul banco di radioattività.

Rimuovere il surnatante medio e scartarlo. Quindi aggiungere due millilitri di terreno privo di fosfati contenente fosforo. 32 ortofosfato marcato per pozzetto.

Posizionare le piastre di coltura in una scatola di perspex e quindi monitorare il contenitore per la contaminazione radioattiva esterna utilizzando un contatore geiger. Quindi trasferire la scatola di perspex con le cellule in un incubatore di cellule eucariotiche dedicato alla marcatura metabolica isotopica e incubare le cellule da una a 20 ore. A questo punto del protocollo, le cellule possono essere trattate con un composto, se lo si desidera, come indicato nel protocollo di testo Dopo il trattamento e l'incubazione delle cellule, rimuovere il terreno dalle cellule e gettarlo in una provetta per la raccolta dei rifiuti che viene posta nel barattolo di perspex.

Sciacquare le celle due volte con due millilitri di soluzione salina tamponata tris ghiacciata. Gettare la soluzione di risciacquo nel tubo di raccolta dei rifiuti. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tampone di lisi per immunoprecipitazione ghiacciata a ciascun pozzetto e raccogliere il lisato pipettandolo su e giù.

Per allentare tutte le cellule lisate, trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga e incubare su ghiaccio almeno 10 minuti prima della centrifusione come indicato nel protocollo di testo per isolare la proteina di interesse mediante immunopurificazione. Per prima cosa, trasferire le provette per microcentrifuga con lisati da centrifuga nel ghiaccio. Quindi pipettare il surnatante in provette da microcentrifuga contenenti 10 microlitri di volume del letto di bandiera M a due velocità.

Equilibrati come discusso nel protocollo di testo, trasferire le provette per microcentrifuga in una provetta da 50 millilitri. Dopo aver trasferito le provette per microcentrifuga in provette da 50 millilitri etichettate su ghiaccio, posizionare i campioni su un dispositivo rotante dietro uno schermo in perspex nell'area designata di una cella frigorifera per la miscelazione end-over end a quattro gradi Celsius per una o 20 ore dopo l'incubazione, far girare la bandiera legata alle proteine M due perle aro in provette per microcentrifuga dopo aver scartato il surnatante in una provetta per la raccolta dei rifiuti. Procedere al lavaggio delle perline come discusso nel protocollo di testo.

Quindi risospendere le perle lavate in 40 microlitri di tampone di caricamento SDS del campione IP Riscaldare i campioni nel tampone di caricamento a 95 gradi Celsius per due minuti prima di centrifugare per un minuto a più di 1000 volte g per pellettare le perle Preparare il modulo di elettroforesi su gel proteico sul banco di radioattività dietro uno schermo perspec. Caricare i campioni su gel di pagina SDS da tre a 8% di acetato di tris T, incluso un marcatore di peso molecolare adatto a discernere le dimensioni delle proteine ad alto peso molecolare prima di eseguire l'elettroforesi. Dopo l'elettroforesi, rimuovere il gel dal suo involucro di plastica e trasferirlo in un contenitore con tampone di trasferimento Western blotting.

A seguire la preparazione del gel e della membrana in PVDF. Preparare il sandwich di tamponamento sulla superficie del modulo di tamponamento semi-asciutto come descritto nel protocollo di testo. Trasferire le proteine a 15 volt per una o due ore dopo il trasferimento.

Rimuovere la membrana in PVDF con le proteine tamponate dal modulo di blotting e asciugare la membrana per eseguire l'autoradiografia. Innanzitutto, esporre la membrana a una piastra di fosforescenza per un periodo compreso tra uno e cinque giorni. Leggere il fosforo 32 dalla piastra di fosforescenza esposta utilizzando uno scanner di fosforescenza e salvare l'immagine come tiff ad alta risoluzione per rilevare i livelli di proteine tramite rilevamento immunologico.

Reidratare le membrane immergendole brevemente nel metanolo e poi trasferendole in un recipiente di incubazione poco profondo con PBS. Bloccare le membrane in PBST contenente il 5% di latte. Incubare i blot con anticorpi anti LR K two o anticorpi Anti-Flag e procedere ulteriormente con le opportune fasi di lavaggio e l'incubazione secondaria degli anticorpi.

Dopo l'applicazione degli anticorpi, eseguire il rilevamento della chemiluminescenza per confermare i livelli relativi di proteina di LRRK due. Infine, quantificando la corporazione del fosforo 32 in LRK 2 utilizzando l'analisi diametrale come descritto nel protocollo di testo Qui sono mostrati i risultati rappresentativi per la marcatura metabolica di L Rrk uno e L Rrk 2 due in cellule HEC 2 93 T. Qui raffigurato è un radiogramma automatico rappresentativo dell'incorporazione del fosforo 32 e un blot occidentale rappresentativo del rilevamento di L Rrk uno e L Rrk due tramite le loro etichette a tripla bandiera.

L'incorporazione di fosfato radioattivo è osservata sia per L rrk uno che per L rrk 2. Dopo la quantificazione dei livelli di fosforo 32 normalizzati ai livelli proteici misurati mediante analisi metrica della densità del rilevamento immunologico con anticorpo Anti-Flag. È stato riscontrato che L rrk one aveva un livello medio di fosforilazione che è inferiore a L rrk 2 nelle condizioni testate, sebbene la significatività statistica non sia raggiunta, Non dimenticare che il lavoro con la radioattività può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come dispositivi di protezione individuale molto forti e lavorare secondo le procedure fornite dal dipartimento di sicurezza del tuo istituto dovrebbero sempre essere prese attraverso l'esecuzione di questo protocollo.