Name: Ultrasensibile rilevazione di biomarcatori utilizzando un Imprinting molecolare basato biosensore capacitivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Scopri un metodo di rilevazione biomarcatori ad alta sensibilità basato su imprinting molecolare e biosensore capacitivo. Questa tecnica senza etichette permette il monitoraggio in tempo reale per applicazioni diagnostiche e ambientali.

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Maria Baumgarten (piattaforma biotecnologia IQ, infezione medicina, Università di Lund) è riconosciuto per eseguire e fornire scansione micrografi elettronici. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da The Swedish Research Consiglio Formas (2017-00100) come parte dell'europeo terza programmazione iniziativa congiunta su chiamata resistenza antimicrobica (JPIAMR) "Dinamica di trasmissione". I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, interpretazione, scrittura, preparazione del manoscritto, decisione di inviare, o la decisione di pubblicare il lavoro.

1. modifica del coprioggetto in vetro (modello francobolli)
<ol><li>Per pulire il vetro vetrini coprioggetto, immergerli in sequenza in 10 mL di HCl 1,0 M, acqua deionizzata e 1,0 M di NaOH, rispettivamente, per 10 min in ogni passaggio in un pulitore ad ultrasuoni a temperatura ambiente.<ol>
<li>Asciugare il vetro vetrini coprioggetto con gas azoto. Nota: I vetrini coprioggetto sono asciugati da evaporazione sotto un flusso di azoto gassoso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immergere i vetrini puliti e asciugati in 10% (v/v), 10 mL di soluzione di 3-ammino-propil-trietossisilano (APTES) in etanolo per 1 h per introdurre gruppi amminici sulla superficie del vetro di copertura, a temperatura ambiente.<ol>
<li>Sciacquare i vetrini con acqua deionizzata.</li>
		<li>Asciugare i vetrini con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immergere i vetrini APTES-modificato nel 5% (v/v), 10 mL di soluzione di glutaraldeide in tampone fosfato 10 mM (pH 7.4) per 2 h per attivare i gruppi amminici sulla superficie, a temperatura ambiente6,15.<ol>
<li>Sciacquare i vetrini con 10 mM di tampone fosfato (pH 7,4) al fine di rimuovere glutaraldeide in eccesso dalla superficie.</li>
		<li>Asciugare i vetrini con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 1,0 mL di soluzione di modello (proteina/del batteriofago) in tampone fosfato 10 mM (pH 7.4) in concentrazione di 0,1 mg/mL. Nota: Sciogliere 0,1 mg di proteina in 1,0 mL di tampone fosfato (10 mM, pH 7.4). Se necessario, uno spettrofotometro (280 nm) può essere utilizzato per determinare la concentrazione di proteina.<ol>
<li>Goccia di 200 µ l di questa soluzione di modello sul coprioggetto modificate e incubare a 4 ° C durante la notte. Nota: La soluzione del modello in eccesso possa essere utilizzata per preparare 1-2 Altri Stamp di modello a essere utilizzata negli studi di caratterizzazione.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini con 10 mM di tampone fosfato (pH 7,4) al fine di rimuovere il modello non associato dalla superficie. Nota: Per sciacquare gli elettrodi, lavarli con tampone fosfato (10 mM, pH 7.4) per 30 s.</li>
		<li>Asciugare i vetrini con gas azoto. Nota: Le polizze di copertura deve essere conservate a 4 ° C fino a quando non vengono utilizzati in fase di polimerizzazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. modifica delle sonde capacitive di oro
<ol><li>Per pulire gli elettrodi, immergere gli elettrodi in un becher da piccolo, in sequenza, contenente 5 mL di etanolo (70%), deionizzata acqua, acetone, acqua deionizzata, soluzione piranha acide (3:1, H2SO4: H2O2, v/v) e deionizzata acqua, rispettivamente per 10 min in ogni passo, in un pulitore ad ultrasuoni a temperatura ambiente.<ol>
<li>Asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per poter eseguire l'elettropolimerizzazione di tiramina, preparare 8 mL di soluzione di tiramina di 10 mM in 10 mM fosfato tampone (pH 7,4) contenente etanolo (2 mL)15. Nota: Il volume totale della soluzione tiramina deve essere 8 mL in totale di cui 2 mL di etanolo.<ol>
<li>Eseguire analisi voltammetriche ciclici (15 cicli) in questa soluzione utilizzando un potenziostato coprendo un potenziale gamma di 0 - 1.5 V (Ag/AgCl) e una velocità di scansione di 50 mV/s30.</li>
		<li>Sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata.</li>
		<li>Asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immergere gli elettrodi in una soluzione contenente cloruro di acriloil di 30 mM e 30 mM trimetilammina in toluene (Vtotale = 5 mL) a temperatura ambiente durante la notte6,15,30.<ol>
<li>Sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata. Nota: Per garantire una migliore rimozione delle non reagito acriloil residui di cloruro e trimetilammina, inoltre è possibile lavare la superficie con NaOH dopo acqua deionizzata.</li>
		<li>Asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione del modello impresso capacitive di oro
<ol><li>
Preparazione del batteriofago impresso capacitive di oro
	<ol>
<li>Prima della polimerizzazione, preparare una soluzione di monomero contenente monomero (N-idrossimetil acrilammide) e cross-linker (polietilene glicole-400-dimetacrilato) in un rapporto di 1:5 (mol/mol) in 1 mL di tampone fosfato 10 mM (pH 7.4). Nota: La soluzione di monomero contenente monomero e cross-linker può essere utilizzata in diversi rapporti, o i tipi del monomero e cross-linker possono essere cambiati secondo il modello per l'ottimizzazione dell'interazione specifico.</li>
		<li>Aggiungere 1 mg di foto-iniziatore in questa soluzione. Nota: Se la polimerizzazione avviene sotto luce UV, l'iniziatore di foto deve essere utilizzato per avviare la polimerizzazione. Se la polimerizzazione avviene mediante polimerizzazione radicalica, il tipo dell'iniziatore deve essere modificato.</li>
		<li>Pipettare 1,5 µ l di questa soluzione sulla superficie dell'oro dell'elettrodo d'oro modificata. Nota: La superficie dell'oro dell'elettrodo è rappresentata schematicamente nella Figura 1.</li>
		<li>Portare il timbro di modello a contatto con la soluzione di monomero nella parte superiore la superficie dell'elettrodo d'oro.</li>
		<li>Avviare la polimerizzazione UV (365 nm, 400 W) e proseguire per 15 min31. Nota: Polimerizzazione UV viene eseguita all'interno di un armadietto di raffreddamento che è impostato a-25 ° C prima dell'inizio della polimerizzazione. Quindi, il sistema di polimerizzazione UV è acceso e la polimerizzazione è continuata per 15 min prima di spegnere il sistema di polimerizzazione UV.</li>
		<li>Rimuovere il timbro modello dalla superficie usando il forcipe. Nota: Durante la rimozione del timbro modello dalla superficie, il film polimerico sulla superficie potrebbe essere danneggiato. Pertanto, il timbro deve essere rimosso dalla superficie molto attentamente e lentamente senza usare la forza.</li>
		<li>Sciacquare la superficie dell'elettrodo con acqua deionizzata e asciugare con gas azoto.</li>
		<li>Immergere gli elettrodi in 1 mL di 10 mM 1-dodecanethiol preparato in etanolo per 20 min al fine di coprire i fori sulla superficie dell'elettrodo.</li>
		<li>Sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata e asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della proteina impresso capacitive di oro
	<ol>
<li>Prima della polimerizzazione, preparare una soluzione di monomero contenente monomeri (acrilammide: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µ l; N-isopropylacrylamide: 85,6 mg) e cross-linker (methylenebisacrylamide: 9,5 mg) in 820 µ l di acqua ultra-pura30,32.</li>
		<li>Preparare 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) in acqua ultra-pura.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l della soluzione TEMED nella soluzione di monomero e spurgo con azoto gassoso per 5 min.</li>
		<li>Preparare 10% (p/v) ammonio persolfato (APS) in acqua ultra-pura.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l della soluzione APS nella soluzione di monomero.</li>
		<li>Pipettare 1,5 µ l di soluzione di monomero sulla superficie dell'elettrodo d'oro modificate.</li>
		<li>Portare il timbro di modello a contatto con la superficie trattata monomero.</li>
		<li>Avviare la polimerizzazione a temperatura ambiente e continuare per 5 h. Nota: Per la preparazione di elettrodi d'oro impresso proteina, invece di UV-polimerizzazione, polimerizzazione radicalica a temperatura ambiente (25 ° C) viene eseguita utilizzando APS-TEMED come il catalizzatore di iniziatore.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione il timbro modello dalla superficie usando il forcipe.</li>
		<li>Sciacquare l'elettrodo con acqua deionizzata e asciugare con gas azoto.</li>
		<li>Immergere gli elettrodi in 1 mL di 10 mM 1-dodecanethiol preparato in etanolo per 20 min al fine di coprire i fori sulla superficie dell'elettrodo.</li>
		<li>Sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata e asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. caratterizzazione della superficie dell'elettrodo con microscopia elettronica (SEM)
<ol><li>Montare gli esemplari su supporti in alluminio con nastro adesivo carbonio.</li>
	<li>Rivestire gli elettrodi con 10 nm palladium/oro.</li>
	<li>Esaminare gli elettrodi con SEM</li>
</ol>5. in tempo reale misurazioni capacitivi con modello impresso capacitive di oro
<ol><li>Inserire gli elettrodi d'oro capacitivi impressi nella cella elettrochimica flusso integrata di un biosensore capacitivo.</li>
	<li>Preparare 100 mL di buffer di rigenerazione (25 mM glicina-HCl, pH 2.5, includendo 50mm Tween-20) e 1 L in esecuzione buffer (per batteriofago impresso sistema: fosfato 10 mM, pH 7.4; per sistema impresso proteina: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4).</li>
	<li>Avviare l'analisi con l'iniezione del buffer di rigenerazione per rigenerare il sistema e in esecuzione buffer per riequilibrare il sistema per 25 min.</li>
	<li>Preparare soluzioni modello standard nella gamma di concentrazione desiderata in tampone di corsa. Nota: in primo luogo preparare un brodo della soluzione del modello sciogliendo 0,1 mg di proteina, o circa 108 pfu batteriofagi, in 1,0 mL di tampone fosfato (fosfato 10 mM, pH 7.4). Quindi, preparare soluzioni standard per la curva di taratura facendo dieci diluizioni sequenziale 10 volte dalla soluzione di riserva. Queste soluzioni saranno analizzate con il biosensore capacitivo al punto 5.5. Concentrazione di proteine può essere misurata mediante uno spettrofotometro (280 nm). Al fine di misurare la concentrazione di batteriofago, può essere utilizzato un metodo di agar di doppio strato, che è descritto in precedenza Dettagli19.</li>
	<li>Iniettare 250 µ l di queste soluzioni standard in sequenza per il sistema in condizioni ottimali (portata: 100 µ l/min, temperatura: 25 ° C). Nota: In questa applicazione, le soluzioni standard della proteina sono state preparate nella gamma di concentrazione di 1,0 x 10-4 - 1,0 x 10-14, mentre le concentrazioni di batteriofago erano nella gamma 1.0 x 101 - 1.0 x 105 pfu/mL. Le soluzioni erano collocate nella valvola di iniezione e in modo sequenziale iniettate nel sistema, iniettando i campioni in triplici copie attraverso la pompa a siringa singola e la valvola multivie. La diminuzione della capacità dopo l'iniezione di soluzioni standard derivanti da un'associazione del modello per le cavità impresse è controllata automaticamente dal software dello strumento.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quando questo metodo viene eseguito, ci sono alcuni passaggi critici che devono essere considerati mentre seguendo il protocollo. Un passaggio fondamentale è la fase di pulizia con soluzione acida piranha. Fase 2.1 non deve essere più di 10 min. La soluzione del modello per passo 1.4 non deve superare 0,1 mg/mL, dato che questi valori sono stati ottimizzati in precedenza. Voltametric ciclico scansioni non devono superare 15 cicli al fine di ottenere lo spessore ottimale. Per passo 3.1.3, 1,5 µ l è un valore ottimizzato. Questo valore non deve essere più alto per questo specifico tipo di elettrodo. Se il sistema di polimerizzazione UV ha una potenza di 400 W, la polimerizzazione deve essere eseguita per un massimo di 10-15 min. Non appena l'APS (iniziatore) viene aggiunto alla soluzione dopo TEMED, il passo successivo deve essere eseguito molto rapidamente per evitare immediata polimerizzazione (punto 3.2.5).
Una delle fasi più critiche è la rimozione del timbro modello dalla superficie dopo polimerizzazione UV. Se questo passaggio non viene eseguito correttamente, c'è il rischio che il film polimerico sulla superficie dell'elettrodo può essere rimosso con il timbro. Pertanto, si consiglia di immergere l'elettrodo e il timbro della proteina sulla parte superiore in una soluzione di acqua dopo la polimerizzazione, quindi rimuovere il timbro molto lentamente e con attenzione dalla superficie (punto 3.1.6).
In base al modello utilizzato, modifiche nel tipo e nel rapporto di monomeri usati (monomero funzionale e cross-linker) possono essere valutate in termini di generazione di sensibilità. Questo deve essere determinato empiricamente. Ulteriormente, il legame di affinità della molecola stampo solitamente coinvolge numerose interazioni differenti contemporaneamente. Di conseguenza, questo può portare a problemi durante la procedura di rigenerazione. Se il modello associato non viene rilasciato correttamente dalla superficie, questo può influenzare la possibilità di riutilizzo dell'elettrodo per ulteriori analisi. Queste affinità multipunto può anche derivare da associazione tramite interazioni più deboli. In tali sistemi, il legame non specifico può aver luogo, che possa influenzare negativamente la selettività del sistema16. Si tratta di comune e generale, limiti del metodo.
Oltre a queste limitazioni specifiche, ci sono molti vantaggi significativi del metodo discusso rispetto ai metodi esistenti. Mentre RIAs, Elisa e fluorometriche misurazioni sono molto sensibili, richiedono l'utilizzo di materiale con etichettato (modello o rivelatore), mentre il biosensore è completamente privo di etichetta. Questi metodi sono anche più costosi e che richiede tempo. Un approccio di biosensore consente sintesi rapida, parallela di MIPs in diverse composizioni al tempo stesso16. Poiché solo pochi microlitri di soluzione di monomero è necessaria per la preparazione, il metodo è conveniente quando si utilizza costosi o altrimenti limitati monomeri. Elettrodi di MIP più ulteriormente, singoli possono essere utilizzati per circa 80 analisi senza una significativa diminuzione delle prestazioni, che è significativamente superiore a altri metodi esistenti30. I metodi esistenti anche soffrono, in vari gradi, di bassa sensibilità e selettività, mentre il metodo descritto consente una rilevazione e quantificazione delle molecole nella gamma pM con elevata selettività.
A causa del rapporto costo-efficacia, la facilità di funzionamento dello strumento e la rilevazione in tempo reale e sensibile in tempi brevi rispetto ai metodi esistenti, i biosensori sono molto promettente punto di sistemi di rilevazione di cura in condizioni di campo; ad esempio, per il monitoraggio ambientale e per applicazioni nei paesi in via di sviluppo. In molte applicazioni all'interno di diagnosi della malattia, in tempo reale, sensibile, selettivo e rapido rilevamento di un biomarcatore in una miscela complessa come siero è richiesto15,25. Qui, i biosensori sono superiori a metodi esistenti, in particolare, grazie alla loro robustezza e sensibilità. In particolare per la rilevazione di agenti infettivi, batteriofagi recentemente sono considerati come elemento alternativo presta per biosensori a causa del loro ospite batteri specificità33,34,35. Sostituzione degli anticorpi con batteriofagi è molto promettente al fine di ridurre i costi e aumentare la stabilità anche altri36. Tale sistema permetterà anche per la rilevazione e la quantificazione dei fagi specifici nell'ambiente e da campioni clinici. A causa della prevalenza di batteriofagi e la loro capacità di trasdurre batteri con resistenza antibiotica geni37,38, tale metodo può essere utile studiare la diffusione di batteri resistenti.

La quantificazione delle biomolecole è utilizzata in molti campi di ricerca diversi all'interno delle scienze, che impiegano metodi come la radioimmunoanalisi (RIA) o ELISA1. Alcuni di questi metodi richiedono un etichettati reagente come un radioisotopo o enzima etichettato anticorpi e antigeni, che li rende laborioso e dispendioso con procedure complesse2. Ulteriormente, la robustezza, la selettività e la sensibilità di questi metodi non sono sufficienti per tutte le analisi; in particolare non sono sufficienti quando attogram quantitativi devono essere analizzati, piuttosto che di pittogramma quantità3. Per questo scopo, biosensori hanno guadagnato notevole interesse4,5, in particolare in combinazione con imprinting molecolare per una maggiore robustezza.
Imprinting molecolare si basa sulla creazione di cavità di polimerizzazione di monomeri funzionali intorno al modello6, creazione di siti di riconoscimento artificiale che assomigliano perfettamente il modello7. Questa tecnica è stata utilizzata per diverse applicazioni, tra cui sistemi di drug delivery e separazione analitica, ma anche come elementi di presta in biosensori8,9,10. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà nella progettazione di stampati molecolare Polimeri (MIPs) per i modelli macromolecolari come proteine e cellule11,12. A causa di questo, molti ricercatori si sono concentrati sull'imprinting la proteina modello direttamente su un substrato, creando così una superficie che verrà riconosciuta dalla proteina bersaglio12. Questa tecnica di rivestimento di superficie utilizzata per impiegare cavità di riconoscimento per assembly tra cui proteine e molecole di grandi dimensioni viene chiamata microcontatto imprinting13,14. La procedura generale del metodo dipende la polimerizzazione tra due superfici - un timbro di modello e un supporto di polimero - su cui il modello è adsorbito su una superficie di15,16e portato in contatto con il superficie trattata monomero. In questo modo, un film polimerico sottile è formato sul supporto tramite polimerizzazione UV. Infine, il modello viene rimosso, lasciando dietro di sé il cavità specifiche modello sulla superficie dell'elettrodo impresso. Questo metodo presenta alcuni vantaggi, tra cui una perdita ridotta attività della molecola impressa, anche come che richiedono piccole quantità di molecole di modello per l'imprinting elaborare16,17. Così, queste superfici conveniente, stabile, sensibile e selettive possono essere create sulle superfici sensore, targeting per qualsiasi modello di scelta dell'utente.
Il biosensore può essere utilizzato per la rilevazione di singole proteine e biomacromolecole molto più grandi, compresi i virus. Un gruppo specifico di virus guadagnando interesse recente è il batteriofago, che è un virus che infetta i batteri. Rilevamento rapido e sensibile dei batteriofagi è importante durante biotecnologiche e biofarmaceutica processi al fine di determinare le infezioni di colture batteriche con batteriofagi18. Il saggio biologico più comunemente utilizzato per il rilevamento del batteriofago è il doppio strato agar metodo19, che è laboriosa e richiede tempo. Parecchi tentativi sono stati fatti per sviluppare nuovi strumenti diagnostici per virus (compresi i batteriofagi) come forza atomica (AFM) la microscopia20, interferometria21, elettrochimica22e sensore sistema23, 24. un sacco di lavoro è stato incentrato su biosensori a causa di loro vantaggi come essendo facile da usare, altamente sensibile e capace di misurazione in tempo reale15,25. Un tipo specifico di biosensore è basato su variazioni di capacità. Questi biosensori capacitivi sono i sensori elettrochimici che misurano i cambiamenti nelle proprietà del dielettrica quando un analita interagisce con un elemento inoltre sulla superficie del sensore, causando una diminuzione nella capacità2,4 . Capacitivi biosensori sono stati utilizzati per la rilevazione di vari analiti come antigeni, anticorpi, proteine e metalli pesanti ioni6,26,27,28. Questi tipi di biosensori hanno molti vantaggi come intrinseca rapidità, alta sensibilità, semplicità, basso costo, facile manipolazione e misura in tempo reale senza etichettatura29.
Il metodo descritto nel presente documento mira a consentire l'individuazione e la quantificazione di basso-abbondanti biomolecole in campioni altamente complessi, senza la necessità dell'utilizzo di qualsiasi etichettatura. In particolare, la tecnica è più utile nella gamma atto-picogrammo di biomolecole, dove altri strumenti commercialmente esistenti non riescono a quantificare con precisione la loro destinazione.

<table><tbody><tr><td>Vetri Vetrini</td><td>ThermoFisher</td><td>102222</td><td>timbro proteico</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td>pulizia</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>pulizia Pulitore ad ultrasuoni</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>BRANSONIC M1800-E</td><td>pulizia</td></tr><tr><td>3-ammino-propil-trietossisilano (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td>modifica</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1009836010</td><td>risciacquo/pulizia</td></tr><tr><td>glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-100ML</td> acetone <td>reticolante</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850-1L-M</td><td>pulizia</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741-100ML</td><td>soluzione</td></tr> <tr><td>piranhaH2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-500ML</td><td>soluzione di piranha</td></tr><tr><td>tiramina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T90344-5G</td><td>modifica</td></tr><tr><td>CompactStat</td><td>Ivium Technologies</td><td>CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz</td><td>potenziostato</td></tr><tr><td>Kit di elettrodi contatore in platino</td><td>Equilabrio</td><td>AFCTR5</td><td></td></tr><tr><td>potenziostato Riferimento Elettrodo</td><td>Equilabrio</td><td>RREF0021</td><td>potenziostato cloruro</td></tr> di <tr><td>acriloil</td><td>EMD Millipore</td><td>8.00826.0100</td><td>modifica</td></tr><tr><td>trietilammina</td><td>EMD Millipore</td><td>8.08352.0100</td><td>modifica</td></tr><tr><td>toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-100ML</td><td>modifica</td></tr><tr><td>N-idrossimetilacrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>monomero funzionale</td></tr><tr><td>polietilenglicole-400-dimetacrilato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>409510-250ML</td><td>reticolante</td></tr><tr><td>2-idrossi-4&prime;-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896-50G</td><td>monomero funzionale</td></tr><tr><td>Polimerizzatore UV</td><td>Dymax</td><td>Dymax 5000ECE</td> Pinza per <td>polimerizzazione UV</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168777-1EA</td><td>consumabile</td></tr><tr><td>1-dodecanetiolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471364-100ML</td><td>agente bloccante</td></tr><tr><td>acrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553-100G</td><td>monomero funzionale</td></tr><tr><td>N-idrossimetilacrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>monomero funzionale</td></tr><tr><td>N-isopropilacrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415324-50G</td><td>monomero funzionale</td></tr><tr><td>metilenebisacrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072-500G</td><td>monomero reticolante</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletildiammina (TEMED)</td><td>Catalizzatore Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>persolfato di ammonio</td><td>Iniziatore Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Biosensore capacitivo</td><td>CapSenze</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Merck</td><td>1042011000</td><td>tampone di rigenerazione</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td>tampone di rigenerazione</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352-1KG</td><td>tampone di corsa</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; e toro; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567547-1KG</td><td>tampone di corsa</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; e toro; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567549-1KG</td><td>tampone di corsa</td></tr><tr><td>DELPHI microscopio elettronico correlativo alla luce e all'elettrone</td><td>Attrezzatura Phenom-World</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi capacitivi in oro</td><td>CapSenze Materiali</td><td>di consumo</td>Biosystems <td></td></tr><tr><td>2,2'-azobis(2-methypropionitrile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441090-25G</td><td>fotoiniziatore</td></tr><tr><td>CapSenze Smart Software</td><td>CapSenze Programma software Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ultrasensibile rilevazione di biomarcatori utilizzando un imprinting molecolare basato biosensore capacitivo

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

La capacità di rilevare e quantificare biomolecole in soluzioni complesse è sempre stato molto ricercata all'interno delle scienze naturali; utilizzato per l'individuazione di biomarcatori, contaminanti e altre molecole di interesse. Una tecnica comunemente utilizzata per questo scopo è l'enzima-collegata dell'immunosorbente Assay (ELISA), dove spesso un anticorpo è diretto verso una molecola specifica dell'obiettivo, e un secondo anticorpo marcato viene utilizzato per la rilevazione dell'anticorpo primario, consentendo la Quantificazione assoluta di biomolecole in fase di studio. Tuttavia, l'utilizzo di anticorpi come elementi di riconoscimento limita la robustezza del metodo; così come l'esigenza di usare molecole con etichettate. Per superare queste limitazioni, imprinting molecolare è stata implementata, creazione di siti di riconoscimento artificiale complementari alla molecola del modello e alla necessità dell'uso di anticorpi per l'associazione iniziale. Ulteriormente, per ancora più elevata sensibilità, l'anticorpo secondario marcato può essere sostituita da biosensori affidarsi la capacità per la quantificazione della molecola target. In questo protocollo, descriviamo un metodo per rapidamente e privo di etichetta rilevare e quantificare basso-abbondanti biomolecole (proteine e virus) in campioni complessi, con una sensibilità che è significativamente migliore rispetto ai sistemi di rilevamento comunemente usati come l'ELISA. Tutto questo è mediato dall'imprinting molecolare in combinazione con un biosensore di capacitanza.

Seguendo il protocollo, seguendo lo schema in Figura 1, nudo elettrodo d'oro sarà improntato con un modello, che rappresentano la struttura di un biomacromolecule. Questo elettrodo può essere applicato in un biosensore capacitivo (Figura 2), consentendo l'applicazione stabile di un modello sull'elettrodo e la misurazione delle variazioni della capacità all'associazione del modello.
Una rappresentazione schematica del biosensore capacitivo è illustrata nella Figura 2. La pompa centris, che è responsabile per iniezione continua del buffer in esecuzione (fosfato 10 mM, pH 7.4) e il buffer di rigenerazione (25 mM glicina-HCl, pH 2.5) durante la rigenerazione in cella di flusso, può essere visto chiaramente nella figura. La cella di flusso è costituito da lavoro, riferimento ed elettrodi contatore. La valvola di iniezione è composta da soluzioni standard della proteina/del batteriofago, che passano attraverso il degassificatore prima e poi iniettato in sequenza nel sistema. Appena le soluzioni raggiungono l'elettrodo di lavoro inserito nella cella di flusso, il risultato è monitorato in tempo reale. I valori di capacità possono essere registrati seguendo la sensorgrams sullo schermo del computer.
Figura 3 e Figura 4 raffigurano le differenze tra la superficie del nudo e impressi elettrodi d'oro. Questo passaggio di caratterizzazione è importante assicurare che ci sono cavità polimerici, visto come rugosità sulla superficie dell'elettrodo dopo imprinting. Oltre a SEM, ci sono anche altri metodi di caratterizzazione tra cui AFM, misure di angolo di contatto, ellissometria ecc., che può essere usato per caratterizzare la superficie dopo imprinting. In questo modo, è possibile garantire che il processo di imprinting è successo e che modello nelle cavità si formata sulla superficie. All'interno di queste cavità, il modello possibile associare con affinità e alta specificità.
Dopo l'iniezione delle soluzioni standard nel sistema capacitivo, una media delle ultime cinque letture è stata calcolata automaticamente dal software, e i grafici di calibrazione sono stati ottenuti tracciando il cambiamento nella capacità contro la concentrazione dei analita. La diminuzione della capacità registrati è sorto da un'associazione del modello. Le altre molecole che si legano all'elettrodo d'oro in superficie, maggiore la riduzione di capacità totale, secondo il principio generale di misurazione capacitivi. Figura 5 e Figura 6 indicano che con l'aumento della concentrazione dell'analita, la ΔC aumenta come previsto. La gamma dinamica (fra cui è l'intervallo di concentrazione dove il sistema è utile per l'individuazione di un target specifico) e il limite di rilevabilità (LOD) può essere valutate analizzando questi grafici. Secondo Figura 6, il biosensore capacitivo batteriofago improntato in grado di rilevare i batteriofagi nella gamma di concentrazione di 101 - 105 pfu/mL, con un valore LOD di pfu/mL 10 in questo studio. Si suppone che sia Figura 5 e Figura 6 anche evidenziare la necessità di misurare la curva di taratura nello stesso intervallo richiesto per la concentrazione di modello, poichè la linearità della regressione può variare sopra le concentrazioni ( Figura 5), o hanno diverse piste (Figura 6). Si deve inoltre osservare che, a causa delle basse concentrazioni utilizzate, il sistema è abbastanza sensibile alle fluttuazioni (torbidezza nel campione, progetto di aria, ecc.) e di conseguenza, si consiglia di eseguire almeno triplici copie per ridurre il potenziale di valori anomali, tra cui . Per lo stesso motivo, la deviazione standard può essere abbastanza significativa per campioni altamente diluiti, come si vede nella Figura 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig1.jpg"> Figura 1 . Rappresentazione schematica di microcontatto imprinting metodo. (A) preparazione dei vetro vetrini (francobolli di modello), (B) preparazione degli elettrodi d'oro capacitivi, (C) microcontatto imprinting del modello sulla superficie dell'elettrodo d'oro tramite polimerizzazione UV e (D) rimozione del modello dalla superficie dell'elettrodo (riprodotto da Ertürk et al., biotecnologia rapporti 2014 (3): 65-72 con il permesso). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig2.jpg"> Nella figura 2. Rappresentazione schematica del biosensore capacitivo. Il layout generale del biosensore capacitivo utilizzato in questo studio (riprodotto da Ertürk et al., biotecnologia rapporti 2014 (3): 65-72 con il permesso). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig3.jpg"> Nella figura 3. Scansione microscopia elettronica della proteina impresso elettrodi. Immagini di SEM di (A) nudo elettrodo d'oro (barra della scala = 20 µm), e (B), una proteina impresso capacitiva di oro (barra della scala = 10 µm). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig4.jpg"> Nella figura 4. Scansione microscopia elettronica del batteriofago impresso elettrodi. Immagini di SEM di un elettrodo d'oro nudo (barra della scala = 20 µm) (A), e un batteriofago impresso capacitiva di oro in diversi livelli di ingrandimento (6600 x, barra della scala = 10 µm) (B) e 11, 500 X, scala bar = 5 µm) (C); le frecce indicano aderiti batteriofagi). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig5.jpg"> Nella figura 5. Effetto della composizione di buffer per grafici di taratura. Grafico di taratura mostrando il cambiamento nella capacità vs una concentrazione nella proteina in condizioni ottimali (Buffer di esecuzione: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; Buffer di rigenerazione: 25 mM glicina-HCl, pH 2.5 includendo 50mm Tween-20; Portata: 100 µ l/min, volume del campione: 250 µ l; T: 25 ° C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig6.jpg"> Nella figura 6. Curva di calibrazione rappresentativo per grandi biomacromolecules. Grafico di taratura che mostra la variazione della capacità vs concentrazione batteriofago in condizioni ottimali (Running Buffer: 10 mM fosfato, pH 7.4; Buffer di rigenerazione: 25 mM glicina-HCl, pH 2.5 includendo 50mm Tween-20; Portata: 100 µ l/min, volume del campione: 250 µ l; T: 25 ° C) <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione delle molecole abbondanti bassi in soluzioni complesse utilizzando molecolare imprinting in combinazione con un biosensore di capacitanza.

Ultrasensibile rilevazione di biomarcatori utilizzando un Imprinting molecolare basato biosensore capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di rilevare e quantificare biomolecole a bassa abbondanza in campioni altamente complessi con elevata sensibilità, semplicità, basso costo, velocità e senza l'uso di alcuna marcatura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biotecnologia, della biochimica e della biomedicina, come il monitoraggio ambientale, la sicurezza alimentare, la qualità dell'acqua potabile e la diagnosi medica. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua intrinseca rapidità, semplicità, alta sensibilità, basso costo, facilità di manipolazione e rilevamento in tempo reale senza l'utilizzo di reagenti di marcatura.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di malattie grazie alla sua capacità di quantificare biomolecole a bassa abbondanza. Ad esempio, diversi biomarcatori in tempo reale. Per pulire i vetrini coprioggetti, immergerli in 10 millilitri di HCl molare 1,0 per 10 minuti in un pulitore ad ultrasuoni a temperatura ambiente.Quindi, immergerli in acqua deionizzata e idrossido di sodio 1,0 molare nelle stesse condizioni. Asciugare i vetrini coprioggetti con azoto gassoso. Quindi, immergere i vetrini coprioggetti puliti e asciutti in 10 millilitri di una soluzione APTES per un'ora per introdurre gruppi amminici sulla superficie del vetro coprioggetto a temperatura ambiente.Sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua deionizzata prima di asciugarli nuovamente con azoto gassoso. Immergere i vetrini coprioggetto modificati APTES in una soluzione da 10 millilitri di glutaraldeide per due ore per attivare i gruppi amminici sulla superficie a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini coprioggetti con un tampone fosfato da 10 millimolari per rimuovere l'eccesso di glutaraldeide dalla superficie.Asciugare i vetrini coprioggetti con azoto gassoso. Successivamente, preparare 1,0 millilitri di soluzione stampo in tampone fosfato da 10 millimolari in una concentrazione di 0,1 milligrammi per millilitro. Far cadere 200 microlitri di questa soluzione modello sui vetrini coprioggetti modificati e incubare a quattro gradi Celsius per una notte.Per pulire gli elettrodi, immergere prima gli elettrodi in un piccolo becher contenente cinque millilitri di etanolo al 70% per 10 minuti in un pulitore a ultrasuoni a temperatura ambiente. Quindi, immergere in sequenza gli elettrodi in acqua deionizzata, acetone, acqua deionizzata, soluzione acida di piranha e acqua deionizzata nelle stesse condizioni. Asciugare gli elettrodi con azoto gassoso.Per eseguire l'elettropolimerizzazione della tiramina, preparare otto millilitri di soluzione di tiramina da 10 millimolari in tampone fosfato da 10 millimolari contenente due millilitri di etanolo. Eseguire 15 cicli di scansioni voltammetriche cicliche in questa soluzione utilizzando un potenziostato che copre un intervallo di potenziale da zero a 1,5 volt e una velocità di scansione di 50 millivolt al secondo. Quindi, sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata prima di asciugare gli elettrodi con azoto gassoso.Immergere gli elettrodi in una soluzione contenente 30 millimolari di acriloil cloruro e 30 millimolari di trimetilammina in toluene a temperatura ambiente per una notte prima di risciacquare e asciugare nuovamente gli elettrodi. Prima della polimerizzazione, preparare una soluzione di monimero contenente monomeri e reticolante in 820 microlitri di acqua ultrapura. Quindi, preparare il 5% di volume a volume di TEMED in acqua ultrapura.Aggiungere 20 microlitri della soluzione TEMED nella soluzione monomerica e spurgare con azoto gassoso per cinque minuti. Quindi, aggiungere 20 microlitri di APS appena preparato nella soluzione monomerica. Pipettare 1,5 microlitri della soluzione monomerica sulla superficie dell'elettrodo d'oro modificato.Ora, inizia la polimerizzazione portando il timbro modello a contatto con la superficie trattata con monomero e lascialo per cinque ore a temperatura ambiente. Dopo la polimerizzazione, rimuovere con cura il timbro del modello dalla superficie, utilizzando una pinza. Quindi, sciacquare l'elettrodo con acqua deionizzata e asciugarlo con azoto gassoso.Immergere gli elettrodi in un millilitro di dieci millomeri di un dodecaneteolo preparato in etanolo per venti minuti in modo da coprire i fori di spillo sulla superficie dell'elettrodo. Infine, sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata e asciugare gli elettrodi con azoto gassoso prima di caratterizzarne le superfici con la microscopia elettronica a scansione. Inserire gli elettrodi capacitivi in oro impressi nella cella a flusso elettrochimica integrata in un biosensore capacitivo.Preparare 100 millilitri di tampone di rigenerazione e un litro di tampone di marcia. Avviare l'analisi con l'iniezione del buffer di rigenerazione per rigenerare il sistema e del buffer in esecuzione per riequilibrare il sistema per 25 minuti. Preparare soluzioni modello standard nell'intervallo di concentrazione desiderato nel tampone in esecuzione.Quindi, iniettare 250 microlitri di queste soluzioni standard in sequenza sul sistema in condizioni ottimali. La caratterizzazione superficiale degli elettrodi d'oro viene eseguita mediante microscopia elettronica a scansione. Viene mostrata la nuda superficie dorata.Sono mostrati anche batteriofagi aderenti alla superficie dell'elettrodo in diversi ingrandimenti. Qui è mostrato il legame batteriofago in tempo reale all'elettrodo d'oro stampato attraverso un sensogramma. Una linea di base stabile viene stabilita dopo la rigenerazione e il riequilibrio del sistema prima dell'iniezione del campione.Sull'elettrodo sono presenti cavità specifiche dei fagi. L'iniezione dei batteriofagi che inducono il campione provoca una capacità ridotta, a causa del legame dei batteriofagi bersaglio alle cavità impresse sulla superficie degli elettrodi d'oro. Le curve di calibrazione mostrano la capacità variabile rispetto all'iniezione di proteine nell'iniezione di batteriofagi.Dalle equazioni di questi grafici, è possibile calcolare la concentrazione di batteriofago o proteina in un campione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare un sistema di rilevamento ultrasensibile, veloce e in tempo reale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore e trenta minuti, esclusi i tempi di attesa intermedi.Durante il tentativo di questa procedura, è importante preparare tutti gli agenti freschi, nello stesso giorno. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre metriche come la microscopia a forza atomica, la microscopia elettronica a scansione, l'ellissometro e le misurazioni dell'angolo quantistico per determinare se la polimerizzazione o l'imprinting hanno avuto successo e per rilevare eventuali differenze significative tra le superfici degli elettrodi d'oro nudi e impressi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biochimica, della biotecnologia e della biomedicina per esplorare una rilevazione ultrasensibile di una biomolecola nella sicurezza alimentare e nella diagnosi medica.Non dimenticare che lavorare con monomeri funzionali, reticolanti, iniziatori e altri agenti può essere estremamente pericoloso. Inoltre, durante l'esecuzione di questi esperimenti, è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti, camici da laboratorio ed eseguire gli esperimenti di polimerizzazione all'interno della cappa aspirante.

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Ricerca

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

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