Ultrasensibile rilevazione di biomarcatori utilizzando un Imprinting molecolare basato biosensore capacitivo

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di rilevare e quantificare biomolecole a bassa abbondanza in campioni altamente complessi con elevata sensibilità, semplicità, basso costo, velocità e senza l'uso di alcuna marcatura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biotecnologia, della biochimica e della biomedicina, come il monitoraggio ambientale, la sicurezza alimentare, la qualità dell'acqua potabile e la diagnosi medica. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua intrinseca rapidità, semplicità, alta sensibilità, basso costo, facilità di manipolazione e rilevamento in tempo reale senza l'utilizzo di reagenti di marcatura.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di malattie grazie alla sua capacità di quantificare biomolecole a bassa abbondanza. Ad esempio, diversi biomarcatori in tempo reale. Per pulire i vetrini coprioggetti, immergerli in 10 millilitri di HCl molare 1,0 per 10 minuti in un pulitore ad ultrasuoni a temperatura ambiente.

Quindi, immergerli in acqua deionizzata e idrossido di sodio 1,0 molare nelle stesse condizioni. Asciugare i vetrini coprioggetti con azoto gassoso. Quindi, immergere i vetrini coprioggetti puliti e asciutti in 10 millilitri di una soluzione APTES per un'ora per introdurre gruppi amminici sulla superficie del vetro coprioggetto a temperatura ambiente.

Sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua deionizzata prima di asciugarli nuovamente con azoto gassoso. Immergere i vetrini coprioggetto modificati APTES in una soluzione da 10 millilitri di glutaraldeide per due ore per attivare i gruppi amminici sulla superficie a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini coprioggetti con un tampone fosfato da 10 millimolari per rimuovere l'eccesso di glutaraldeide dalla superficie.

Asciugare i vetrini coprioggetti con azoto gassoso. Successivamente, preparare 1,0 millilitri di soluzione stampo in tampone fosfato da 10 millimolari in una concentrazione di 0,1 milligrammi per millilitro. Far cadere 200 microlitri di questa soluzione modello sui vetrini coprioggetti modificati e incubare a quattro gradi Celsius per una notte.

Per pulire gli elettrodi, immergere prima gli elettrodi in un piccolo becher contenente cinque millilitri di etanolo al 70% per 10 minuti in un pulitore a ultrasuoni a temperatura ambiente. Quindi, immergere in sequenza gli elettrodi in acqua deionizzata, acetone, acqua deionizzata, soluzione acida di piranha e acqua deionizzata nelle stesse condizioni. Asciugare gli elettrodi con azoto gassoso.

Per eseguire l'elettropolimerizzazione della tiramina, preparare otto millilitri di soluzione di tiramina da 10 millimolari in tampone fosfato da 10 millimolari contenente due millilitri di etanolo. Eseguire 15 cicli di scansioni voltammetriche cicliche in questa soluzione utilizzando un potenziostato che copre un intervallo di potenziale da zero a 1,5 volt e una velocità di scansione di 50 millivolt al secondo. Quindi, sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata prima di asciugare gli elettrodi con azoto gassoso.

Immergere gli elettrodi in una soluzione contenente 30 millimolari di acriloil cloruro e 30 millimolari di trimetilammina in toluene a temperatura ambiente per una notte prima di risciacquare e asciugare nuovamente gli elettrodi. Prima della polimerizzazione, preparare una soluzione di monimero contenente monomeri e reticolante in 820 microlitri di acqua ultrapura. Quindi, preparare il 5% di volume a volume di TEMED in acqua ultrapura.

Aggiungere 20 microlitri della soluzione TEMED nella soluzione monomerica e spurgare con azoto gassoso per cinque minuti. Quindi, aggiungere 20 microlitri di APS appena preparato nella soluzione monomerica. Pipettare 1,5 microlitri della soluzione monomerica sulla superficie dell'elettrodo d'oro modificato.

Ora, inizia la polimerizzazione portando il timbro modello a contatto con la superficie trattata con monomero e lascialo per cinque ore a temperatura ambiente. Dopo la polimerizzazione, rimuovere con cura il timbro del modello dalla superficie, utilizzando una pinza. Quindi, sciacquare l'elettrodo con acqua deionizzata e asciugarlo con azoto gassoso.

Immergere gli elettrodi in un millilitro di dieci millomeri di un dodecaneteolo preparato in etanolo per venti minuti in modo da coprire i fori di spillo sulla superficie dell'elettrodo. Infine, sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata e asciugare gli elettrodi con azoto gassoso prima di caratterizzarne le superfici con la microscopia elettronica a scansione. Inserire gli elettrodi capacitivi in oro impressi nella cella a flusso elettrochimica integrata in un biosensore capacitivo.

Preparare 100 millilitri di tampone di rigenerazione e un litro di tampone di marcia. Avviare l'analisi con l'iniezione del buffer di rigenerazione per rigenerare il sistema e del buffer in esecuzione per riequilibrare il sistema per 25 minuti. Preparare soluzioni modello standard nell'intervallo di concentrazione desiderato nel tampone in esecuzione.

Quindi, iniettare 250 microlitri di queste soluzioni standard in sequenza sul sistema in condizioni ottimali. La caratterizzazione superficiale degli elettrodi d'oro viene eseguita mediante microscopia elettronica a scansione. Viene mostrata la nuda superficie dorata.

Sono mostrati anche batteriofagi aderenti alla superficie dell'elettrodo in diversi ingrandimenti. Qui è mostrato il legame batteriofago in tempo reale all'elettrodo d'oro stampato attraverso un sensogramma. Una linea di base stabile viene stabilita dopo la rigenerazione e il riequilibrio del sistema prima dell'iniezione del campione.

Sull'elettrodo sono presenti cavità specifiche dei fagi. L'iniezione dei batteriofagi che inducono il campione provoca una capacità ridotta, a causa del legame dei batteriofagi bersaglio alle cavità impresse sulla superficie degli elettrodi d'oro. Le curve di calibrazione mostrano la capacità variabile rispetto all'iniezione di proteine nell'iniezione di batteriofagi.

Dalle equazioni di questi grafici, è possibile calcolare la concentrazione di batteriofago o proteina in un campione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare un sistema di rilevamento ultrasensibile, veloce e in tempo reale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore e trenta minuti, esclusi i tempi di attesa intermedi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante preparare tutti gli agenti freschi, nello stesso giorno. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre metriche come la microscopia a forza atomica, la microscopia elettronica a scansione, l'ellissometro e le misurazioni dell'angolo quantistico per determinare se la polimerizzazione o l'imprinting hanno avuto successo e per rilevare eventuali differenze significative tra le superfici degli elettrodi d'oro nudi e impressi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biochimica, della biotecnologia e della biomedicina per esplorare una rilevazione ultrasensibile di una biomolecola nella sicurezza alimentare e nella diagnosi medica.

Non dimenticare che lavorare con monomeri funzionali, reticolanti, iniziatori e altri agenti può essere estremamente pericoloso. Inoltre, durante l'esecuzione di questi esperimenti, è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti, camici da laboratorio ed eseguire gli esperimenti di polimerizzazione all'interno della cappa aspirante.