Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di espandere le cellule staminali tumorali in vitro utilizzando una tecnica di coltura indipendente di Anchorage e quindi testare gli effetti metabolici di nuove terapie mirate alle cellule staminali tumorali. Ciò si ottiene dissociando prima un campione di tessuto di adenocarcinoma pancreatico umano in una sospensione a singola cellula. Nella seconda fase, il tessuto tumorale viene ulteriormente digerito con enzimi e quindi seminato su una piastra di gelatina Per rimuovere la popolazione cellulare di fibroblasti, le cellule tumorali isolate vengono quindi seminate in una piastra multipozzetto a bassissimo attacco e trattate con il farmaco di interesse per valutare l'attività metabolica e la formazione delle sfere tumorali.

In definitiva, il farmaco di interesse può essere utilizzato in topi immunocompromessi portatori di xenotrapianti derivati da pazienti per convalidare gli effetti del farmaco in vivo. Questo metodo è un potente strumento per studiare la biologia delle cellule staminali tumorali e serve come primo passo per lo sviluppo di nuove terapie mirate alle cellule staminali tumorali. A dimostrare la procedura sarò io, un ricercatore junior presso il Center for Stem Cells in Cancer and Aging presso il Breast Cancer Institute e Tini Cruz, una dottoranda del mio laboratorio per isolare le cellule staminali tumorali da un adenocarcinoma duttale pancreatico in una cabina di biosicurezza sterile.

Utilizzare un bisturi sterile e una pinza per tritare il tumore umano in una piastra di coltura di 60 x 15 millimetri contenente un millilitro di PBS sterile, aggiungendo altri tre o quattro millilitri di PBS se necessario fino a quando il tessuto non è completamente dissociato. Trasferire la sospensione tissutale in una provetta conica sterile e aggiungere PBS fino a un volume finale di cinque millilitri. Quindi omogeneizzare meccanicamente il campione con una centrifuga di dissociazione e digerire il tessuto omogeneizzato con collagenasi a 37 gradi Celsius.

Dopo un'ora di centrifugazione, le celle si riattivano, sospendendo il pellet in 10 millilitri di terreno completo. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 40 micrometri e far girare nuovamente le cellule. Questa volta, sospendendo nuovamente il pellet in cinque millilitri di CK Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, rimuovere il tampone di lisi dei globuli rossi mediante centrifugazione e risospendere il pellet nel mezzo delle cellule staminali tumorali.

Quindi incubare le cellule su un piatto rivestito di gelatina a 37 gradi Celsius per rimuovere la maggior parte delle cellule dei fibroblasti che si attaccano rapidamente. Dopo un'ora, recuperare il surnatante e quantificare il numero di cellule tumorali pancreatiche vitali per facilitare la formazione della sfera tumorale per il cancro. Arricchimento delle cellule staminali Diluire le cellule nel volume appropriato di terreno di coltura delle cellule staminali tumorali a una concentrazione finale di due volte 10 per tre cellule per millilitro e raffreddarle sul ghiaccio per alcuni minuti.

Quindi, dopo aver aggiunto 500 microlitri di PBS alla prima e all'ultima fila di una piastra di 24 celle a bassissimo attacco, risospendere le cellule con la pipetta e seminare un millilitro di cellule per pozzetto nei pozzetti vuoti della piastra. Trattare quattro pozzetti di cellule con il farmaco di interesse e almeno quattro pozzetti di controllo negativo con veicolo. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per una settimana.

A giorni alterni, aggiungi un trattamento fresco al nostro veicolo in ciascuno dei pozzi. Il quinto o il settimo giorno, valutare il numero di sfere tumorali formate con un contatore di cellule automatizzato che consente l'identificazione di strutture più grandi per l'imballaggio in serie delle sfere tumorali. Il settimo giorno, utilizzare un colino cellulare da 40 micrometri per raccogliere le sfere.

Quindi, far girare le sfere e incubarle in un millilitro di tripsina per 20 minuti a 37 gradi Celsius per dissociare il pellet in una sospensione a singola cellula. Quindi espandere le celle per altri sette giorni come appena dimostrato per preparare le sfere per la misurazione delle loro specie reattive dell'ossigeno o della produzione di ROS dopo la dissociazione come appena dimostrato, far girare le sfere e risospendere il pellet in HBSS contenente la sonda appropriata. Dopo un'incubazione di 20 minuti al buio a 37 gradi Celsius, posizionare le cellule sul ghiaccio fino all'analisi mediante citometria a flusso per preparare le sfere per la misurazione del loro consumo di ossigeno.

Per prima cosa, rivestire una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti con adesivo per cellule e tessuti per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, dissociare le sfere e la tripsina come dimostrato. Quindi lavare la piastra due o tre volte con acqua per rimuovere la piastra adesiva in eccesso, le singole celle tre volte da 10 alla quinta cella per pozzetto.

In 150 microlitri di ossigeno, il terreno di prova contenente glucosio e piruvato di sodio fanno aderire le cellule al fondo dei pozzetti mediante centrifugazione fino a raggiungere 100 volte G. Lasciare che la centrifuga si fermi con la rottura. Quindi invertire l'orientamento della piastra e ripetere la rotazione.

Ora incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica. Nel frattempo, caricare le importazioni delle cartucce del test. A, B e C.Iniettare 25 microlitri di una concentrazione di tre, sei e nove millimolari del farmaco di interesse rispettivamente, e importare D a 25 microlitri di una concentrazione di un micromolare dell'inibitore mitocondriale rone.

Quando le celle sono pronte, calibrare la cartuccia e caricare la piastra di coltura cellulare. Infine, eseguire il test con il protocollo standard di miscelazione e misurazione In questi esperimenti rappresentativi, il trattamento delle cellule staminali del cancro del pancreas con metformina ha fortemente ridotto le dimensioni e il numero delle sfere tumorali. Inoltre, queste riduzioni sono state mostrate dalle culture della sfera secondaria e terziaria.

Anche quando solo la coltura della sfera primaria era stata trattata con metformina, la metformina agisce come inibitore mitocondriale. Infatti, in questo esperimento, è stato osservato che il farmaco induce una diminuzione rapida e dose-dipendente del consumo di ossigeno nelle cellule tumorali che è correlata alla sua capacità di indurre la produzione di ROS. È importante sottolineare che i topi trattati con metformina mostrano una riduzione a breve termine ma significativa della progressione dell'adenocarcinoma pancreatico rispetto agli animali di controllo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come dissociare i tumori umani freschi. Isolare le cellule tumorali primarie, configurarle come coltura di formazione di sfere e valutare l'attività metabolica delle cellule staminali del cancro al pancreas.