Name: Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Scopri la coltura senza ancoraggio per espandere cellule staminali tumorali pancreatiche e valutare gli effetti metabolici di terapie mirate. Questo metodo supporta lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche contro il cancro.

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La presente ricerca è stata sostenuta da un ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233.460), settimo programma quadro della Comunità Europea (FP7 / 2007-2013), contratto di sovvenzione n 256974 (EPC-TM-NET) e n 602.783 (CAM-PAC ), la Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 e PI12 / 02643), e il Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spagna). E. Lonardo è stato sostenuto da Roche Fellowship. M. Cioffi è stato sostenuto dal programma di borse predoctoral La Caixa.

Tumori PDAC umani sono stati ottenuti con il consenso informato scritto (Comunidad de Madrid, Spagna (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) Impianto di tumori pancreatici umani in topi immunodeficienti richiede l&#39;approvazione del Comitato Etico, nonché Istituzionale . Animal Care and Use Committee (IACUC) Le procedure di xenotrapianto modelli pancreas di topo tumore devono essere condotte in conformità con i regolamenti istituzionali e nazionali (qui Comitato Etico dell&#39;Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spagna; protocollo PA 34_2012). 1. Media Cultura <ol><li> Preparare terreno completo. <ol><li> Supplemento medium RPMI con 10% FBS, 100 unità / ml di penicillina / streptomicina. Per 500 ml di RPMI aggiungono 55 ml di FBS inattivato al calore e 6 ml di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml, 100x). </li><li> Conservare il mezzo completo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare CSC Media. <ol><li> Supplemento la DMEM / F12 mediu senza sierom con 100 unità / ml di penicillina / streptomicina e 2 glutammina mm. </li><li> Conservare il mezzo CSC a 4 ° C. B27 (01:50) e 20 ng / ml bFGF sono appena aggiunti al mezzo prima di ogni esperimento. NOTA: L&#39;aggiunta di B27 ha dimostrato di aumentare la formazione tumorale sfera e di condurre più passaggi di culture sfera 32. La composizione media è un passo cruciale e deve essere testato per ogni tipo di cellula in coltura. Si consiglia di test di auto-rinnovamento e la capacità di differenziazione delle sfere e analizzare l&#39;espressione di marcatori CSC mediante citometria di flusso (vale a dire, CD133 + e CD44 +). </li></ol></li><li> Preparare extracellulare Flux Assay Medium. <ol><li> Questo mezzo specifico è DMEM basale 5030 contenente vitamine, aminoacidi e altri integratori, ma manca glutammina, glucosio, piruvato e bicarbonato. </li><li> Per il saggio di corrente, integrare il mezzo con glutammina 2 mM, glucosio 8 mm e 2 mM piruvato di sodio ad una completa attività metabolica mitocondriale. NOTA: L&#39;assenza di bicarbonato di sodio è essenziale per misurare con precisione l&#39;acidificazione extracellulare di cellule in crescita in coltura, poiché regolare terreno contenente bicarbonato bufferizzando variazioni di pH durante il dosaggio. Inoltre, l&#39;impiego di un terreno di base permette uno stretto controllo della concentrazione di L-glutammina (come L-alanil-glutammina) glucosio o piruvato di sodio necessario per diverse condizioni e / o applicazioni di analisi. </li></ol></li></ol> 2. Sfera Formazione Assay e analisi NOTA: Tutti i protocolli coltura di tessuti e le manipolazioni devono essere eseguite utilizzando tecniche sterili con grande attenzione usando pulito, privo di detergenti, articoli in vetro sterile. Prima dell&#39;uso, pre-caldo tutto soluzione a medio e a 37 ° C bagnomaria (in alternativa, è possibile utilizzare le soluzioni pre-riscaldato a temperatura media e). Ottenere tumori PDAC umano come precedentemente descritto 21. <ol><li> Isolamento di CSC da PDAC umana (Figura1) <ol><li> In un armadio biosicurezza sterile trasferire il tessuto PDAC umana ad un piatto 60 mm x 15 coltura contenente 1 ml di soluzione sterile 1X tampone fosfato salino (PBS). Tritare il tumore in piccoli pezzi (1-5 mm) con un bisturi sterile e pinze. </li><li> Aggiungere 1 ml di sterile 1X PBS al piatto cultura e ripetere il passo triturazione fino a quando il tessuto è completamente dissociato, regolarmente questo richiede 3-4 turni. Trasferire la sospensione di tessuto (in alto fino ad un volume finale di 5 ml con 1X PBS) in una provetta sterile e omogeneizzare meccanicamente con un dissociatore come gentleMACS. </li><li> Incubare il tessuto omogeneizzato con collagenasi (utilizzare 2,5 mg / ml di collagenasi in 1X PBS) per 60 min a 37 ° C, quindi si centrifuga per 5 min a 900 x g. Decantare il supernatante e risospendere il pellet di cellule in 10 ml di mezzo completo. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro 40 micron e centrifugare per 5 min a 900 x g. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere ilpellet con 5 ml di tampone di lisi dei globuli rossi (ammonio cloruro di potassio, ACK), e incubare la </li><li> Risospendere il pellet in CSCs medio, piastra su un piatto di gelatina rivestita, e incubare a 37 ° C per 1 h. Questo passaggio rimuoverà la maggior parte delle cellule di fibroblasti che fissano rapidamente alla piastra. </li><li> Rimuovere la piastra dall&#39;incubatore e recuperare accuratamente sospensione cellulare e quantificare il numero di (Trypan Blue-negativi) cellule vitali mediante un emocitometro. A tal fine, mescolare delicatamente la sospensione e pipettare 20 ml di sospensione in una provetta Eppendorf. Aggiungere 20 ml (1: 1 ratio) di trypan blu per le cellule in provetta e mescolare bene. Dispensare circa 10 ml di miscela sulla emocitometro. </li><li> Contare tutte le cellule chiare nei quattro quadranti angolo della camera di conteggio per la conta delle cellule vitali. Nota: La vitalità e la resa delle celle può variare notevolmente da campioni tumorali. Per PDAC campioni redditività varia regolarmente between 45-70%, e pezzi di tessuto da un campione tumorale macroscopica con un diametro di 3 - 5 mm dovrebbero cedere a circa 5x10 6 cellule vitali. </li></ol></li><li> Sfera saggio Formazione e metformina Trattamento <ol><li> Prendete il numero di celle e aggiungere il volume appropriato di CSC medio per preparare una concentrazione cellulare di 2.000 cellule / ml. Non tenere la sospensione cellulare in ghiaccio per non più di 1h e mescolati bene prima di placcatura. </li><li> Aggiungere 500 ml di PBS 1X per la prima e l&#39;ultima riga di un 24-pozzetti per l&#39;umidificazione, al fine di ridurre al minimo l&#39;evaporazione media. Seme le cellule in cellule fissaggio ultrabassi piastre ad una densità di 2000 cellule per pozzetto in 1 ml di terreno sfera tumorale (2.000 cellule / ml). NOTA: Il numero di celle utilizzate per le analisi di formazione sfera tumore può variare tra i tipi di tumore. </li><li> Trattare almeno 4 pozzetti con veicolo (controllo negativo) e 4 pozzetti con ogni trattamento assegnato, ad es., 3 mM di metformina. Place le cellule in un incubatore a 37 ° C e fornire le cellule con 5% di CO 2 per una settimana. NOTA: Il mezzo non deve essere modificata in modo da permettere la formazione di sfere indisturbata tumorali, ma può essere ricaricato con fattori di crescita su base giornaliera in quanto non sono stabili nel mezzo di coltura. </li><li> Ogni altro giorno inserirlo trattamento, ad es., 3 mM di metformina o veicolo per ciascuno dei pozzetti. Valutare il numero di sfere tumorali formate dopo 5 e / o 7 giorni con l&#39;uso di un contatore di cellule automatizzato che consente per il conteggio delle strutture più grandi (Figura 2). NOTA: solo sfere tumorali con almeno 40 micron dovrebbe essere considerato e può essere classificato come piccoli (40-80 micron) o grande (80-120 micron), rispettivamente. I risultati possono essere illustrate come la percentuale di sfere tumorali diviso per il numero iniziale di cellule seminate (ad esempio, 2.000 cellule). </li></ol></li><li> Passaggio in serie di Generation sfere tumorali <ol&gt; <li> Dopo 7 giorni di incubazione raccogliere sfere tumorali utilizzando un filtro cella 40 micron e centrifugare per 5 min a 900 xg a RT. </li><li> Dissociare il pellet di sfere tumorali alle singole cellule utilizzando tripsina, e quindi espandere nuovamente la cellula cellule singole sospensione ottenuta per altri 7 giorni, come descritto in precedenza (vedi 2.2). </li></ol></li></ol> 3. Analisi del metabolismo (ROS Produzione e consumo di ossigeno) <ol><li> ROS Produzione <ol><li> In questo protocollo, abbiamo utilizzato carbossi-DCFDA come esempio per misurare la produzione di ROS in quanto è una sonda accessibile, veloce e ampiamente utilizzato per il rilevamento ROS. Tuttavia, ci sono diverse altre sonde e metodologie che possono essere usati per questo dosaggio. </li><li> Trattare sfere tumorali con metformina come descritto al punto 2.2 per la quantità di tempo assegnato. Alla fine del trattamento, sfere tumorali raccolto utilizzando un filtro cella 40 micron, centrifugare le cellule a 900 xg per 5 min e risospendere il pellet in 1 ml di trypsin. Incubare per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Una volta che le cellule sono singolarizzati, centrifugare a 900 xg e risospendere le cellule in HBSS contenenti 2,5 micron carbossi-DCFDA. Incubare le cellule per 20 min a 37 ° C al buio. </li><li> Prima di citometria a flusso analisi proteggere cellule colorate dalla luce come carbossi-DCFDA può essere foto-ossidato dare risultati falsi positivi. Mettere tubi sul ghiaccio fino al momento dell&#39;analisi. NOTA: carbossi-DCFDA è fluorescente dopo reazione con una varietà di ossigeno e di azoto specie reattive, viene rilevato in FL1 (ex 488 nm, 520 nm em..). </li></ol></li><li> Consumo di ossigeno di misura <ol><li> Per questo protocollo, useremo il sistema extracellulare Flux Analyzer da Seahorse Biosciences, come esempio. Coat piastra di coltura cellulare desiderato con una soluzione di 22,4 mg / ml di cellule e tessuto adesivo per 20 minuti a RT. Lavare i pozzetti con acqua 2 - 3 volte prima di seminare le cellule. </li><li> Alla fine del trattamento, sfere tumorali raccolto usando un 4Colino cella 0 micron, centrifugare le cellule a 900 xg per 5 minuti e risospendere il pellet in 1 ml di tripsina. Incubare per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Piatto cellule nella piastra di coltura cellulare singolarizzati ad una densità di 30.000 cellule / pozzetto per una piastra da 96 pozzetti (volume finale: 150 microlitri). Risospendere le cellule in consumo di ossigeno terreno di coltura contenente glucosio 8 mm e 2 mM sodio piruvato. </li><li> Centrifugare le cellule al fondo del pozzo da centrifuga centrifugazione dei pozzetti fino a raggiungere 100 xg e poi lasciare la fermata centrifuga con freno off. Invertire l&#39;orientamento della piastra e ripetere il processo. Trasferire la piastra a 37 ° C incubatore senza aggiunta di CO 2 per 30 min. </li><li> Nel frattempo preparare la cartuccia per il saggio. Ogni bene ha 4 iniettori differenti a carico (25 ml / portuali): <ol><li> Porta A: metformina. Per ottenere una concentrazione finale di 3 mM nel pozzo, preparare una soluzione 8x (24 mM), come il volume finale sarà 175ml dopo l&#39;iniezione di porto A. </li><li> Porta B: metformina. Per aggiungere 3 mM e ottenere una concentrazione finale di 6 mM nel pozzo, preparare una soluzione 9x (27 mM) come volume finale sarà 200 microlitri dopo l&#39;iniezione della porta B. </li><li> Port C: metformina. Per aggiungere 3 mM e ottenere una concentrazione finale di 9 mM nel pozzo, preparare una soluzione 10x (30 mM) come volume finale sarà 225 ul dopo l&#39;iniezione di porto C. </li><li> Port D: rotenone 11 micron, per ottenere 1μM come concentrazione finale nel pozzo (11x). Nota: rotenone inibisce completamente qualsiasi attività mitocondriale residua. </li></ol></li><li> Calibrare la cartuccia e caricare la piastra di coltura cellulare. Eseguire il test con il protocollo standard di miscelazione e di misura. </li><li> Calcolare la percentuale di inibizione della respirazione mitocondriale totale realizzato dalla metformina come percentuale di inibizione ottenuto con rotenone (impostato come 100%). </li></ol></li></ol> 4.Xenotrapianto modello per il cancro del pancreas umano in topi immunocompromessi NOTA: ordinare un numero sufficiente di, modelli femminili atimici nudi o altri più immunocompromessi di topo, come NOD-SCID, SCID-beige, o NSG per gli esperimenti 33. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici prima dell&#39;esperimento e lasciarli raffreddare a RT prima dell&#39;uso. Per i tumori sottocutanei abbiamo usato un minimo di 4 topi per condizioni con un tumore per fianco per un totale di 8 tumori. <ol><li> Xenotrapianto Trapianti <ol><li> Preparare pezzi tumorali da campioni di tessuto di cancro pancreatico umano. Trasferire il tumore in una piastra di Petri e sezionare il tessuto in piccoli pezzi (2 mm di diametro, ~ 8 mm 3) con un bisturi e pinze per tenere il tessuto. Immergere i pezzi ottenuti in soluzione miscela proteica gelatinosa tenuta in ghiaccio. </li><li> Anestetizzare topi utilizzando 1-3% isofluorane o altri anestetici per inalazione o iniettabili. NOTA: Prima di iniziare qualsiasi proc chirurgicaedure, assicurarsi che i topi hanno completamente perso conoscenza, stimolando la pelle del ventre o rimorchia con un paio di pinze scheggia. Applicare una pomata occhio per prevenire la secchezza. </li><li> Una volta che l&#39;anestesia ha avuto effetto, pulire la parte posteriore dei topi con la pelle-etanolo contenente antisettico. Somministrare buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) prima dell&#39;intervento al fine di garantire l&#39;analgesia post-operatoria. </li><li> Sollevare la pelle posteriore con una pinza, fare un 0,7 - lungo 1,0 centimetri incisione con sterili forbici micro e poi senza mezzi termini di preparare una piccola tasca sottocutanea, in cui è inserito un pezzo di tessuto cancro pancreatico derivato dal paziente (~ 8 mm 3). </li><li> Chiudere la ferita con 1-2 punti cutanei. Rimuoverli dopo 7 giorni. Restituire i topi per loro gabbie e tenerli su una piastra elettrica o sotto una lampada riscaldante fino a quando sono ancora in piena attività. </li><li> A seguito di tumore impianto, monitorare i topi, almeno due volte a settimana per la crescita tumorale e segni generali di morbilità derivante, come pelliccia arruffata, hunched postura, e l&#39;immobilità. </li><li> Una volta che i tumori hanno raggiunto una dimensione media di 200 mm 3, i topi sono randomizzati a rispettivi trattamenti. Amministrare veicolo o metformina quotidianamente tramite iniezioni ip (150 mg / kg pc) o attraverso l&#39;acqua potabile (150 mg / kg di peso corporeo) con effetti di un trattamento analogo. </li><li> Monitorare massa tumorale con una pinza e calcolare il volume del tumore una volta alla settimana (misurazione del volume del tumore = 1/2 lunghezza × respiro x larghezza). </li><li> Sacrifica i topi una volta tumori hanno raggiunto 1 cm di diametro o topi iniziano a mostrare segni di dolore o malattia, come sopra specificato. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno alcun interesse a gara per rivelare.

Con la nascita e la successiva validazione del concetto CSC per molti tumori, il campo dello sviluppo di farmaci ha acquisito nuovo slancio, con il potenziale per lo sviluppo di trattamenti contro il cancro più efficaci e, successivamente, la riduzione del rischio di recidiva della malattia. Tuttavia, il campo CSC è ancora in una fase precoce e più deve essere raggiunto in termini di comprensione CSC origine e propagazione, e il loro ruolo nel plasmare l&#39;architettura del tumore e la promozione di metastasi. In questo contesto, l&#39;uso di saggi CSC riproducibili e significativi e l&#39;interpretazione dei dati ottenuti informata rappresenta una componente fondamentale per la nostra comprensione di CSC biologia. Da molti punti di vista biologico, formazione sfera è emerso come un saggio di grande valore; tuttavia gli utenti devono essere consapevoli dei propri limiti al fine di interpretare correttamente i risultati sperimentali. Un aspetto importante da considerare ancor prima della valutazione di sfera di formazione dei dati è l&#39;origine del campione esaminato, dato che i risultati ottenuti da campioni derivati ​​da pazienti freschi potrebbero essere significativamente differenti da quelli ottenuti da linee cellulari di cancro stabiliti. Saggi di formazione sfera Classic comportano semina di cellule ad una densità clonale in piastre bassissimo fissaggio e valutare la formazione sfera in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e / o basico fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-b) arricchito, ma mezzo privo di siero 21, 34. La composizione terreno di coltura è anche un elemento importante da considerare. Nella nostra esperienza abbiamo scoperto che il DMEM / F12 addizionato con B27, bFGF e glutammina in assenza di siero era un mezzo ottimale per crescere, espandersi e mantenere la CSC in condizioni indifferenziate. Abbiamo scoperto che in questa condizione la cultura (medio e sospensione) le cellule esprimono elevate quantità di marcatori di cellule staminali del cancro (tra cui CD133 +, CD44 + e CD24 +) e non esprimono proteine ​​differenziazione-associati (CK-20 E CK-19). Uno dei presupposti fondamentali per queste analisi è che ogni sfera è clonale, cioè, una sfera risulta dalla espansione di una singola cellula staminale. Tuttavia, le sfere sono intrinsecamente strutture dinamiche che tendono a fondere anche a bassa densità di semina 35. Placcatura cellule è un passaggio fondamentale nel protocollo e la densità di una cella / pozzetto può certamente aggirare il problema di aggregazione. Ma anche per i progenitori prospetticamente ordinati, con frequenza si traduce in formazione molto bassa sfera a causa di una bassa attività di formazione sfera intrinseca e può essere attribuita anche alla stimolazione autocrina limitato a causa di effetti di diluizione. Nella nostra esperienza abbiamo osservato che solo il 30% delle cellule placcato sono in grado di formare sfere. Si consiglia di utilizzare almeno 100 cellule / bene fino ad ottenere risultati coerenti e riproducibili. Altri metodi di coltura per la crescita CSC si basano su colture 3D solido o semi-solido (per esempio, sulla base di matrigel, collagene o metilcellulosa). Questi metodi sono stati utilizzati per limitare la mobilità cellulare e successiva aggregazione cellulare 36. Tuttavia, ciascuna di queste matrici reca i propri limiti. Ad esempio, matrigel è una membrana basale solubile isolato dal Engelbreth-Holm-Swan (EHS) del tumore e, anche se l&#39;estratto è simile al complesso ambiente extracellulare del tumore presente in molti tessuti, contiene molteplici fattori di crescita più o meno definite essi rende spesso meccanicistica studi per specifici elementi regolatori molto difficili. Un altro punto di considerazione è che le funzioni delle cellule-sfera formare capacità e staminali non sono termini intercambiabili 34. Mentre alcune cellule staminali e progenitrici hanno dimostrato di esporre fallimento sfera formando capacità 37, per generare sfere in vitro non esclude in vivo funzione staminali / progenitrici. Ad esempio, le cellule staminali quiescenti possono semplicemente non rispondere ai segnali extracellulari forniti dalselezionati in condizioni di coltura in vitro. Così, a lungo termine in vitro e in vivo capacità di auto-rinnovamento delle popolazioni cellulari purificate, preferibilmente durante il passaggio in serie, deve essere valutato al fine di dimostrare o confutare la funzione delle cellule staminali. In questo contesto, la capacità di propagare prospetticamente e contemporaneamente diverse popolazioni di cellule staminali e progenitrici è un aspetto cruciale del saggio sfera formatura e rende questo test di grande valore per il campo CSC; finché le sue limitazioni sono tenuti in mente per l&#39;interpretazione dei dati ottenuti. Saggi-Sphere formando sono stati ampiamente utilizzati per identificare retrospettivamente le cellule staminali in base alla loro capacità di auto-rinnovamento e la differenziazione a livello di singola cellula in vitro. La scoperta di marcatori che permettono il potenziale isolamento delle cellule staminali e la loro progenie dalla loro nicchia in vivo permette le proprietà funzionali delle popolazioni purificate da definire. Le combination di sfera test formazione e il FACS è una strategia di successo per isolare le cellule da tessuto solido o arricchire sottopopolazioni specifiche di PDAC nella cultura. Ad esempio, l&#39;espressione contemporanea di EpCAM, CD24 e CD44 definisce una sottopopolazione di cellule staminali tumorali in grado di: self-renewal, differenziare e avviare un tumore, che riflette l&#39;eterogeneità del tumore originale. Hermann et al. hanno dimostrato che le cellule CD133 + possedevano aumentata capacità proliferativa e CSC dispone di 15. Altri marcatori sono stati utilizzati anche per la caratterizzazione di CSC: ALDH- 1 (deidrogenasi-1) l&#39;espressione è associata con le cellule tumorali altamente nel cancro del pancreas 38; le cellule in grado di escludere il colorante DNA Hoechst 33342, popolazione lato chiamato cellule (SP), hanno la capacità comprovata di avviare i tumori 39. Recentemente abbiamo dimostrato che un vano autofluorescenza subcellulare caratterizza una popolazione distinta di cellule umane con caratteristiche esclusive CSC attraverso diversi tipi di tumore40. Sebbene nessuno di questi marcatori sembra caratterizzare selettivamente una popolazione pura di CSC, combinazioni sempre più complesse di marcatori devono essere utilizzati per FACS purificare popolazioni più raffinati di cellule. Molte domande rimangono ancora circa il ruolo preciso del CSC nell&#39;origine, la progressione e la resistenza ai farmaci di tumori. Ad esempio, un modo per affrontare la questione dell&#39;evoluzione clonale per definire se e come un singolo CSC avvia un tumore, potrebbe essere quello di analizzare campioni di pazienti a diversi stadi della malattia, e specificamente seguire i numeri di CSC durante e dopo il trattamento. Rispondendo a queste domande, possiamo fare significativo progresso della nostra conoscenza di codici CSC nei tumori solidi e sviluppare terapie farmacologiche per prevenire in ultima analisi, la progressione del tumore e la recidiva.

Adenocarcinoma del dotto pancreatico (PDAC) è uno dei tumori solidi più aggressivi. Oggi è il 4 ° più comune di morte per cancro nella società occidentale e si prevede un aumento al 2 ° causa più frequente nel decennio successivo (~ 400.000 morti ogni anno nel mondo) 3 .Al momento della diagnosi il 90% dei pazienti presenta con malattia avanzata, che ha una sopravvivenza a 5 anni inferiore al 5%. Questo tasso di sopravvivenza è purtroppo rimasto invariato negli ultimi 50 anni, nonostante le attività di ricerca sempre più intensivo di 4. Del restante 10% dei pazienti che hanno potenzialmente malattia &#39;curabile&#39; attraverso la resezione chirurgica, l&#39;80% morirà di recidiva entro 5 anni. Per molti anni lo standard di cura per la malattia avanzata è stato monoterapia gemcitabina, ma questo conferisce solo un marginale vantaggio di sopravvivenza a 5. Piccoli miglioramenti nella sopravvivenza a breve termine sono stati raggiunti con l&#39;aggiuntadi erlotinib 6 o 7 capecitabina, ma il beneficio di sopravvivenza è dell&#39;ordine di settimane con la sopravvivenza globale mediana ancora ~ 6 mesi. Recentemente, risultati più incoraggianti sono emersi per gemcitabina / nab -paclitaxel 8 e la combinazione FOLFIRINOX regime 9,10. Queste terapie migliorano la sopravvivenza mediana da un modesto 2 e 4 mesi, rispettivamente, ma sono altamente tossici e sopravvissuti a lungo termine sono ancora una rara eccezione. Anche se il trattamento offre il potenziale di miglioramento, questi sono regimi tossici a cui molti pazienti non rispondono o mostrare solo miglioramento incrementale della sopravvivenza globale. Di conseguenza, vi è un urgente bisogno di integrare le attuali terapie e di sviluppare nuovi approcci terapeutici multimodali più probabili. Tumore Eterogeneità Sta diventando sempre più evidente che l&#39;eterogeneità cancro non è solo limitato a distinto evolutiva sottocloni within ogni tumore 11, ma anche guidato da fenotipica e funzionale eterogeneità e plasticità all&#39;interno di ogni subclone 12. Le cosiddette cellule staminali tumorali (CSCs) o cellule tumorali promozione sono responsabili per l&#39;eterogeneità intraclonale 13-16. In particolare, CSC rappresentano un sottogruppo di cellule del cancro, per il quale noi ed altri hanno dimostrato in modo inconfutabile, fino alla singola cellula, che rappresentano la radice della malattia, dando origine a tutti progenie differenziati all&#39;interno di ogni subclone cancro 17. Ancora più importante, queste cellule sono essenziali per il comportamento metastatico e rappresentano anche una fonte importante per la ricaduta della malattia dopo il trattamento, anche con farmaci relativamente efficaci in grado di indurre una regressione del tumore iniziale (ad esempio, -paclitaxel nab) 15,18-20. E &#39;importante notare che CSC non rappresentano necessariamente in buona fede le cellule staminali, né essi provengono da cellule staminali dei tessuti in molti casi, ma piuttosto hanno acquired alcune caratteristiche delle cellule staminali. La maggior parte di questi sono funzionalmente definiti, ad esempio CSCs sono dotati indefinita capacità di auto-rinnovamento che li rende resistenti alla chemioterapia convenzionale, e mostrano un aumento invasività che promuove l&#39;attività metastatica. Funzionali Cancro staminali fenotipi cellulari Il fenotipo funzionale di CSC si basa sulla loro capacità di auto-rinnovarsi, che può essere testato in vitro utilizzando rispettivamente formazione sfera di serie e saggi di formazione delle colonie. Ancora più importante, CSC in grado di auto-rinnovamento orso in tumorigenicity vivo che possono essere testati limitando la diluizione in vivo come la lettura finale funzionale, preferibilmente durante il trapianto di serie indicativa di esclusiva tumorigenicity a lungo termine. Inoltre, vi è eterogeneità all&#39;interno del vano CSC, con una sottopopolazione distinta di CSC recanti la capacità esclusiva di dare luogo a metastasi che non è solo undiretta conseguenza del loro esclusivo tumorigenicità vivo. Infatti, CSC metastastitic acquisiscono la capacità di eludere il tumore primario, sopravvivere anoikis ed eventualmente traslocare e sementi siti secondari. Queste abilità funzionali avanzati possono essere testati in vitro utilizzando saggi di invasione modificati e in vivo con saggi di metastasi. Targeting cellule tumorali staminali Noi e altri abbiamo fornito prove convincenti che i trattamenti concentrandosi sul tumore grosso delle cellule PDAC differenziate, anche in combinazione con agenti-stroma di mira, non hanno un impatto importante sulla progressione del tumore e l&#39;esito successivo a meno che combinato con una strategia di CSC-targeting 21, 22. Pertanto, sulla base delle funzioni fondamentali del CSC in progressione della malattia e resistenza alla terapia, queste cellule devono indicare un componente essenziale per qualsiasi approccio nuovo trattamento 18,20, ma richiederà una comprensione più approfondita of il meccanismo di regolamentazione di CSC. Anche se CSC e le loro progenie più differenziati portano identici stati fondamentali genetici rispetto ad alterazioni genetiche, CSC presentano l&#39;espressione genica distinto e quindi epigeneticamente determinato profili che i moduli di condivisione con le cellule staminali pluripotenti. La maggior parte dei geni coinvolti nella generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) non solo sia stata legata al cancro, ma la loro espressione è per lo più limitato al comparto CSC. Inoltre, la rilevanza funzionale di CSC da perdita di funzione esperimenti usando strumenti genetici per il targeting CSC sono ora fermamente stabilito il concetto di CSC per diversi tipi di cancro 23-25. Mentre la maggior parte di questi approcci sono basati su modelli di mouse e quindi non sono facilmente trasferibili in clinica, essi forniscono proof-of-concept per la potenziale rilevanza clinica di colpire CSCs in combinazione con le cellule tumorali di massa. Studiare le cellule tumorali staminali in vitro per identificare tallone d&#39;Achille &#39; Al fine di identificare modi nuovi e clinicamente applicabile per il targeting CSC, le loro caratteristiche sono regolarmente studiati in vitro e formazione sfera è ampiamente usato in questo contesto. Originariamente sviluppato per lo studio della biologia delle cellule staminali normali, tra cui auto-rinnovamento e la capacità di differenziazione, questo test è stato successivamente adattato per studiare CSC in vitro ed è stato utilizzato per indagare CSC isolati da PDAC 20. Abbiamo scoperto che le sfere tumorali formata da cellule umane primarie PDAC portano tutte le caratteristiche distinte di CSC, indicando quindi che contengono bona fide pancreas CSC 21. Così, il saggio sfera tumore rappresenta un potente strumento per schermo per terapie più efficaci in vitro, ma i risultati devono essere ulteriormente valutata in più severi in vivo. In effetti, i dati generati con questo test in vitro, devono essere trattati con grande cautela, come the test può essere soggetta a errori significativi. Protocolli altamente standardizzati, tra cui il conteggio automatico delle sfere formati, dovrebbero essere stabiliti per assicurare dati riproducibili e predittiva. In questo contesto, abbiamo recentemente usato questo test per lo screening CSC pancreatiche derivate da un insieme diversificato di PDACs umani primari e ha mostrato che queste cellule sono molto vulnerabili a riprogrammazione metabolica antidiabetico metformina composto. In precedenza, la metformina era stato dimostrato di inibire il cancro espansione delle cellule attraverso l&#39;attivazione indiretta della chinasi AMP-activated protein (AMPK) segnalazione e la successiva inibizione di mTOR 26, con conseguente riduzione della sintesi proteica e la proliferazione cellulare 27. In aggiunta a questi effetti sulla popolazione tumorale massa, noi e altri hanno trovato che la metformina è in grado di indirizzare e effettivamente eliminare la sottopopolazione CSCs in un certo numero di tumori solidi come il seno, cancro esofageo, glioblastoma e carcinoma pancreatico 28-31 &lt;/ Sup&gt;. Così, la metformina rappresenta una nuova strategia terapeutica promettente e sicuro per diversi tipi di cancro con necessità mediche attualmente insoddisfatta. Inoltre, utilizzando la formazione sfera come un modo per arricchire di CSC, abbiamo dimostrato che gli effetti primari di metformina sulla CSC pancreas era indipendente di attivazione AMPK e per lo più affidamento sulla sua tossicità mitocondriale modesto (attraverso l&#39;inibizione del complesso I), che a quanto pare è stato letale per il sottoinsieme di CSC solo. Per questi ultimi siamo stati in grado di valutare il loro consumo di ossigeno e mitocondriale di ROS produzione cellulare come indicatori di tossicità del farmaco a livello cellulare. Successivamente, tali dati in vitro possono essere convalidati in modelli preclinici di topo e in effetti provocato prolungato significativamente la sopravvivenza 31. La metodologia qui presentata permette la rapida generazione di profili di sensibilità di droga per CSC, compresi gli studi sui loro effetti sul metabolismo CSC. Forniamo ora esteso dettagli sperimentali sul com utilizzatocomplementare in vitro e in vivo procedure.

<table><tbody><tr><td>Camera di conteggio/emocitometro&nbsp;</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>CASY Contatore e analizzatore di cellule per la misurazione della proliferazione e della vitalità</td><td>Roche Innovatis</td><td>AG CASY Modello TTC 45,60,150 &mu; m</td><td></td></tr><tr><td>Dissociatore GentleMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tubi GentleMACS C&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di fissaggio ultra-basse a 24 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale da 100 mm&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico in polipropilene da 15 ml&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico in polipropilene da 50 ml&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Provette sterili da 1,5 ml&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri sterili, piastre da 10 cm&nbsp;</td><td>Ferri Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>26 G&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>100 ul Siringa Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton Siringa Co</td><td>81075</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo IV&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina/streptomicina, 100X&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Metformina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D150959-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina, 200 mM, 100X&nbsp;</td><td>Tecnologie di vita</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>100mM Soluzione di piruvato di sodio&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di prova per cavallucci marini&nbsp;</td><td>Cavalluccio marino Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Cell-TAK Adesivo per cellule e tessuti&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina, 0,05%&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27 50x&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita di base dei fibroblasti&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium/F12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1x Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Blu</td><td>Tecnologie di vita</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Carbossi-DCFDA(5-(e-6)-Carbossi-2',7'-DiclorofluoresceinaDiacetato)&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>C-369</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 70% (vol/vol)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>IsoVet, Braun</td><td>571105.8</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35620</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore sterile con punta in cotone</td><td>&nbsp; Puritan medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF96e FluxPak con piastre cellulari, calibrante e cartucce</td><td>Cavalluccio Marino Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>XF96e Analizzatore di flusso extracellulare</td><td>Cavalluccio Marino Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore con ingresso CO2&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro forbici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve Pinze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>per schegge</td></tr><tr><td>Calibro</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Adenocarcinoma del dotto pancreatico (PDAC) contiene un sottoinsieme di cellule staminali del cancro esclusivamente tumorali (CSC), che hanno dimostrato di guidare l&#39;iniziazione del tumore, metastasi e la resistenza a radio e chemioterapia. Qui si descrive una metodologia specifica per la coltura CSC pancreatici umani primari come sfere tumorali in condizioni di ancoraggio-indipendente. Le cellule sono coltivate in condizioni non aderenti senza siero al fine di arricchire di CSC, mentre i loro progenie più differenziati non sopravvivono e proliferano durante la fase iniziale seguente semina di singole cellule. Questo test può essere utilizzato per stimare la percentuale di CSCs presenti in una popolazione di cellule tumorali. Entrambi dimensioni (che può variare 35-250 micrometri) e numero di sfere tumorali formate rappresenta l&#39;attività CSC nutrito sia in popolazioni di massa di cellule tumorali in coltura o appena raccolte e digeriti tumori 1,2. Usando questo test, abbiamo recentemente scoperto che la metformina ablates selettivamente pancreatic CSC; una scoperta che è stata successivamente ulteriormente confermata dimostrando espressione diminuita di geni marcatori di superficie / pluripotenza associata e ridotta in tumorigenicità vivo di cellule trattate con metformina. Come passo finale per lo sviluppo preclinico abbiamo trattato topi portatori di tumori consolidati con metformina e trovato prolungato significativamente la sopravvivenza. Studi clinici di prova l&#39;uso di metformina in pazienti con PDAC sono attualmente in corso (ad esempio, NCT01210911, NCT01167738 e NCT01488552). Meccanicisticamente, abbiamo scoperto che la metformina induce una crisi energetica fatale in CSCs migliorando specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) e la riduzione mitocondriale potenziale transmembrana. Al contrario, i non-CSC non sono stati eliminati dal trattamento con metformina, ma piuttosto sono stati sottoposti reversibile arresto del ciclo cellulare. Pertanto, il nostro studio serve come esempio di successo per il potenziale di formazione sfera in vitro come strumento di screening per identificare composti che potenzialmente bersaglio CSCs, ma questa tecnica richiede ulteriormente in vitro e in vivo convalida per eliminare i falsi scoperte.

La metformina colpisce selettivamente CSC pancreatici In primo luogo abbiamo esaminato gli effetti funzionali del trattamento con metformina sulla capacità in vitro di auto-rinnovamento delle cellule staminali tumorali. A questo scopo, abbiamo condotto test di formazione della sfera utilizzando cellule pancreatiche umane primarie tumorali isolate da tessuti PDAC asportati durante l&#39;intervento chirurgico. Abbiamo osservato che la metformina è diminuito fortemente la dimensione delle sfere formate (Figura 1A). Questo era probabilmente inibendo l&#39;espansione della progenie di CSC, che rappresentano ancora il grosso cellule trovate in sfere come sono arricchiti solo i CSC. Infatti, le sfere più lunghe sono coltivate senza passaging più ampia l&#39;espansione della progenie più differenziati sarà. Così abbiamo trovato metformina diminuire significativamente il numero di sfere effettivamente formate indipendentemente dalle loro dimensioni, che si verificano in modo dose-dipendente suggerendo una forte inibizione della capacità di auto-rinnovamento di CSC (dati non riportati). Abbiamo trovato che la metformina a 3 mM diminuito significativamente il numero di sfere formata (Figura 1B). Per studiare più rigorosamente gli effetti a lungo termine della metformina sulla capacità di auto-rinnovamento di CSC, abbiamo seguito diversi passaggi delle sfere primarie formate in sfere secondarie e terziarie. Anche se solo sfere primarie sono stati trattati con metformina, la formazione di sfere nel secondo e terzo passaggio è stato drasticamente e sempre più ridotto, implicando trattamento metformina aveva infatti eliminato irreversibilmente la maggioranza delle CSC (Figura 1C). Così, i nostri dati hanno mostrato gli effetti del trattamento significativi per metformina sulla capacità di auto-rinnovamento delle CSC pancreatici primari e quindi ci ha incoraggiato a effettuare ulteriori meccanicistica così come studi in vivo. Metformina Inibisce mitocondriale consumo di ossigeno e induce ROS produzione Dal metformin ha dimostrato di agire come un veleno mitocondriale parzialmente inibendo l&#39;attività del complesso, abbiamo poi esaminato gli effetti acuti della metformina sul consumo di ossigeno cellulare in cellule derivate sfera. A questo scopo, abbiamo selezionato cellule derivate da due tumori primari rappresentativi PDAC e misurato il consumo di ossigeno nel tempo dopo l&#39;iniezione sequenziale di metformina 3 mM (tre iniezioni) e 1 mM rotenone (un&#39;iniezione). Come mostrato in Figura 2A, iniezione metformina ha indotto una diminuzione rapida e dose-dipendente nel consumo di ossigeno, che varia considerevole tra i diversi tumori. Abbiamo calcolato dell&#39;attività mitocondriale residua dopo trattamento metformina iniettando rotenone, un potente inibitore della complesso I, che è in grado di inibire completamente il consumo di ossigeno mitocondriale. Sensibilità a metformina in termini di consumo di ossigeno mitocondriale correlata con la sua capacità di indurre la produzione di ROS definito come spostamento della media della popomento dopo il trattamento con metformina (Figura 2B, pannello di sinistra), che può essere facilmente quantificato (Figura 2B, pannello di destra). Come previsto, le cellule primarie che sono stati più sensibili alla inibizione del consumo di ossigeno anche mostrato il più forte aumento della produzione di ROS in seguito al trattamento con metformina. Così, questi esperimenti metabolici in vitro dimostrano che gli obiettivi di metformina CSC inibendo la loro dipendenza funzione mitocondriale, con un conseguente ulteriore aumento della produzione di ROS mitocondriale e infine induzione di apoptosi. Metformina Bancarelle PDAC Progression In Vivo Abbiamo finalmente studiato gli effetti di metformina in vivo di xenotrapianto di tessuti derivati ​​da diversi pazienti con PDAC. Abbiamo osservato una riduzione significativa nella progressione tumorale nei topi trattati con metformina rispetto al gruppo di controllo, ma i tumori mai completamente disappeared (Figura 3). Successivamente, durante il follow-up tutti i tumori a lungo termine, alla fine ricaduto suggerendo resistenza metformina delle cellule sopravvissute la prima fase di trattamento. Tuttavia, il trattamento con metformina, anche se applicato come agente singolo, significativamente esteso la sopravvivenza in tutti i topi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> Figura 1. La metformina colpisce selettivamente la CSC. (A) La metformina è diminuita la dimensione delle sfere. Immagini rappresentative di sfere ottenuti dopo il trattamento con le dosi indicate di metformina per 7 giorni (pannello di destra). Quantificazione di dimensioni sfera (n≥6) (pannello di sinistra), i numeri indicati in ascisse rappresentano singolo tumore. (B) formazione di capacità Sphere in presenza o assenza di metformina per 7 giorni (n≥6), i numeri indicati in ascisseasse rappresentano singolo tumore. (C) il grafico rappresentante CSC capacità di auto-rinnovamento in ambiti secondari e terziari delle cellule tumorali pancreatiche primarie. Le sfere sono stati trattati solo durante la formazione sfera di prima generazione, per un totale di 7 giorni (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> Figura 2. La metformina Trattamento Inibisce consumo di ossigeno e induce ROS produzione. (A) Metformina Inoltre inibisce il consumo di ossigeno (OCR) di cellule sfera di derivazione. Due diversi ambiti secondari PDAC sono stati trattati con metformina e modifiche OCR sono stati misurati mediante analisi di flusso extracellulare. Iniezione Rotenone è stato utilizzato come controllo per il consumo totale mitocondriale OCR.Asse X rappresenta il tasso di consumo di ossigeno in pmol di ossigeno / hr normalizzata dal contenuto proteico in ogni pozzetto. sfere (B) PDAC usato in A sono stati trattati per 8 ore con metformina e produzione di ROS è stata valutata mediante citometria di flusso utilizzando carbossi-DCFDA. A sinistra, il flusso rappresentante citometria trame. A destra, sintesi dei dati provenienti da tre esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> Figura 3. La metformina Bancarelle PDAC Progression In Vivo. Due diversi tessuti xenotrapianto PDAC sono stati impiantati in topi immunocompromessi e il trattamento è stato assegnato dopo take tumore iniziale è stato verificato. I topi sono stati trattati con metformina (Met) aggiunti all&#39;acqua potabile (150 mg / kg corpo weight; sulla base di 5 ml di consumo di acqua al giorno). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Le cellule staminali del cancro del pancreas (CSC) possono essere espanse in vitro utilizzando la tecnica di coltura della sfera indipendente dall'ancoraggio, che rappresenta un potente strumento per studiare la biologia delle CSC e può servire come primo passo per sviluppare nuove terapie mirate alle CSC. Qui viene fornita la metodologia per l'espansione, l'analisi e il targeting delle CSC pancreatiche.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

L'obiettivo generale della seguente procedura è espandere le cellule staminali tumorali in vitro mediante una tecnica di coltura indipendente dall'ancoraggio e successivamente valutare gli effetti metabolici di nuove terapie mirate alle cellule staminali tumorali. Questo viene ottenuto dapprima dissociando un campione di tessuto di adenocarcinoma pancreatico umano in una sospensione monocellulare. Nel secondo passaggio, il tessuto tumorale viene ulteriormente digerito con enzimi e quindi seminato su una piastra di gelatina. Per rimuovere la popolazione di cellule fibroblastiche, le cellule tumorali isolate vengono quindi seminate in una piastra multipozzetto con attaccamento estremamente basso e trattate con il farmaco di interesse per valutare l'attività metabolica e la formazione di sferoidi tumorali.Infine, il farmaco di interesse può essere utilizzato in topi immunodepressi portatori di xenotrapieni derivati da pazienti per validare gli effetti del farmaco in vivo. Questo metodo rappresenta uno strumento potente per lo studio della biologia delle cellule staminali tumorali e costituisce un primo passo per lo sviluppo di nuove terapie mirate alle cellule staminali tumorali. A dimostrare la procedura sarò io stessa, un'investigatrice junior presso il Center for Stem Cells in Cancer and Aging presso l'Istituto del Cancro al Seno, e Tini Cruz, una studentessa di dottorato del mio laboratorio, per isolare cellule staminali tumorali da un adenocarcinoma duttale pancreatico all'interno di un cabinet a sicurezza biologica sterile.Usare un bisturi sterile e pinze per tritare il tumore umano in una piastra di coltura da 60 per 15 millimetri contenente un millilitro di PBS sterile, aggiungendo altri tre o quattro millilitri di PBS secondo necessità fino a quando il tessuto non è completamente dissociato. Trasferire la sospensione tissutale in un tubo conico sterile e aggiungere PBS fino a un volume finale di cinque millilitri. Successivamente, omogeneizzare meccanicamente il campione con una centrifuga per dissociazione e digerire il tessuto omogeneizzato con collaghenasi a 37 gradi Celsius.Dopo un'ora di centrifuga, risospendere le cellule, risospendendo il pellet in 10 millilitri di mezzo completo. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un setaccio da 40 micrometri e centrifugare nuovamente le cellule. Questa volta, risospendere il pellet in cinque millilitri di CK. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, rimuovere il tampone di lisi dei globuli rossi mediante centrifugazione e risospendere il pellet in mezzo per cellule staminali tumorali.Quindi incubare le cellule in una piastra rivestita con gelatina a 37 gradi Celsius per rimuovere la maggior parte delle cellule fibroblastiche che si attaccano rapidamente. Dopo un'ora, recuperare il sopranatante e quantificare il numero di cellule vitali di cancro del pancreas per facilitare la formazione di sfere tumorali nel cancro. Per l'arricchimento delle cellule staminali, diluire le cellule nel volume appropriato di mezzo per cellule staminali tumorali fino a una concentrazione finale di due volte 10 alla tre cellule per millilitro e raffreddarle sul ghiaccio per alcuni minuti.Successivamente, dopo aver aggiunto 500 microlitri di PBS alle prime e ultime file di una piastra cellulare da 24 ultra low attachment, risospendere le cellule mediante pipetta e seminare un millilitro di cellule per pozzetto nei pozzetti vuoti della piastra. Trattare quattro pozzetti di cellule con il farmaco di interesse e almeno quattro pozzetti di controllo negativo con il veicolo. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per una settimana.Ogni due giorni, aggiungere un trattamento fresco al veicolo in ciascun pozzetto. Al giorno cinque o sette, valutare il numero di sfere tumorali formate mediante un contatore cellulare automatico che consente l'identificazione di strutture più grandi per il confezionamento seriale delle sfere tumorali. Al giorno sette, utilizzare un filtro cellulare da 40 micrometri per raccogliere le sfere.Successivamente, centrifugare le sferoidi e incubarle in un millilitro di tripsina per 20 minuti a 37 gradi Celsius per dissociare il pellet in una sospensione monocellulare. Quindi espandere le cellule per altri sette giorni come appena illustrato per preparare le sferoidi alla misurazione della produzione di specie reattive dell'ossigeno o ROS. Dopo la dissociazione come appena dimostrato, centrifugare nuovamente le sferoidi e risospendere il pellet in HBSS contenente la sonda appropriata. Dopo un'incubazione di 20 minuti al buio a 37 gradi Celsius, porre le cellule sul ghiaccio fino all'analisi mediante citometria a flusso per preparare le sferoidi alla misurazione del consumo di ossigeno.Prima rivestire una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti con un adesivo per cellule e tessuti per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, dissociare le sfere con tripsina come illustrato. Poi lavare la piastra due o tre volte con acqua per rimuovere l'adesivo in eccesso; seminare le cellule singole a tre volte 10 alla quinta cellule per pozzetto.In 150 microlitri di mezzo per il saggio del consumo di ossigeno contenente glucosio e piruvato di sodio, aderire le cellule al fondo delle pozzette mediante centrifugazione fino al raggiungimento di 100 × g. Fermare la centrifuga senza freno. Successivamente, invertire l'orientamento della piastra e ripetere la centrifugazione.Ora incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica. Nel frattempo, caricare le importazioni della cartuccia del saggio: A, B e C. Iniettare 25 microlitri di una concentrazione di tre, sei e nove millimolari rispettivamente del farmaco di interesse e importare D con 25 microlitri di una concentrazione di un micromolare dell'inibitore mitocondriale rone.Quando le cellule sono pronte, calibrare la cartuccia e caricare la piastra per coltura cellulare. Infine, eseguire il saggio seguendo il protocollo standard di mescolamento e misurazione. In questi esperimenti rappresentativi, il trattamento delle cellule staminali del cancro del pancreas con metformina ha fortemente ridotto le dimensioni e il numero delle sferoidi tumorali. Inoltre, queste riduzioni sono state osservate anche nelle colture secondarie e terziarie di sferoidi.Anche quando solo la coltura della sfera primaria era stata trattata con metformina, si è riportato che la metformina agisce come inibitore mitocondriale. In effetti, in questo esperimento, il farmaco ha indotto una rapida riduzione dipendente dalla dose nel consumo di ossigeno nelle cellule tumorali, che si correla con la sua capacità di indurre la produzione di ROS. In modo importante, i topi trattati con metformina mostrano una riduzione a breve termine ma significativa della progressione dell'adenocarcinoma pancreatico rispetto agli animali di controllo.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come dissociare tumori umani freschi, isolare cellule tumorali primarie, allestire una coltura per la formazione di sfere e valutare l'attività metabolica delle cellule staminali del cancro del pancreas.

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