Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di separare i diversi tipi di cellule presenti nei testicoli. Innanzitutto, raccogli una popolazione mista di cellule dal topo. I testicoli caricano le cellule e il gradiente BSA nell'apparato di fissaggio.

Ora lasciare che le cellule sedimentino attraverso il gradiente BSA. Quindi raccogli le frazioni e combinale in base alla composizione cellulare. In definitiva, la sedimentazione a velocità con lo stay put viene utilizzata per separare diversi tipi di cellule dai testicoli in base alle differenze di dimensioni e densità.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i fatti, è che si possono isolare grandi quantità di diversi tipi di cellule con una purezza abbastanza elevata utilizzando semplice vetreria e gravità. Fissare le bombole da due litri e la camera di carico delle celle alla piattaforma superiore e collegare il tutto con due piccoli pezzi di tubo con morsetti per tubi. Chiudere tutti i tubi e sigillare il beccuccio sul cilindro da due litri più a destra.

Posizionare una piccola ancoretta nella camera di carico della cella e un'ancoretta più grande nel cilindro da due litri più a sinistra. Posizionare quindi la camera di sedimentazione da due litri sulla piattaforma. Posizionare il deflettore metallico direttamente sopra l'apertura nella parte inferiore della camera di sedimentazione per evitare la vorticizzazione del liquido e l'interruzione del gradiente cellulare durante la raccolta delle frazioni.

Ora metti il coperchio sulla camera di sedimentazione. Applicare una piccolissima quantità di grasso per vuoto sul giunto in vetro smerigliato del rubinetto di arresto a tre vie. Quindi bloccare il rubinetto di arresto sul fondo della camera di sedimentazione, collegando i giunti in vetro smerigliato del rubinetto di arresto e della camera di sedimentazione.

Quindi, collegare la camera di carico della cella all'uscita destra del rubinetto di arresto con il tubo. Chiudere il rubinetto di arresto, quindi collegare il tubo di frazionamento delle celle all'uscita sinistra del rubinetto di arresto e bloccare il tubicino nella parte inferiore. Versare la soluzione al 2% di BSA nel cilindro sinistro da due litri.

Versare la soluzione al 4% di BSA nel cilindro destro da due litri. Assicurarsi che non vi siano bolle di grandi dimensioni nel tubo che collega questi cilindri. Versare il tampone Krebs nella camera di carico della cella e riempire il tubo che collega questa camera con la camera di sedimentazione.

Verificare che non vi siano bolle di grandi dimensioni che potrebbero disturbare la sfumatura. Se necessario, premere o muovere delicatamente il tubo per rimuovere le bolle. Verificare che tutti i crebs siano nella provetta e non nella camera cellulare.

Far fluire una piccola quantità di tampone Krebs nella camera di sedimentazione. Quindi scaricare quasi tutto il tampone nel tubo di frazionamento cellulare. Per riempire il tubo ed eliminare eventuali bolle di grandi dimensioni, posizionare il collettore di frazioni direttamente sotto la camera di sedimentazione.

Controllare che tutte le provette di frazione siano in posizione e coprire con pellicola trasparente per evitare contaminazioni. Deincapsulare i testicoli in una piastra separata contenente otto millilitri di Krebs. Praticare un'incisione nella sottile membrana che circonda i tubuli seminiferi con un paio di pinze.

Tenete ora la membrana con un altro paio di pinze. Spingere i tubuli fuori e lontano dalla membrana. Trasferire quattro millilitri di Krebs contenenti i tubuli in ciascuna provetta conica contenente 25 millilitri di soluzione di collagenasi.

Agitare a 33 gradi Celsius per 10 minuti fino a quando i tubuli non assumono un aspetto simile a quello di uno spaghetto. Quindi, lasciare che i tubuli si depositino per cinque minuti sul fondo del tubo. Versare il surnatante e lavare due volte con 25 millilitri di Krebs a temperatura ambiente, lasciando che i tubuli si depositino ogni volta sul fondo del tubo.

Lasciare circa cinque millilitri di Krebs in ogni tubo. Dopo aver incubato i tubuli con tripsina. Utilizzare una pipetta a foro largo per agitare la soluzione contenente i tubuli.

Pipettandoli dentro e fuori circa 10 volte. La soluzione dovrebbe iniziare ad assomigliare più a una sospensione a cella singola. Filtrare ora ogni sospensione di una singola cellula da 30 millilitri attraverso un filtro a maglie da 100 micron.

Dopo aver combinato le sospensioni cellulari, contare il numero totale di cellule. Assicurarsi che il rubinetto di arresto sia posizionato in modo da dirigere il flusso dalla camera cellulare alla camera di sedimentazione. Ruotare entrambe le piastre della barra di agitazione su un'impostazione bassa.

Quindi versare la sospensione cellulare nella camera cellulare. Aprire il rubinetto di arresto per far fluire lentamente le celle nella camera di sedimentazione a una velocità di 10 millilitri al minuto. Quindi chiudere il rubinetto di arresto per lavare le celle fuori dalla camera della cella.

Versare cinque millilitri di soluzione BSA allo 0,5% e scolarli nella camera di sedimentazione a una velocità di 10 millilitri al minuto. Chiudere il rubinetto e ripetere il lavaggio BSA altre quattro volte. Ora apri le pinze tra la camera della cella e i due cilindri da due litri per drenare immediatamente il liquido nella camera di sedimentazione a una velocità di 40 millilitri al minuto, regola la portata in modo che ci vogliano circa 20-30 minuti per caricare il gradiente BSA nella camera di sedimentazione.

Monitora la presenza di un sottile strato indisturbato di cellule che si trovano sopra il gradiente BSA. Una volta caricata la maggior parte del BSA, chiudere il rubinetto di arresto e ruotarlo nella posizione che consentirà al liquido di defluire dalla camera di sedimentazione nel tubo di frazionamento. Ora spegni le piastre di agitazione e lascia sedimentare le cellule per un'ora e 45 minuti.

Al termine della sedimentazione, collegare il tubo della frazione al collettore della frazione. Regolare la portata con il rubinetto di arresto in modo da raccogliere 10 millilitri per provetta di raccolta ogni 45 secondi. Una volta raccolte tutte le frazioni, analizza al microscopio le frazioni per diverse popolazioni cellulari.

È possibile distinguere diversi tipi di cellule in base alle dimensioni delle cellule e alla morfologia nucleare per determinare la purezza di ciascuna frazione. Trasferire 10 microlitri di cellule colorate con DPI su un vetrino. Posizionare un vetrino coprioggetto e analizzare con un microscopio a fluorescenza.

Estrai le frazioni che sono simili per dimensioni e morfologia nucleare per creare popolazioni di cellule. Una preparazione tipica di circa 22 testicoli. Con questa procedura di permanenza si ottengono circa 10-8 cellule.

Le frazioni di tipo cellulare metagenico Perper possono essere analizzate rapidamente utilizzando una combinazione di microscopia ottica e fluorescente. Le cellule miotiche, spermatogonie e diploidi somatiche sono le cellule più grandi che si trovano nei testicoli e contengono nuclei di grandi dimensioni che si colorano in modo relativamente omogeneo con il dpi. Gli spermatidi rotondi sono cellule più piccole con nuclei rotondi più piccoli, generalmente con un centro cromografico che si condensa in modo brillante Gli spermatidi allungati sono piccole cellule che hanno nuclei a forma di falce.

Una volta che le frazioni cellulari sono combinate, la purezza può essere ulteriormente determinata dall'analisi del sangue occidentale dei lisati cellulari. I marcatori comuni delle cellule miotiche sono le proteine del Synap Neal Complex. I marcatori comuni della condensazione degli spermatidi sono le proteine di transizione o la protamina.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore se viene eseguita correttamente dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della spermatogenesi per esplorare i processi cellulari in diversi tipi di cellule dai testicoli.