Name: Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-09T21:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Impara la separazione delle cellule spermatogenetiche usando il metodo STA-PUT per sedimentazione a velocità. Questa tecnica consente di isolare popolazioni cellulari dai testicoli del topo con elevata purezza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH GM055360 per SLB e U54HD068157 di RGM. JMB è stata sostenuta dal T32 Genetica formazione di Grant presso l&#39;Università della Pennsylvania (GM008216).

Il protocollo STA-PUT prevede tre fasi: 1) Messa a punto di apparecchi e reagenti, 2) Preparazione della sospensione di cellule dai testicoli intere, e 3) il carico delle cellule, la sedimentazione, e la raccolta di frazioni. Quando è eseguita da un team di due ricercatori, il protocollo vogliono otto ore in media. 1. Impostazione del Apparatus STA-PUT (Figura 1) *** Apparecchi STA-PUT deve essere posto in un 4 ° C grande frigorifero o una cella che può ospitare anche un raccoglitore di frazioni, se si preferisce che metodo di raccolta. <ol><li> La sera prima (o almeno un paio d&#39;ore prima) di eseguire il metodo, lavare tutte le attrezzature (in particolare il vetro e tubi) e sterilizzare con il 70% di etanolo. Lasciare apparecchiatura asciutto completamente prima di assemblare l&#39;apparecchiatura come illustrato in Figura 1. </li><li> Fissare i due cilindri 2 L (Figure 1B e C) e la camera di carico cella ( <strong&gt; Figura 1A) alla piattaforma superiore e collegare il tutto con due piccoli pezzi di tubo con fascette stringi tubo. Bloccare tutte le provette chiuse. Sigillare il beccuccio sulla L cilindro più a destra 2. </li><li> Mettere una piccola ancoretta nella camera di caricamento cella (Figura 1A) e una ancoretta maggiore nel 2 L cilindro più a sinistra (Figura 1B) che conterrà il BSA 2%. </li><li> Posizionare la camera di sedimentazione 2 L sulla piattaforma (Figura 1D). Posizionare il deflettore metallico (Figura 1F) direttamente sopra l&#39;apertura nella parte inferiore della camera di sedimentazione (Figura 1D). Questo è fondamentale, come il deflettore evita vortex del liquido e la rottura del gradiente cella durante la raccolta delle frazioni. Mettere il coperchio sulla parte superiore della camera di sedimentazione. </li><li> Dopo l&#39;applicazione di una piccola quantità di grasso per vuoto a giunto smerigliato del rubinetto a tre vie (figura 1G), fissare il rubinetto sul fondo della SECamera dimentation, collegando i giunti a smeriglio del rubinetto e la camera di sedimentazione. </li><li> Collegare la camera a cella di carico (Figura 1A) a destra all&#39;uscita del rubinetto con la tubazione. Chiudere il rubinetto. </li><li> Collegare il tubo frazionamento cellulare alla presa sinistra del rubinetto. Il tubo frazionamento comprende un pezzo di tubo con una pipetta Pasteur di vetro collegato all&#39;estremità aperta. Un pezzo di tubo di diametro inferiore è attaccato alla estremità più stretta della pipetta di vetro. La pipetta stretta limita il flusso della sospensione cellulare durante frazione raccolta. Bloccare questo piccolo tubo nella parte inferiore. </li><li> Preparare 2 L Krebs (1x) tamponare il giorno dell&#39;esperimento (Tabella 1). Poi, preparare 550 ml 2% BSA in 1x Krebs, 550 ml 4% BSA in 1x Krebs, e 50 ml 0,5% BSA in 1x Krebs. Filtrare e raffreddare queste soluzioni a 4 ° C. </li><li> Versare la soluzione BSA 4% nel cilindro L right 2 (Figura 1C) e il 2% BSAsoluzione in sinistra 2 L cilindro (Figura 1B). Assicurarsi che non ci sono grandi bolle nel tubo che collega questi cilindri. </li><li> Versare tampone Krebs nella camera di caricamento delle cellule e riempire il tubo che collega questa camera con la camera di sedimentazione, assicurandosi che non ci siano grandi bolle, in quanto questi potrebbero disturbare il gradiente. Spremitura o sfogliando il tubo aiuta delicatamente per rimuovere le bolle. Assicurarsi che tutto il tampone Krebs è nel tubo e non nella camera di cella. </li><li> Lasciare una piccola quantità di tampone Krebs di fluire nella camera di sedimentazione e poi drenare quasi tutto il tampone nel tubo frazionamento cellulare per riempire il tubo e rimuovere eventuali bolle grandi. </li><li> Collocare il raccoglitore di frazioni direttamente sotto la camera di sedimentazione. Assicurarsi che tutti i tubi frazione sono a posto e coperti con pellicola trasparente per evitare la contaminazione. </li></ol> 2. Isolare le cellule della spermatogenesi da Testicoli interi <ol&gt; <li> Sezionare testicoli da circa 12 topi adulti (preferibilmente almeno otto settimane) e posto in tampone Krebs a ​​temperatura ambiente per lavare via tutto il materiale contaminante. Questo protocollo essendo dimostrato prevede l&#39;utilizzo di topi di laboratorio ed è stato eseguito in conformità con le linee guida della University of Pennsylvania Institutional Animal Care ed uso comitato. </li><li> Aggiungere 45 mg di collagenasi a 50 ml di soluzione tampone Krebs in un tubo conico a destra prima che si intende aggiungere i tubuli seminiferi. Lasciare questa soluzione per riscaldare fino a 33 ° C per pochi minuti. Diviso equamente in due provette da 50 ml coniche. </li><li> Decapsulate i testicoli in un piatto a parte contenente 8 ml di soluzione tampone Krebs, scartando la tunica albuginea e rilasciando i tubuli seminiferi. La tunica albuginea è la sottile membrana che circonda i tubuli seminiferi. I tubuli dovrebbero facilmente staccarsi dalla tunica albuginea. Per fare questo, fare un&#39;incisione nella tunica albuginea, tenere questa membrana con un pair di pinze, e spingere i tubuli fuori e lontano dalla membrana con un altro paio di pinze. </li><li> Aggiungere 4 ml di tampone Krebs contenente i tubuli in ogni provetta conica contenente 25 ml di soluzione di collagenasi e incubare, agitazione, a 33 ° C per 10 min. Alla fine, i tubuli dovrebbero avere un aspetto &quot;gli spaghetti-like&quot;. </li><li> Lasciare i tubuli di accontentarsi di ~ 5 minuti al fondo della provetta. Versare il surnatante e lavare 2x in 25 ml di tampone Krebs (a temperatura ambiente), permettendo tubuli di depositarsi sul fondo della provetta ogni volta. Lascia ~ 5 ml di soluzione tampone Krebs in ciascun tubo. </li><li> Mentre il lavaggio, aggiungere 30 mg di tripsina a 50 ml di soluzione tampone Krebs in un tubo falcon destra prima che si intende aggiungere i tubuli seminiferi. Lasciare questa soluzione per riscaldare fino a 33 ° C per pochi minuti. Diviso equamente in due provette da 50 ml coniche. </li><li> Aggiungere 25 ml di soluzione di tripsina per ciascuna delle due provette contenenti i tubuli. Aggiungere 3 g DNAsi (1 μg/10ml) a ciascun tubo per impedire cellas di aggregazione. Incubare, agitazione, a 33 ° C per 10 min. </li><li> Utilizzare una vasta pipetta foro per agitare la soluzione contenente i tubuli, li pipettaggio in e out di circa 10x. La soluzione dovrebbe cominciare a guardare più come una sospensione singola cella. </li><li> Incubare, agitazione, a 33 ° C per altri 10 min. Utilizzare una vasta pipetta foro per disperdere i tubuli in una sospensione singola cella, li pipettaggio in e out di circa 25x. Se si vede ancora un sacco di tubuli o grumi di cellule, disperdere più con la pipetta e / o aggiungere un altro 3 mg DNAse ad ogni provetta (doppia concentrazione iniziale). </li><li> Filtrare la sospensione singola cellula attraverso un colino cellula maglia 100 micron (una per ciascun tubo di sospensione cellulare 30 ml). Combinare le sospensioni cellulari e contare il numero totale di cellule (dovrebbe essere tra 7-8 x 10 8 cellule). *** NON caricare più di 800 milioni le cellule sul gradiente. </li><li> Sulla base del conteggio delle cellule ottenuto nella fase 2.10, pellet il appropril volume iate di cellule filtrate a 450 rcf per 5 minuti e lavare con 30 ml di tampone Krebs. Ripeti. *** Di solito 22 testicoli produrranno più di 800.000.000 di cellule, ma non caricare più di questo numero di celle. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule in 25 ml 0,5% BSA contenente tra 2,5 e 5 mg DNAsi (a seconda del grado di aggregazione delle cellule) senza creare bolle. Assicurarsi che le cellule non si aggregano. Filtrare la sospensione singola cella attraverso un colino cella di rete 100 micron. Le cellule sono ora pronti a caricare. Mescolare bene prima di caricare invertendo il tubo di un paio di volte. </li></ol> 3. Cella di carico e sedimentazione <ol><li> Assicurarsi che il rubinetto è chiuso, ma nella posizione che permetterà liquido di fluire dalla camera di cella (Figura 1A) nella camera di sedimentazione (Figura 1D). </li><li> Girare entrambe le piastre ancoretta a un livello basso (circa 70 giri) per consentire le barre stir di muoversi continuamente, ma lentamente. </li><li> Versare la sospensione cellulare nella camera di cella (Figura 1A) e aprire il rubinetto in modo che le cellule fluire lentamente nella camera di sedimentazione ad una velocità di 10 ml / min (Figura 1D). Chiudere il rubinetto. Portata può essere determinata marcatura intervalli volume sulla camera di sedimentazione. </li><li> Versare 5 ml di soluzione di BSA 0,5% nella camera di cella e di scarico nella camera di sedimentazione ad una velocità di 10 ml / min. Chiudere il rubinetto. Questo passaggio lavare le cellule dalla camera di cella. Ripetere 4x. </li><li> Preparare il gradiente: Aprire i ganci tra la camera a cella (Figura 1A) e le due cilindri 2 L (Figura 1B e C), e cominciare a drenare il liquido nella camera di sedimentazione ad una velocità di 40 ml / min (Figura 1D) immediatamente. Regolare la portata in modo che richiede circa 20-30 min per caricare il gradiente BSA nella camera di sedimentazione. Un sottile strato di cellule indisturbato situata sulla cima delBSA gradiente dovrebbe essere visibile. Una volta caricata la maggior parte della BSA, chiudere il rubinetto e girarlo nella posizione che vi permetterà di drenare il liquido dalla camera di sedimentazione nel tubo di frazionamento. </li><li> Spegnere le piastre mescolare. </li><li> Permettono alle cellule di sedimentare per un&#39;ora e 45 minuti. NON DISTURBARE &#39;APPARECCHIO durante questo tempo. Qualsiasi agitazione meccanica potrebbe disturbare il gradiente. </li></ol> 4. Frazionamento e analisi delle frazioni *** Come si eseguono le seguenti operazioni, fare attenzione a non disturbare il gradiente. Se il gradiente BSA è disturbato, la procedura non funzionerà! <ol><li> Una volta che le cellule si sedimentano, drenare lentamente 50 ml dalla camera di sedimentazione in una provetta da 50 ml e mettere da parte. Questa frazione di solito contiene grumi indesiderati di cellule e detriti. </li><li> Collegare il tubo frazione al collettore di frazioni. *** E &#39;anche possibile raccogliere frazioni da parte se un colle frazionector non è disponibile. </li><li> Raccogliere frazioni: Regolare il flusso con il rubinetto in modo che 10 ml (riempimento un tubo di raccolta) sono raccolti ogni 45 sec. </li><li> Tappare i tubi di raccolta frazione e girare per 5 minuti a 450 rcf a 4 ° C. Versare il surnatante delicatamente, risospendere le cellule in un liquido rimanente e mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Una volta che tutte le frazioni vengono raccolte, microscopicamente analizzare le frazioni di diverse popolazioni cellulari. Diversi tipi di cellule possono essere distinti in base alle dimensioni e la morfologia cellulare nucleare 8,15. Figura 2 illustra &quot;risultati rappresentativi&quot; per le tre frazioni raccolte che si arricchiscono per celle (a) e somatiche meiotiche e spermatogoni, (b) spermatidi rotondi, e (c) allungamento e condensazione spermatidi. <ul><li> Tipo A spermatogoni sono 12-14μm ca. di diametro e hanno nuclei rotondi che sono omogenea composizione cromatina. </li><li> Tipo B spermatogoni sono 8-9μm ca. di diametro e hanno ROUNd nuclei che mostrano più denso eterocromatina lungo la periferia nucleare. </li><li> Spermatociti Pre-leptotene sono 7.5-8.2μm ca. di diametro, hanno meno citoplasma di tipo B spermatogoni, e hanno nuclei che sembrano simili a quelle di tipo B spermatogoni. </li><li> Spermatociti primari leptotene sono 8-10 micron ca. di diametro e hanno nuclei che sono simili a quelli di spermatociti pre-leptotene, ma sembrano avere più denso cromatina a livello della membrana nucleare. </li><li> Zigotene spermatociti primari sono 10-12 micron ca. di diametro e hanno nuclei che sono simili a quelli di spermatociti primari leptotene. </li><li> Spermatociti pachitene sono ovunque 12-18 micron ca. di diametro e sono costituiti da un sottile bordo di citoplasma che circonda un nucleo di grandi dimensioni. Altre macchie di denso cromatina può essere visto nel nucleo. </li><li> Spermatidi rotondi sono 10 micron ca. di diametro e hanno un nucleo rotondo con chromocenter densamente colorazione nel mezzo. </li><li> Residuocorpi sono ~ 6.5 micron di diametro, sono rotondi, e mancano di un nucleo. </li><li> Allungamento e condensazione spermatidi sono simili per dimensioni a arrotondare spermatidi, ma hanno un unico nucleo a forma di falce. </li></ul><ol><li> Inizia con frazione di 15, e analizzare ogni cinque frazioni fino a 85. Di solito, le frazioni inferiori a 15 saranno troppo misto e disomogeneo, e le frazioni superiori a 85 conterranno pochi a nessun cellule utilizzabili. </li><li> Per analizzare una frazione, prendere 5UL di liquido dal tubo di raccolta delle frazioni (volta che le cellule sono state risospese dopo centrifugazione) e aggiungere 5UL dell&#39;8% formaldeide in tampone Krebs. Lasciare le cellule fissate a riposare a temperatura ambiente per cinque minuti. </li><li> Aggiungere 5UL del 0,1% Triton e DAPI (5 μ / ml tampone Krebs) alle cellule fisse. Permettono alle cellule di riposare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Trasferire 10 microlitri della soluzione risultante su un vetrino, coprire con un vetrino coprioggetto e analizzare con un microscopio a fluorescenza per determinare la purezza di ciascuna frazione. </li><li> Unire le frazioni che sono simili per dimensioni e morfologia nucleare (vedi &quot;Rappresentante dei risultati&quot;) per creare le seguenti popolazioni di cellule: cellule diploidi meiotiche e somatiche, spermatidi rotondi e condensazione / allungamento spermatidi. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Funct.+Dev.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Mammalian Spermatogenesis.</a> Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).</li>
<li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).</li>
<li>Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+in+vitro+culture+to+in+vivo+models+to+study+testis+development+and+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis.</a> Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).</li>
<li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146, 519-532 (2011).</li>
<li>Easley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+haploid+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells.</a> Cell Rep. 2, 440-446 (2012).</li>
<li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Miller, R. G., Phillips, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).</li>
<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+enrichment+of+undifferentiated+GFR+alpha+1%2B+spermatogonia+from+immature+rat+testis+by+magnetic+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting.</a> Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).</li>
<li>Bellve, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).</li>
<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+mammalian+meiosis%3A+regulation%2C+dynamics+and+impact+on+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).</li>
<li>Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li>
<li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li>
<li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro%2C+short-term+culture+method+for+mammalian+haploid+round+spermatids+amenable+for+molecular+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation.</a> Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Questo protocollo essendo dimostrato prevede l&#39;utilizzo di topi di laboratorio ed è stata eseguita in conformità a tutte le linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Animali utilizzati in questo protocollo sono mantenuti sotto la guida e l&#39;approvazione della University of Pennsylvania Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (protocollo IACUC # 804284).

Coloro che studiano la spermatogenesi si basano su modelli animali per i campioni di cellule spermatogenesi, come un sistema di coltura cellulare affidabile non esiste ancora per generare tutti i tipi cellulari spermatogeniche 3. Anche se le cellule spermatogenesi sono prontamente raccolti dai testicoli intere, solo una popolazione mista risultati. Questo pone un problema per coloro che desiderano studiare specifici sottotipi di queste cellule, come le cellule meiotiche, spermatidi rotondi e spermatidi conden...

Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli 1. In breve, staminali come gli spermatogoni che risiedono vicino l&#39;epitelio del tubulo seminifero divide e differenziarsi in spermatociti, che poi subiscono le divisioni meiotica. Dopo meiosi è completa, le cellule aploidi risultante o spermatidi rotondi, subiscono spermiogenesi, un processo di differenziazione che coinvolge lo spargimento del citoplasma e compattazione del nucleo. Spermatidi gradualmente sviluppano un flagello e subiscono l&#39;allungamento e la condensazione del nucleo, producendo allungamento e poi a condensazione spermatidi, rispettivamente. I prodotti finali sono spermatozoi, che vengono rilasciati nel lume del tubulo seminifero e infine nella epididimo dove maturano ulteriormente. Poiché il processo di spermatogenesi basa su condizioni ormonali e molecolari specialitesticoli, un sistema affidabile coltura in vitro per l&#39;intero processo di spermatogenesi non è ancora stato sviluppato 2,3. Metodi di coltura sono stati sviluppati per la creazione di &quot;cellule germinali primordiali come cellule&quot; e, &quot;le cellule spermatidi-come rotonde&quot; aploidi da cellule staminali, ma questi metodi non sono ancora in grado di generare un gran numero di queste cellule e non riescono a produrre più tardi cellule spermatogenesi Tipi 4,5. Fortunatamente, i tipi cellulari spermatogenici differenze significative delle dimensioni, che consente una cella singola sospensione ottenuta da testicoli interi da separare con un gradiente liquido. Il metodo STA-PUT, ha dimostrato qui, usa un gradiente BSA lineare e semplice sedimentazione per separare le cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e massa 6-9. Il metodo STA-PUT ha diversi vantaggi rispetto agli altri due metodi più utilizzati per separare i tipi di cellule spermatogenesi: FACS e elutriazione 10-13. L&#39;apparato STA-PUT richiede only diversi pezzi di cristalleria specializzati riuniti in una stanza fredda o grande frigorifero. Pertanto, è meno costoso rispetto all&#39;utilizzo di un cell sorter o un elutriator. Il metodo STA-PUT produce una maggiore quantità di cellule per tipo di cellula e testicolo che possono essere ordinati per FACS in un arco di tempo comparabile, sebbene la purezza di ciascuna popolazione cellulare non è così elevata come quelli ottenuti con FACS 11. Cell sorting utilizzando biglie magnetiche (magnetico cell sorting attivato, MACS) è stato recentemente impiegato con successo per l&#39;arricchimento di spermatogoni da una popolazione di cellule testicolari mista, ma è attualmente inadatto per separare spermatociti e spermatidi a causa della mancanza di conoscenza della superficie adeguatamente i marcatori 14. Un ulteriore vantaggio del metodo STA-PUT su FACS o MACS è la capacità di isolare cellule vitali adatto a cultura successiva perché, contrariamente alla maggior parte dei protocolli FACS, non richiede alcun DNA o altri tipi di colorazione. Per gli studi che richiedono lrendimenti arge di spermatogenesi tipi di cellule al ~ 90% di purezza, la STA-PUT è un metodo ideale.

<table><tbody><tr>È possibile utilizzare <td>BSA</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10857 100MG</td><td>Alternate.</td></tr><tr><td>Soluzioni BSA allo 0,5%, 2% e 4%</td><td>Sciogliere 0,25 g, 11 g e 22 g (rispettivamente) in volumi totali di 50 ml, 550 ml e 550 ml di 1x KREBS (rispettivamente).</td><td>Da rendere il giorno della procedura STA-PUT. Filtro sterilizzare.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (10x)</td><td>3,26 g KH2PO4 + 139,5 g NaCl +5,89 g MgSO4/7H20 + 40 g Destrosio + 3,78 g CaCl2/2H20 + 7,12 g KCl, portare a 2 L con ddH20</td><td>Autoclave/filtro e conservare a 4 gradi C per diversi mesi.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (1x)</td><td>Sciogliere 4,24 g di NaHCO3 in 100 ml ddH20. Aggiungere 200 ml di 10x KREBS. Portare a 2 L con ddH20.</td><td>Da rendere il giorno della procedura STA-PUT. Filtro sterilizzare.</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Sigma</td><td>C9891-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DNEP-5MG</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T9201-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Preferenza del ricercatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Preferenza del ricercatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide (~37%)</td><td>Preferenza del ricercatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TABELLA 2: ATTREZZATURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Attrezzature Azienda</td><td>Catalogo #</td><td>Commenti</td></tr><tr><td>Apparecchio completo STA-PUT</td><td>ProScience Glass Shop</td><td>STA-PUT (questa procedura utilizza la camera di sedimentazione standard: Cat. N. 56700-500)</td><td>Include tutta la vetreria e l'attrezzatura per l'apparecchio. È disponibile vetreria alternativa per eseguire STA-PUT con numeri di celle più piccoli.</td></tr><tr><td>10 &mu; filtro a rete m</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td> </td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione per topi</td><td>Preferenza del ricercatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette da 14 ml per la raccolta delle frazioni a fondo tondo con tappi</td><td>Preferenza del ricercatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sono necessarie circa 100 provette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collettore di frazioni</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Modello: Frac-920, Codice prodotto: 18-1177-40</td><td>È possibile utilizzare l'alternativa.</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio, vetro di copertura</td><td>Preferenza del ricercatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico/fluorescente</td><td>Preferenza del ricercatore</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

separazione di tipi di cellule della spermatogenesi usando sta-put velocità di sedimentazione

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli. Attualmente, non esiste un sistema di coltura cellulare affidabile consentendo differenziazione spermatogenesi in vitro, e la maggior parte degli studi biologici di cellule spermatogenesi richiedono raccolta dei tessuti da modelli animali come il topo e nel ratto. Poiché il testicolo contiene numerosi tipi di cellule - sia non spermatogenesi (Leydig, Sertoli, mieloidi e cellule epiteliali) e spermatogenesi (spermatogoni, spermatociti, spermatidi rotondi, a condensazione spermatidi e spermatozoi) - Studi dei meccanismi biologici coinvolti nella spermatogenesi richiedono l&#39;isolamento e arricchimento di questi tipi di cellule differenti. Il metodo STA-PUT consente la separazione di una popolazione eterogenea di cellule - in questo caso, dai testicoli - attraverso un gradiente lineare BSA. Tipi di cellule individuali sedimentano con velocità di sedimentazione diversa a seconda cedimensioni ll, e le frazioni arricchito da diversi tipi di cellule possono essere raccolti e utilizzati in ulteriori analisi. Mentre il metodo STA-PUT non comporta frazioni altamente puri di tipi di cellule, ad esempio come possono essere ottenuti con determinati metodi di separazione delle cellule, esso fornisce un rendimento molto più elevato di cellule totali in ogni frazione (~ 1 x 10 8 cellule / tipo di cellula spermatogenesi da una popolazione iniziale di 7-8 x 10 8 cellule). Questo metodo alto rendimento richiede solo vetreria specializzata e può essere eseguita in qualsiasi ambiente freddo o grande frigorifero, che lo rende un metodo ideale per i laboratori che hanno accesso limitato alle attrezzature specializzate come una fluorescenza attivato cell sorter (FACS) o elutriator.

Il risultato ideale dalla procedura STA-PUT è abbastanza evidente separazione di cellule dai testicoli in base alle dimensioni e la densità delle cellule. Mentre le cellule isolate da testicoli sono sedimenta attraverso il gradiente BSA, si possono osservare diverse bande distinte di cellule. Eventuali grumi di cellule tendono a depositarsi sul fondo del gradiente e non contaminare le altre frazioni. Un po &#39;più in alto il gradiente sarà il grande somatiche e le cellule meiotico. Più in alto il gradiente sarà ancora ...

Il metodo STA-PUT consente la separazione delle diverse popolazioni di cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e densità.

Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

L'obiettivo generale di questa procedura è separare i diversi tipi di cellule presenti nei testicoli. In primo luogo, isolare una popolazione mista di cellule dal topo. Caricare quindi le cellule e il gradiente di BSA nell'apparato stay put.Ora lasciare sedimentare le cellule attraverso il gradiente di BSA. Successivamente raccogliere le frazioni e combinarle in base alla composizione cellulare. In definitiva, la sedimentazione a velocità costante con il metodo "stay put" viene utilizzata per separare i diversi tipi di cellule dai testicoli in base alle differenze di dimensioni e densità.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come facts è che è possibile isolare grandi quantità di diversi tipi cellulari con una purezza piuttosto elevata utilizzando semplice vetreria e la forza di gravità. Fissare i due cilindri da due litri e la camera di carico delle cellule alla piattaforma superiore e collegarli tutti con due piccoli pezzi di tubo dotati di morsetti. Chiudere con morsetti tutti i tubi e sigillare il beccuccio del cilindro da due litri più a destra.Posizionare un piccolo agitatore magnetico nella camera di caricamento della cella e un agitatore magnetico più grande nel cilindro da due litri più a sinistra. Quindi posizionare la camera di sedimentazione da due litri sulla piattaforma. Posizionare la piastra metallica direttamente sopra l'apertura nella parte inferiore della camera di sedimentazione per evitare la formazione di vortici nel liquido e la perturbazione del gradiente cellulare durante la raccolta delle frazioni.Ora mettere il coperchio sulla camera di sedimentazione. Applicare una piccola quantità di grasso da vuoto al giunto smerigliato del rubinetto a tre vie. Quindi fissare il rubinetto alla base della camera di sedimentazione, collegando i giunti smerigliati del rubinetto e della camera di sedimentazione.Successivamente, collegare la camera di caricamento delle cellule all'uscita destra del rubinetto a tre vie mediante un tubo. Chiudere il rubinetto a tre vie, quindi collegare il tubo per la frazionamento cellulare all'uscita sinistra del rubinetto a tre vie e stringere il morsetto sul tubicino in fondo. Versare la soluzione di BSA al 2% nel cilindro sinistro da due litri.Versare la soluzione di BSA al 4% nel cilindro destro da due litri. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria di grandi dimensioni nei tubi che collegano questi cilindri. Versare il buffer di Krebs nella camera di carico della cellula e riempire i tubi che collegano questa camera con la camera di sedimentazione.Verificare che non ci siano bolle di grandi dimensioni che potrebbero disturbare il gradiente. Se necessario, premere delicatamente o dare dei colpetti al tubo per rimuovere le bolle. Confermare che tutto il crebs sia all'interno del tubo e non nella camera cellulare.Lasciare scorrere una piccola quantità di tampone di Krebs nella camera di sedimentazione. Quindi drenare quasi tutto il tampone nel tubo di frazionamento cellulare. Per riempire il tubo ed eliminare eventuali bolle di grandi dimensioni, posizionare il raccoglitore di frazioni direttamente sotto la camera di sedimentazione.Verificare che tutti i tubi per le frazioni siano al loro posto e coprirli con pellicola di plastica per prevenire contaminazioni. Decapsulare i testicoli in una piastra separata contenente otto millilitri di Krebs. Praticare un'incisione nella membrana sottile che circonda i tubuli seminiferi utilizzando una coppia di pinzette.Tenere ora la membrana con un'altra coppia di pinze. Spingere i tubuli fuori dalla membrana e lontano da essa. Trasferire quattro millilitri di Krebs contenenti i tubuli in ciascun tubo conico contenente 25 millilitri di soluzione di collagenasi.Agitare a 33 gradi Celsius per 10 minuti, fino a quando i tubuli assumono un aspetto simile agli spaghetti. Successivamente, lasciare sedimentare i tubuli per cinque minuti sul fondo del tubo. Versare il soprannatante e lavare due volte con 25 millilitri di Krebs a temperatura ambiente, permettendo ogni volta ai tubuli di sedimentare sul fondo del tubo.Lasciare circa cinque millilitri di Krebs in ogni provetta. Dopo l'incubazione dei tubuli con tripsina, utilizzare una pipetta a grande apertura per agitare la soluzione contenente i tubuli.Pipettarli dentro e fuori circa 10 volte. La soluzione dovrebbe iniziare ad apparire più simile a una sospensione di singole cellule. Filtrare ora ciascuna sospensione di singole cellule da 30 millilitri attraverso un filtro cellulare con maglia da 100 micron.Dopo aver combinato le sospensioni cellulari, contare il numero totale di cellule. Assicurarsi che il rubinetto sia posizionato in modo da indirizzare il flusso dalla camera cellulare alla camera di sedimentazione. Accendere entrambe le piastre con agitatore magnetico a una velocità bassa.Quindi versare la sospensione cellulare nella camera delle cellule. Aprire il rubinetto per far scorrere lentamente le cellule nella camera di sedimentazione a un flusso di 10 millilitri al minuto. Chiudere quindi il rubinetto per lavare le cellule dalla camera delle cellule.Versare cinque millilitri di soluzione di BSA allo 0,5% e far defluire nella camera di sedimentazione a una velocità di 10 millilitri al minuto. Chiudere il rubinetto e ripetere il risciacquo con BSA altre quattro volte. Aprire ora le pinze tra la camera cellulare e i due cilindri da due litri per far defluire immediatamente il liquido nella camera di sedimentazione a una velocità di 40 millilitri al minuto; regolare la portata in modo che ci vogliano circa da 20 a 30 minuti per caricare il gradiente di BSA nella camera di sedimentazione.Monitorare uno strato sottile di cellule non disturbate posizionato sulla parte superiore del gradiente di BSA. Una volta che la maggior parte del BSA è stata caricata, chiudere il rubinetto e ruotarlo nella posizione che permette al liquido di defluire dalla camera di sedimentazione nel tubo di frazionamento. A questo punto spegnere le piastre agitatori e lasciare sedimentare le cellule per un'ora e 45 minuti.Al termine della sedimentazione, collegare il tubo della frazione al collettore di frazioni. Regolare la velocità di flusso con il rubinetto in modo che ogni 45 secondi vengano raccolti 10 millilitri per ogni tubo di raccolta. Una volta raccolte tutte le frazioni, analizzarle al microscopio per identificare le diverse popolazioni cellulari.È possibile distinguere diversi tipi cellulari in base alle dimensioni cellulari e alla morfologia nucleare per determinare la purezza di ciascuna frazione. Trasferire 10 microlitri di cellule colorate con DPI su un vetrino. Posizionare un coprioggetto e analizzare al microscopio a fluorescenza.Separare le frazioni che presentano dimensioni e morfologia nucleare simili al fine di ottenere popolazioni cellulari. Una preparazione tipica comprende circa 22 testicoli. Con questa procedura "stay put", si ottengono circa 10 alla ottava cellule.Le frazioni di tipi cellulari metagenici di Perper possono essere analizzate rapidamente utilizzando una combinazione di microscopia ottica e microscopia fluorescente. Le cellule miotiche, le spermatogoni e le cellule somatiche diploidi sono le cellule più grandi presenti nei testicoli e contengono nuclei di grandi dimensioni che si colorano in modo relativamente omogeneo con dpi. Gli spermatidi rotondi sono cellule più piccole con nuclei rotondi più piccoli, generalmente con un cromocentro intensamente colorato; gli spermatidi in condensazione allungante sono cellule piccole con nuclei a forma di falce.Dopo aver combinato le frazioni cellulari, la purezza può essere ulteriormente determinata mediante analisi western blot dei lisati cellulari. I marcatori comuni delle cellule mitotiche sono le proteine del Complesso Sinaptinemico Uno. I marcatori comuni degli spermatidi in condensazione sono le proteine di transizione o la protamina.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore se realizzata correttamente dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della spermatogenesi per esplorare i processi cellulari in diversi tipi cellulari provenienti dai testicoli.

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un metodo efficace per ottenere altamente purificato frazioni praticabile meiotica da mouse testicolo è descritto, che unisce un raffinato cellulare dissociazione protocollo con fluorescenti separazione delle cellule attivate (FACS). Questo metodo sfrutta le differenze nel contenuto di DNA nucleare e la densità di discreta frazioni meiotico.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

Questo video dimostra la procedura di isolamento delle cellule di Sertoli dai tubuli seminiferi di topo, un componente dei testicoli. La digestione enzimatica e i lavaggi ripetuti favoriscono il rilascio di cellule di Sertoli nella soluzione, che possono essere ulteriormente coltivate per la proliferazione e la crescita.

Isolamento delle cellule di Sertoli immunoregolatorie dai tubuli seminiferi di topo

Un nuovo protocollo per la preparazione meccanica di sospensioni di cellule testicolari di materiale roditore, evitando enzimi e detergenti, è descritto. Il metodo è molto semplice, veloce, riproducibile, e rende sospensioni cellulari di buona qualità, che sono adatti per il flusso di smistamento e l'estrazione di RNA.

Tecnica semplice ed efficace per la preparazione delle sospensioni cellulari testicolari

Descriviamo una strategia di selezione per spermatidi di topo utilizzando la citometria a flusso. Gli spermatidi sono suddivisi in quattro popolazioni altamente pure, tra cui rotonda (fasi di spermiogenesi 1-9), allungamento precoce (fasi di spermiogenesi 10-12), allungamento tardivo (fasi di spermiogenesi 13-14) e spermatidi allungati (fasi di spermiogenesi 15-16). La colorazione, la dimensione e la granulosità del DNA sono utilizzate come parametri di selezione.

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

Meiosi sono il processo di sviluppo da cui i gameti sono formate attraverso un singolo ciclo di replicazione del DNA e due successivi turni di segregazione del cromosoma. Meiosi mammiferi possono essere esaminate utilizzando una tecnica per preparare cromosomici meiotica. Qui, noi dimostrare un metodo di preparazione di superficie-diffusione nuclei da spermatociti di mouse.

Preparazione del cromosoma meiotico si diffonde da Mouse spermatociti

Questo lavoro descrive la standardizzazione di un metodo per ottenere le popolazioni di cellule germinali purificate dal tessuto testicolo di diverse specie di mammiferi. È un protocollo diretto che combina la dissociazione meccanica dei testicoli, la colorazione con Hoechst-33342 e il ioduro di propidium e l'ordinamento FACS, con ampie applicazioni in studi comparativi della biologia riproduttiva maschile.

Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso

L'obiettivo di questa tecnica di squash del tubulo è quello di valutare velocemente le caratteristiche citologiche di sviluppare spermatociti di mouse, preservando l'integrità cellulare. Questo metodo consente lo studio di tutte le fasi della spermatogenesi e può essere facilmente implementato al fianco di altri approcci biologici biochimici e molecolari per lo studio di meiosi del mouse.

Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

In questa carta, ci proponiamo di descrivere le prestazioni della tecnica di centrifugazione su gradiente di densità e la sua applicazione nella ricerca di fisiologia di sperma.

Raccolta di sperma di qualità differenziale mediante centrifugazione in gradiente di densità

Presentato qui è un protocollo per arricchire gli spermatociti pachytene, gli spermatidi rotondi e gli spermatidi allunganti dei testicoli del topo adulti utilizzando un gradiente didiscontinuo di densità di albumina del siero bovino con attrezzature di laboratorio standard.

Arricchimento di spermatociti pachytene e Spermatidi da test del mouse utilizzando attrezzature di laboratorio standard

Qui presentiamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule germinali meiotiche e post-meiotiche vive dai teste di topo adulti. Utilizzando un colorante legante il DNA a bassa citotossicità, eccitato dalla violetta e uno smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, si possono isolare popolazioni di cellule spermatogeniche altamente arricchite per molte applicazioni a valle.

Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto

Qui, introduciamo un metodo per eseguire l'iniezione di spermatide rotondo (ROSI) nei topi, una tecnica con promettenti applicazioni cliniche e utilità per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo embrionale.

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Impara la separazione delle cellule spermatogenetiche usando il metodo STA-PUT per sedimentazione a velocità. Questa tecnica consente di isolare popolazioni cellulari dai testicoli del topo con elevata purezza.

Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione

Esplora altri video