Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

L'obiettivo di questa tecnica di squash del tubulo è quello di valutare velocemente le caratteristiche citologiche di sviluppare spermatociti di mouse, preservando l'integrità cellulare. Questo metodo consente lo studio di tutte le fasi della spermatogenesi e può essere facilmente implementato al fianco di altri approcci biologici biochimici e molecolari per lo studio di meiosi del mouse.

L'obiettivo generale di questa tecnica di zucca tubulare seminifero è visualizzare le caratteristiche citologiche degli spermatogoni, degli spermatociti e degli spermatidi di topo, preservandone l'integrità cellulare. Per questa dimostrazione, ci concentriamo sull'analisi degli spermatociti sottoposti a meiosi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riproduttiva maschile, come la differenziazione delle cellule staminali spermatogoniali, la segregazione cromosomica meiotica e la differenziazione post-meiotica degli spermatidi rotondi.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che viene mantenuta l'integrità cellulare delle cellule germinali maschili, il che consente l'esame di strutture cellulari non facilmente visualizzabili con altre tecniche. Questo metodo può essere utilizzato per migliorare la nostra comprensione delle cause paterne dell'infertilità in qualsiasi piatto. E può essere applicato a sistemi di mammiferi come i testicoli derivati da topi o donatori di organi.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a fare una buona zucca. L'applicazione di una forza sufficiente e la corretta disposizione dei tubuli sono fattori importanti per produrre un monostrato uniforme di cellule. Per ogni topo da sezionare, caricare due piastre di Petri da 35 millimetri, una con tre millilitri di PBS e l'altra con due millilitri di soluzione di lisi fissativa appena preparata.

Selezionate i topi sottoposti alla prima ondata di spermatogenesi per osservare una popolazione arricchita di interesse. Dopo aver sacrificato il topo, pulire l'addome con alcool al 70% e poi procedere con l'intervento. Praticare un'apertura a forma di V nella cavità pelvica addominale e rimuovere i testicoli tirando il cuscinetto adiposo dell'epididimo con una pinza, ma senza disturbare la tunica albuginea.

Trasferire i testicoli nella piastra contenente PBS. Lì, rimuovere la tunica albuginea testicolare perforando il tessuto con una pinza affilata e raccogliere i tubuli seminiferi sciolti. Successivamente trasferire i tubuli nel piatto con la soluzione di lisi fissativa e lasciare procedere la reazione per cinque minuti a temperatura ambiente.

Durante l'incubazione, preparare un vetrino rivestito di poli-L-lisina delineando i bordi del vetrino con una penna bloccante per liquidi e quindi riempiendo il vetrino con 100 microlitri di soluzione di lisi fissativa entro i bordi. Dopo l'incubazione di cinque minuti, utilizzare pinze e forbici sterili per separare delicatamente e tagliare i tubuli seminiferi in modo da ottenere singoli segmenti di 20 millimetri. Quindi, trasferire cinque segmenti di tubulo da 20 millimetri sul vetrino preparato.

Quindi continua a dividere i segmenti in lunghezze da 1,5 a tre millimetri usando le forbici. Ora con la pinza, disponi i segmenti in modo che non si sovrappongano. Distribuiscili uniformemente su tutto il vetrino.

Idealmente, da 20 a 40 lunghezze corte occuperanno una diapositiva. Iniziare rimuovendo il liquido in eccesso sulla preparazione del vetrino utilizzando un fazzoletto assorbente. Ora, applica un vetrino coprioggetti e schiaccia i tubuli esercitando la pressione dal tallone del palmo per 10-20 secondi.

L'obiettivo è applicare una forza sufficiente per disperdere gli spermatociti dai tubuli seminiferi. Utilizzando un microscopio da dissezione, verificare che i segmenti siano stati interrotti dalla zucca. Quindi, versare un po' di azoto liquido in un piccolo Dewar e congelare il vetrino per 15 secondi o fino a quando il liquido non smette di bollire.

Per procedere con l'amino blotting, rimuovere immediatamente il vetrino coprioggetto utilizzando una punta o un bordo acuminato. Anche se non è l'ideale, i vetrini congelati possono essere conservati immediatamente a meno 80 gradi Celsius e conservati per un massimo di due settimane. Per rimuovere il vetrino coprioggetti in un secondo momento, immergere i vetrini in azoto liquido per 15 secondi e staccare il vetrino coprioggetti.

Per procedere con l'etichettatura degli aminotipi, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti per lavaggio utilizzando un barattolo Coplin da 50 millilitri. Dopo i lavaggi, applicare un millilitro di tampone di diluizione anticorpale su ciascun vetrino per fungere da blocco. Lasciare che la reazione a blocchi funzioni per una o due ore in una camera umidificata.

Non lasciare mai che i vetrini si asciughino durante questa procedura. Quindi, picchiettare i vetrini su un tovagliolo di carta per rimuovere delicatamente il tampone e rimetterli nella camera umidificata. Quindi, applicare 100 microlitri di anticorpi primari diluiti su ciascun vetrino e trasferirli a 40 gradi Celsius dove la reazione di legame può essere eseguita durante la notte.

Se la soluzione anticorpale è preziosa, è possibile utilizzare metà del volume se è coperta da un vetrino coprioggetto o da un Parafilm. Il giorno successivo, utilizzare tre lavaggi in PBS per rimuovere l'anticorpo primario. Successivamente, applicare 100 microlitri di anticorpo secondario diluito e lasciare che questa reazione vada avanti da un'ora a un'ora e mezza a temperatura ambiente.

Per evitare il fotosbiancamento, conservare i vetrini in una camera buia umidificata durante questa incubazione. Quindi, lavare i vetrini due volte con PBS. Ora, punteggia le diapositive utilizzando un supporto di montaggio contenente DAPI.

Quindi sigillare i vetrini coprioggetto con lo smalto per unghie e procedere con l'imaging. Per acquisire immagini, utilizzare un microscopio a epifluorescenza con un tavolino automatizzato che consente un movimento preciso dell'asse z. Utilizzare anche una fotocamera ad alta risoluzione per acquisire le immagini.

Ora, valuta le diapositive utilizzando un obiettivo 20x. Determina la qualità della preparazione della zucca. Una zucca di buona qualità avrà un monostrato di nuclei distribuiti uniformemente.

Alcune regioni della zucca possono essere migliori di altre. Prendi nota delle coordinate delle regioni migliori per trovarle facilmente con un ingrandimento maggiore. Ora, aumenta l'ingrandimento fino a 100x.

Quindi cattura immagini da regioni note che hanno un monostrato coerente di nuclei. Impostate gli z-stack superiore e inferiore per assicurarvi che tutta la luce a fuoco venga catturata. Il numero ottimale di z-stack è generalmente indicato dal software di acquisizione delle immagini ed è diverso per ogni obiettivo.

Dalle immagini, compilare un'immagine a profondità estesa utilizzando un software di elaborazione. Il software combinerà la luce a fuoco di ogni z-stack, che è essenziale per l'imaging ottimale delle preparazioni di zucca tubulare. Utilizzando il metodo di zucca dei tubuli descritto, sono state visualizzate le popolazioni cellulari transitorie sottoposte alla transizione da profase a metafase uno.

Popolazioni arricchite di spermatociti di metafase uno sono state visualizzate utilizzando gli anticorpi contro l'alfa tubulina. Per visualizzare le cellule nella prima profase, i preparati di zucca tubulare sono stati immunomarcati con un anticorpo contro la proteina 3 del complesso sinaptonemale. Sono stati identificati entrambi gli spermatociti stadiati con leptotene, zigotene e pachitene diplotene.

Gli anticorpi contro la chinasi del ciclo cellulare Aurora B sono stati utilizzati per visualizzare gli eventi successivi della meiosi uno. Questa chinasi si localizza nel centromero interno durante la metafase, quindi si rilocalizza nella zona centrale del fuso durante l'anafase e infine nel solco di scissione durante la citochinesi. Mantenendo l'integrità cellulare, la tecnica di squash dei tubuli consente la visualizzazione dell'organizzazione subcellulare nelle strutture associate alla profase uno.

La dinamica del bouquet cromosomico può essere seguita attraverso la profase uno. Può anche essere visualizzata la duplicazione del centriolo nella disgiunzione del centrosoma. Nello stadio iniziale di diplotene, lo spermatocita sottoposto a disgiunzione del centrosoma dopo la duplicazione del centriolo è stato visualizzato con anticorpi contro la pericentrina, un componente proteico della matrice pericentriolare e anticorpi contro la centrina-3 per marcare i centrioli.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare rapidamente le caratteristiche citologiche degli spermatociti di topo in via di sviluppo preservando l'integrità cellulare. Una volta padroneggiata, la dissezione attraverso lo schiacciamento può essere eseguita in meno di un'ora per topo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di applicare una forza sufficiente per disperdere gli spermatociti dai tubuli seminiferi.

Inoltre, la concentrazione fissativa e il tempo di incubazione possono essere ottimizzati a seconda della struttura cellulare da studiare. Strategie di visualizzazione alternative, come gli approcci a DNA e RNA dei pesci, possono essere facilmente implementate con questa tecnica. Integrando gli schiacciamenti dei tubuli con saggi biochimici a valle, è possibile valutare i determinanti meccanicistici del successo della progressione meiotica.