DNA microarray: Esempio di controllo della qualità, ibridazione e scansione di array

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire un esperimento di microarray utilizzando un apparato mixer automatizzato. Ciò si ottiene analizzando prima la qualità dei campioni di RNA con il bioanalizzatore, quindi l'amplificazione e la marcatura dell'RNA. I campioni di RNA vengono ibridati con i microarray.

Infine, i microarray ibridati vengono lavati e scansionati. In definitiva, si ottengono risultati che mostrano l'espressione differenziale dei trascritti di RNA attraverso l'analisi di immagini di microarray a fluorescenza a doppio colore. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di ibridazione dei microarray sono difficili da apprendere a causa dell'attrezzatura specializzata.

L'analisi del controllo qualità inizia con la preparazione dello strumento del bioanalizzatore 2.100 e della stazione di adescamento del chip come indicato nella procedura scritta. La matrice di gel viene quindi filtrata pipettando 550 microlitri in un filtro di centrifuga dotato di centrifuga RNA 6.000 nano kit. Il filtro a 1,500 RCF per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi aliquotare il gel filtrato in aliquote da 65 microlitri, che possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Agitare il concentrato di colorante per 10 secondi e aggiungere un microlitro a un'aliquota da 65 microlitri. Un gel filtrato dopo aver agitato la miscela centrifuga a 13.000 RCF per 10 minuti a temperatura ambiente per eseguire i campioni.

Per prima cosa posizionare un truciolo sulla stazione di adescamento. In questa dimostrazione, vengono utilizzati RNA 6.000 nano chipp. Caricare nove microlitri della miscela di colorante gel nel pozzetto contrassegnato con una G bianca sullo sfondo nero.

Con la punta della pipetta posizionata sul fondo del pozzetto. Posizionare lo stantuffo della siringa a un millilitro e chiudere la stazione di adescamento. Premere lo stantuffo verso il basso lentamente ma costantemente finché non viene trattenuto dalla clip.

Dopo 30 secondi, rilasciare la clip e lasciare che lo stantuffo si alzi per alcuni secondi. Dopo che lo stantuffo si è fermato, tirarlo indietro nella posizione di un millilitro e aprire la stazione di adescamento. Caricare nove microlitri della matrice in gel.

Mescolare in ciascuno dei due pozzetti. Mark G.Quindi pettare cinque microlitri del marcatore nel pozzetto della scala e in ciascuno dei 12 pozzetti del campione. Caricamento successivo, un microlitro della scala denaturata nel pozzetto della scala e un microlitro di ciascun campione denaturato nei pozzetti del campione.

Infine, aggiungere un microlitro di marcatore in ogni campione inutilizzato. Una volta caricato, fate vorticare il chip per un minuto a 2.400 giri/min. Dopo aver avviato il software esperto 2, 100, posizionare il chip e chiudere il coperchio.

Assicurarsi che sia selezionata la porta corretta ed eseguire il test entro cinque minuti dal caricamento dei campioni per evitare l'evaporazione. I metodi per eseguire l'amplificazione e la marcatura dell'RNA possono essere trovati nel protocollo scritto. Una volta marcato, purificare il CRNA per rimuovere eventuali nucleotidi non incorporati Utilizzando cogeni o semplici mini colonne, il CRNA marcato può quindi essere quantificato con un fotometro a spettro NanoDrop 2000.

In modalità di misurazione microarray, registrare, concentrazione del campione, resa e attività specifica. Per l'ibridazione con microarray, è necessario raggiungere una resa di almeno 825 nanogrammi e un'attività specifica di almeno otto picomoli per microgrammo almeno due ore prima dell'ibridazione con microarray. Accendere la stazione di ibridazione e impostarla a 65 gradi Celsius.

Questo protocollo descrive l'uso di Agilent quattro per 40 array 4K con il sistema di ibridazione agile gen Roche e quattro camere miscelatrici successive alla frammentazione del CRNA eseguita come descritto nel protocollo scritto, preparano la camera di ibridazione. Posizionare una diapositiva per microarray sul lato del codice a barre dello strumento di smontaggio dell'assemblaggio. Per prima cosa aprire un mixer A quattro ed esporre l'adesivo che tiene l'array e lo strumento di smontaggio del montaggio per evitare qualsiasi movimento.

Posizionare il mixer A quattro sulla slitta partendo dall'estremità più lontana. Assicurarsi che sia correttamente allineato allo strumento e far aderire il mixer lungo l'array. Far scorrere la trazione dall'estremità del mixer per rimuovere il gruppo del miscelatore a scorrimento.

Utilizzando lo strumento di raglia, premere lungo tutta la guarnizione adesiva per assicurarsi che sia saldamente incollata alla diapositiva. Piccole bolle d'aria intrappolate tra l'adesivo e il vetrino possono essere viste sullo sfondo scuro. Prenditi più tempo per rimuovere queste bolle con lo strumento per ragliare.

L'array è ora pronto per essere caricato. Utilizzare un perpet a spostamento positivo per caricare 100 microlitri del campione di ibridazione. Spingere saldamente la punta all'interno dell'oblò ed erogare lentamente e senza intoppi in modo che l'aria non rimanga intrappolata nell'area dell'array.

Quando il campione copre l'intero array e il liquido inizia a fuoriuscire, la porta di sfiato rimuove rapidamente la pipetta, rilascia solo lo stantuffo. Una volta che la punta è lontana dal vetrino, tamponare delicatamente il liquido in eccesso su entrambe le porte, facendo attenzione a non estrarre il campione dalla camera stessa. Quindi coprire gli oblò con adesivi utilizzando una pinzetta.

Posizionare il vetrino sulla stazione di ibridazione e verificare che i fori della vescica siano posizionati correttamente sopra gli O-ring. Ciò garantirà una corretta miscelazione durante l'ibridazione. Chiudere il coperchio del vetrino e il coperchio della stazione.

Impostare la stazione sulla modalità di miscelazione B e ibridare l'array a 65 gradi Celsius per 17 ore. Una volta terminato il piatto di vetro di riempimento etichettato A con tampone di lavaggio, il piatto dovrebbe essere abbastanza grande da contenere lo strumento di smontaggio del montaggio e consentire anche alcune manovre. Tutti i lavaggi devono essere eseguiti in vetreria poiché la plastica tende a lisciviare i composti con conseguente alto fondo nell'array.

Metti una griglia per vetrini e una barra di mescolamento in una teglia per colorare. Etichettato B, riempire la pirofila con il tampone di lavaggio uno che copre la griglia e posizionare la pirofila su una piastra per mescolare a temperatura ambiente. Inoltre, aggiungi una barra di miscelazione in una teglia vuota etichettata C e posizionala su una piastra di mescolamento.

Rimuovere l'array dalla stazione di ibridazione e posizionarlo nello strumento di smontaggio dell'assemblaggio. Immergere l'intero gruppo nel piatto tenendo con una mano lo strumento di smontaggio del montaggio e la slitta dai lati opposti. Staccare con cautela il miscelatore A quattro facendo attenzione a non graffiare l'area dell'array.

Posizionare rapidamente il vetrino sulla griglia e sulla piastra di colorazione B.L'esposizione all'aria deve essere ridotta al minimo poiché il colorante SCI five è sensibile all'ozono. Lavate la cancella per un minuto mescolando a velocità media. Riempire la vaschetta di colorazione C con il tampone di lavaggio preriscaldato due.

Trasferire le diapositive e lavare per un minuto. Dopo il lavaggio molto lentamente, rimuovere la griglia per vetrini dalla piastra di colorazione C per ridurre al minimo le goccioline rimaste sul vetrino. Asciugare il vetrino facendolo girare per due minuti.

Quindi posizionare il vetrino in una provetta conica da 50 millilitri e riempirlo immediatamente con la scansione con gas argon utilizzando lo scanner genetico da 4.000 B da dispositivi molecolari per evitare la perdita di segnale mostrata. Ecco alcuni esempi di quattro campioni di RNA isolati dal cervello umano. La qualità del campione di tessuto tumorale è stata valutata utilizzando il bioanalizzatore 2.100 su un chip RNA 6.000.

Le punte di freccia piene e aperte indicano la posizione rispettivamente delle specie 18 s e 28 S-R-R-N-A. Il numero di integrità dell'RNA o RIN è una misura quantitativa della qualità dell'RNA di buona qualità Totale. I campioni di RNA dovrebbero produrre solo due picchi principali quando vengono eseguiti in un bioanalizzatore per il controllo di qualità corrispondenti alle due principali specie di RNA ribosomiale.

Una certa degradazione dell'RNA si manifesterà come uno striscio prima del primo picco di RNA ribosomiale e un picco significativamente più basso per 28 S-R-R-N-A gravemente degradato. L'RNA di bassa qualità mostrerà un picco ampio o una serie di picchi a bassi tempi di ritenzione. Mentre i due picchi di RNA ribosomiale saranno di intensità molto bassa o non identificabili affatto.

Gli array di buona qualità dovrebbero produrre un segnale elevato a valori PMT relativamente bassi. Ci si aspetta che la maggior parte delle trascrizioni sia presente a livelli simili nel campione sperimentale e di riferimento. Massicci e diffusi cambiamenti nell'espressione genica probabilmente mancheranno di qualsiasi significato biologico.

Pertanto, la maggior parte dell'array dovrebbe apparire gialla piuttosto che verde o rossa. I segnali di buona qualità dovrebbero anche essere in un intervallo dinamico tale che gli istogrammi del segnale si sovrappongano completamente, come si vede nel grafico a dispersione dell'immagine dell'array. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di microarray utilizzando un apparato di ibridazione automatizzato.