Name: Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Impara a stimare la durata di eliminazione del glutammato dalle membrane astrocitarie nel cervello di topo. Questo metodo elettrofisiologico offre una lettura diretta ad alta risoluzione temporale della clearance sinaptica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke del programma di ricerca intramurale (NS002986). Come ha scritto il manoscritto e implementato l&#39;analisi di deconvoluzione. JSD ha sviluppato la versione iniziale dell&#39;analisi deconvoluzione e commentato il testo.

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<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
<li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid%CE%B21-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.

Qui si descrive un approccio sperimentale per ottenere registrazioni elettrofisiologiche da astrociti, un protocollo analitico per isolare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e un metodo matematico per ricavare l&#39;andamento nel tempo della clearance di glutammato dalle correnti transporter astrociti. Il successo della analisi si basa sulla capacità di ottenere alta qualità registrazioni di patch clamp dagli astrociti e sulla precisione dei algoritmi di adattamento uti...

Astrociti sono uno dei più abbondanti tipi di cellule nel cervello con morfologia a forma di stella e sporgenze sottili membrane che si estendono per tutta la neuropil e raggiungono limitrofi sinaptica contatti 1,2. Membrana cellulare Le astrociti &#39;è densamente ricco di glutammato molecole trasportatrici 3. In condizioni fisiologiche, trasportatori del glutammato legano rapidamente glutammato extracellulare a lato della membrana e trasferirlo al citoplasma cellulare. Così facendo, i trasportatori mantenere bassa la concentrazione basale di glutammato nello spazio extracellulare 4. Trasportatori del glutammato nei processi astrocitici sottili adiacenti eccitatori sinapsi sono in posizione ottimale per legare il glutammato rilasciato durante gli eventi sinaptici come si diffonde lontano dalla fessura sinaptica. In questo modo, i trasportatori limitano anche spillover glutammato verso e peri-regioni extra-sinaptici e sulla sinapsi vicine, riducendo la diffusione spaziale del segnale eccitatorios nel cervello 5-7. Trasporto di glutammato è un processo elettrogenico stechiometricamente accoppiato al movimento di 3 Na + e 1 H + lungo il loro gradiente elettrochimico e alla contro-trasporto di K + 1 8. Trasporto di glutammato è associata con (ma non stechiometricamente accoppiata a) una conduttanza anionica permeabile SCN - (tiocianato)&gt; NO 3 - (nitrato) ≈ ClO 4 - (perclorato)&gt; I -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F -, non a CH 3 SO 3 - (metano sulfonato) e C 6 H 11 O 7 - (gluconato) 9-11. Entrambe le correnti (stechiometrico e non stechiometrico) possono essere registrati mediante l&#39;ottenimento di cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti, identificati visivamente sotto illuminazione Dodt o infrarossi contrasto di interferenza differenziale (IR-DIC) in acutposta del cervello fette 12. La componente stechiometrica della corrente associata trasporto di glutammato attraverso la membrana può essere isolato utilizzando CH 3 SO 3 -, o H 11 O 7 C 6 - soluzioni intracellulari based e può essere evocato dal glutammato flash-uncaging sugli astrociti 13,14, o attivando il rilascio di glutammato da sinapsi vicine, sia elettricamente 12 o con un controllo optogenetic mirato. L&#39;andamento temporale della componente stechiometrica della corrente trasportatore è modellato dalla durata del profilo di concentrazione glutammato in astrociti membrane (cioè clearance della glutammato), la cinetica di trasportatori del glutammato, le proprietà di membrana passivi di astrociti, e durante stimolazioni sinaptiche, dal sincronicità del rilascio di glutammato attraverso le sinapsi attivate 13. Qui si descrive in dettaglio: (1) un appr sperimentaleoach di isolare la componente stechiometrica delle correnti trasportatore del glutammato da cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti utilizzando acute del mouse fettine di ippocampo come esempio la preparazione sperimentale, (2) un approccio analitico per ricavare l&#39;andamento nel tempo della clearance di glutammato da queste registrazioni 13, 14. Questi metodi possono essere usati per registrare e analizzare le correnti trasportatore del glutammato dagli astrociti in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 sale disodico</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX sale disodico</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotossina</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-glutammato</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td>Elettrodi a</td></tr><tr><td>matrice</td> opzionali <td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 adesivo istantaneo</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Lampada Xe</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

derivando la durata di liquidazione glutammato con una analisi deconvoluzione delle correnti transporter astrociti

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

La più alta densità di trasportatori del glutammato nel cervello è trovato in astrociti. Glutammato trasportatori coppia il movimento del glutammato attraverso la membrana con il co-trasporto di Na + e 3 1 H + e la contro-trasporto di K + 1. La corrente stechiometrico generata dal processo di trasporto può essere monitorato con cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti. L&#39;andamento temporale della corrente registrata è modellato dalla decorso temporale del profilo glutammato concentrazione a cui sono esposti gli astrociti, la cinetica di trasportatori del glutammato, e le proprietà elettrotoniche passivi di membrane astrociti. Qui si descrivono i metodi sperimentali e analitici che possono essere utilizzati per registrare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e isolare l&#39;andamento nel tempo della clearance di glutammato da tutti gli altri fattori che determinano la forma d&#39;onda delle correnti trasportatore astrociti. I metodi qui descritti possono essere utilizzati per stimare la durata of flash-Uncaged e sinapticamente-glutammato rilasciato a membrane astrocitici in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale durante salute e di malattia.

Il successo di questo approccio analitico descritto qui dipende criticamente ottenere registrazioni elettrofisiologiche alta qualità delle correnti Trasportatori dagli astrociti in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale. In acute del mouse fettine di ippocampo, astrociti possono essere facilmente identificati sotto Dodt illuminazione o IR-DIC causa del loro piccolo corpo cellulare (Ø = 10 micron) e nucleo prominente (Figura 1). Loro caratteristico morfologia a stella può essere apprezzato con ep...

Descriviamo un metodo analitico per stimare la durata del glutammato a membrane di astrociti da registrazioni elettrofisiologiche delle correnti trasportatore del glutammato negli astrociti.

Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

L'obiettivo generale dell'esperimento è stimare l'andamento temporale della rimozione del glutammato dalle membrane astrocitiche dopo il suo rilascio dalle sinapsi eccitatorie. Il primo passaggio di questo processo consiste nel registrare l'attivazione sinaptica del trasporto di glutammato da parte degli astrociti in fette cerebrali acute in assenza e in presenza di una concentrazione sub-saturante dell'antagonista a spettro ampio dei trasportatori del glutammato, TBOA. Il secondo passaggio consiste nell'analizzare le registrazioni per isolare le correnti dei trasportatori del glutammato attivate sinapticamente da tutti gli altri componenti della risposta evocata.Successivamente, il corso temporale del filtro viene stimato analizzando le correnti del trasportatore registrate in presenza di TBOA, mediante la desovrapposizione del filtro dall'evento di trasporto registrato in condizioni controllate. Viene ottenuto il corso temporale della rimozione del glutammato dalle membrane astrocitiche. I risultati mostrano che negli astrociti dell'ippocampo del topo sono necessari solo pochi millisecondi per rimuovere il glutammato rilasciato sinapticamente dallo spazio extracellulare.Questo approccio fornisce uno strumento sensibile per rilevare i cambiamenti nella capacità di assorbimento degli astrociti in diverse regioni del cervello durante condizioni fisiologiche e patologiche. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto ad altre tecniche, basate ad esempio sull'analisi dello spostamento di antagonisti recettoriali del glutammato a rapida dissociazione su indicatori fluorescenti del glutammato o su simulazioni computazionali di diffusione e reazione, consiste nella capacità di fornire un'acquisizione sperimentale diretta con elevata risoluzione temporale della rimozione del glutammato da parte degli astrociti. Questo metodo ci permette di comprendere la dinamica spaziale e temporale della trasmissione sinaptica nel cervello.Può aiutarci a interpretare i cambiamenti fisiopatologici nel glutammato, nella diffusione e nell'assorbimento che possono verificarsi in determinati disturbi neurologici come la malattia di Alzheimer. Iniziare questa procedura effettuando cinque tagli su un cervello di topo dissezionato con un bisturi. Per prima cosa, rimuovere i bulbi olfattivi e la corteccia frontale.In secondo luogo, rimuovere il cervelletto. Successivamente, rimuovere i lobi temporali sinistro e destro. Quindi separare i due emisferi cerebrali con un taglio sagittale mediano.Successivamente, incollare la superficie laterale di ciascun taglio cerebrale sulla piastra di base fredda del vibrometro. Il lato dorsale del cervello deve essere rivolto verso la lama del vibrometro, mentre il lato ventrale del cervello deve essere a contatto con il blocco di agar, lontano dalla lama del vibrometro. Quindi fissare la piastra di base del vibrometro alla camera di dissezione.Impostare lo spessore della fetta su 250 micrometri e regolare la larghezza della lama prima del taglio. Una volta che la lama ha attraversato la corteccia e l'ippocampo, utilizzare un bisturi per staccare la corteccia e l'ippocampo dal mesencefalo. Successivamente, posizionare una fetta nella camera di immersione a 34 gradi Celsius dopo aver mantenuto le fette a 34 gradi Celsius per 30 minuti.Lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti prima di utilizzarli per le registrazioni di elettrofisiologia in questa procedura, quindi trasferire una sezione nella camera di registrazione. Ispezionare visivamente la sezione sotto l'illuminazione a punti o I-R-D-I-C. Gli astrociti possono essere identificati per il loro corpo cellulare piccolo e per il nucleo prominente a scopo di stimolazione sinaptica.Posizionare un elettrodo bipolare in acciaio inossidabile a circa 100 micrometri di distanza dall'astrocita da patchare. Effettuare il patch dell'astrocita e passare alla configurazione a cellula intera applicando una leggerissima aspirazione. Quindi alternare stimoli singoli e accoppiati ogni 10-20 secondi per isolare le porzioni facilitate dell'occorrenza del trasporto attivato sinapticamente.Prima di tutto, acquisire in media almeno 20 tracciati ottenuti con stimolazioni accoppiate in condizioni controllate e in presenza di 10 micromolare di antagonista a spettro ampio dei trasportatori del glutammato. TBOA, quindi acquisire in media un numero identico di tracciati ottenuti con stimolazioni singole in condizioni di controllo e in presenza di 10 micromolare di TBOA. Sottrarre il tracciato medio ottenuto con stimolazioni singole dal tracciato medio ottenuto con stimolazioni accoppiate. Questo passaggio permette di isolare il potenziale STO geometrico e la corrente di potassio sostenuta evocata dal secondo stimolo.Nel passaggio successivo, sottrarre dalla traccia media ottenuta con stimolazioni singole mediante un intervallo temporale corrispondente all'intervallo PUL utilizzato per somministrare impulsi accoppiati, la risposta media spostata nel tempo ottenuta con stimolazioni singole dalla risposta media al secondo stimolo ottenuta in precedenza. Questo passaggio isola una porzione facilitata della corrente del trasportatore evocata dal secondo stimolo. Nella maggior parte dei casi, questo passaggio elimina completamente la corrente al potassio sostenuta.Se questo è il caso, l'isolamento del FSTC è completo e si può procedere con l'analisi di deconvoluzione e ottenere il tracciato temporale della rimozione del glutammato dagli astrociti. In alcuni casi, tuttavia, è ancora presente una piccola corrente di potassio sostenuta ed è richiesta un'ulteriore analisi. Misurare l'ampiezza della corrente di potassio sostenuta residua dopo l'esecuzione.L'analisi descritta in precedenza scala l'ampiezza della funzione mono-esponenziale all'ampiezza della corrente al potassio sostenuta residua impostando l'ampiezza della corrente al potassio sostenuta misurata come a in questa equazione. Tuttavia, la costante di tempo di salita rappresenta il valore medio della salita stimato in esperimenti separati nei quali una corrente al potassio sostenuta viene isolata. Farmacologicamente, utilizzando una concentrazione elevata e saturante di TBOA, si sottrae successivamente la funzione mono-esponenziale risultante dalla FSTC e dalla corrente al potassio sostenuta.Per completare l'isolamento del FSTC. Per isolare l'occorrenza del trasporto attivato dal flash. Acquisire in media almeno 20 tracce ottenute con il percorso luminoso aperto in condizioni di controllo e in presenza di TBOA 10 micromolare, quindi acquisire lo stesso numero di tracce con il percorso luminoso chiuso in condizioni di controllo e in presenza di TBOA 10 micromolare; sottrarre la traccia media ottenuta con il percorso luminoso bloccato da quella ottenuta con il percorso luminoso aperto.Questo passaggio permette di rimuovere l'artefatto di stimolo e di isolare le FTC; in questo passaggio, adattare la corrente di trasporto, sia FSTC che FTC registrata in condizioni di controllo e in presenza di TBOA 10 micromolare, con una funzione multi-esponenziale, creando una funzione che insorge istantaneamente e decade mono-esponenzialmente secondo tale funzione e che descrive al meglio la fase di decadimento della corrente del trasportatore registrata in presenza di TBOA 10 micromolare. Successivamente, deconvolvere la funzione mono-esponenziale dall'adattamento della corrente del trasportatore registrata in presenza di TBOA 10 micromolare per derivare il filtro. Quindi, deconvolvere il filtro dall'adattamento della corrente del trasportatore registrata in condizioni di controllo.Per ottenere una stima quantitativa del corso temporale complessivo della rimozione del glutammato, calcolare l'OID della forma d'onda durante il tentativo di questa procedura. È importante verificare che gli eventi di trasporto siano registrati in condizioni sperimentali in cui il filtro opera in un regime lineare e introduce solo distorsioni lineari del trasporto. La forma d'onda della corrente da questi eventi può essere verificata controllando le manipolazioni che modificano l'ampiezza della corrente di trasporto.Non modificare il suo percorso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare le registrazioni astrocitiche per estrarre informazioni riguardo al glutammato, alla diffusione e al reuptake nel cervello.

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Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per elettroporare in utero della corteccia cerebrale e l'ippocampo a E14.5 nei topi. Abbiamo anche dimostrato che questo è un metodo valido per studiare dendriti e spine in queste due regioni cerebrali.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Impara a stimare la durata di eliminazione del glutammato dalle membrane astrocitarie nel cervello di topo. Questo metodo elettrofisiologico offre una lettura diretta ad alta risoluzione temporale della clearance sinaptica.

Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

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