Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

L'obiettivo generale dell'esperimento è quello di stimare l'andamento temporale della clearance del glutammato dalle membrane astrocitiche dopo il suo rilascio dalle sinapsi eccitatorie. Il primo passo in questo processo è quello di registrare il trasporto di glutammato attivato sinapticamente dagli astrociti in fette cerebrali acute in assenza e presenza di una concentrazione subsaturante dell'antagonista del trasportatore del glutammato ad ampio spettro, TBOA. Il secondo passo consiste nell'analizzare le registrazioni per isolare le correnti di trasporto del glutammato attivate sinapticamente da tutti gli altri componenti della risposta evocata.

Successivamente, viene stimato l'andamento temporale del filtro analizzando le correnti del trasportatore registrate in presenza di TBOA coinvolgendo il filtro dall'occorrenza del trasporto registrata in condizioni controllate. Si ottiene l'andamento temporale della clearance del glutammato dalle membrane astrocitiche. I risultati mostrano che nell'ippocampo del topo gli astrociti richiedono solo pochi millisecondi per rimuovere il glutammato rilasciato sinapticamente dalla base spaziale extracellulare.

Questo approccio fornisce uno strumento sensibile per rilevare i cambiamenti nella capacità di assorbimento degli astrociti in diverse regioni del cervello durante condizioni fisiologiche e patologiche. Il vantaggio principale di questo approccio rispetto ad altri metodi basati, ad esempio, sull'analisi dello spostamento di antagonisti del recettore del glutammato rapidamente dissocianti su indicatori fluorescenti di glutammato o su simulazioni al computer di reazioni di diffusione, è che fornisce un'alta risoluzione temporale, lettura sperimentale diretta della clearance del glutammato dagli astrociti. Questo metodo ci permette di comprendere le dinamiche spaziali e temporali della trasmissione sinaptica nel cervello.

Può aiutarci a interpretare i cambiamenti fisiopatologici nel glutammato, nella diffusione e nell'assorbimento che possono verificarsi in alcuni disturbi neurologici come il morbo di Alzheimer. Inizia questa procedura praticando cinque tagli su un cervello di topo sezionato con un bisturi. Per prima cosa, rimuovere i bulbi olfattivi e la corteccia frontale.

In secondo luogo, rimuovere il cervelletto. Quindi, rimuovere i lobi temporali sinistro e destro. Quindi separare i due emisferi cerebrali con un taglio sagittale.

Quindi, incolla la superficie laterale di ciascuna sezione del cervello alla piastra di base vibram fredda. Il lato dorsale del cervello dovrebbe essere rivolto verso la lama Vibram e il lato ventrale del cervello dovrebbe essere in contatto con il blocco di agar lontano dalla lama del vibrato. Quindi fissare la piastra di base del vibrato alla camera di dissezione.

Impostare lo spessore della fetta a 250 micrometri e regolare la larghezza della lama prima di affettare. Una volta che la lama ha attraversato la corteccia e l'ippocampo, usa un bisturi per tagliare l'ippocampo della corteccia dal mesencefalo. Successivamente, mettere una fetta nella camera di immersione a 34 gradi Celsius dopo aver mantenuto le fette a 34 gradi Celsius per 30 minuti.

Lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti prima di utilizzarli per le registrazioni elettrofisiologiche In questa procedura, trasferire una fetta nella camera di registrazione. Ispezionare visivamente la fetta sotto l'illuminazione a punti o I-R-D-I-C. Gli astrociti possono essere identificati dal loro piccolo corpo cellulare e dal nucleo prominente per la stimolazione sinaptica.

Posiziona un elettrodo bipolare in acciaio inossidabile a circa 100 micrometri di distanza dall'astrocita che intendi patchare. Applicare un cerotto all'astrocita e rompere l'intera configurazione cellulare applicando un'aspirazione molto delicata. Quindi alternare stimoli singoli e accoppiati ogni 10-20 secondi per isolare le porzioni facilitate dell'evento di trasporto attivato sinapticamente.

In primo luogo, la media di almeno 20 sweep ottenuta con stimolazioni appaiate in condizioni controllate e in presenza di 10 antagonisti micromolari del trasportatore di glutammato ad ampio spettro. Il TBOA media quindi un numero identico di sweep ottenuti con singole stimolazioni in condizioni di controllo e in 10 micromolari il TBOA sottrae la traccia media ottenuta con singole stimolazioni dalla traccia media ottenuta con stimolazioni appaiate. Questo passaggio consente di isolare la corrente geometrica STO e la corrente di potassio sostenuta evocata dal secondo stimolo.

Turno successivo, la traccia media ottenuta con singole stimolazioni da un intervallo di tempo che corrisponde all'intervallo PUL utilizzato per erogare impulsi accoppiati sottrae la risposta media spostata nel tempo ottenuta con singole stimolazioni dalla risposta media al secondo stimolo ottenuta in precedenza. Questo passaggio isola una porzione facilitata della corrente del trasportatore evocata dal secondo stimolo. Nella maggior parte dei casi, questo passaggio rimuove completamente la corrente di potassio sostenuta.

Se questo è il caso, l'isolamento dell'FSTC è completo e si può procedere con l'analisi di deconvoluzione e arrivare al decorso temporale della clearance del glutammato dagli astrociti. In alcuni casi, tuttavia, è ancora presente una piccola corrente di potassio sostenuta e sono necessarie ulteriori analisi. Misurare l'ampiezza della corrente di potassio sostenuta rimanente dopo l'esecuzione.

L'analisi descritta in precedenza scala l'ampiezza della funzione monoesponenziale all'ampiezza della corrente di potassio sostenuta residua impostando l'ampiezza della corrente di potassio sostenuta misurata come a in questa equazione. Ma la costante del tempo di salita rappresenta il valore medio di salita stimato in esperimenti separati in cui viene isolata una corrente di potassio sostenuta. Farmacologicamente utilizzando un'alta concentrazione saturante di TBOA, sottrarre la funzione monoesponenziale risultante dall'FSTC e dalla corrente di potassio sostenuta.

Per completare l'isolamento dell'FSTC. Per isolare l'occorrenza di trasporto attivata dal flash. Fare la media di almeno 20 sweep ottenuti con il percorso della luce aperto in condizioni di controllo e in 10 TBOA micromolari, quindi fare la media dello stesso numero di sweep ottenuti con il percorso della luce chiuso in condizioni di controllo, e in 10 TBOA micromolari sottrarre la traccia media ottenuta con il percorso della luce bloccato dalla traccia media ottenuta con il percorso della luce aperto.

Questo passaggio consente di rimuovere l'artefatto stimolo e isolare gli FTC: in questo passaggio si adattano la corrente di trasporto FSTC o FTC registrata in condizioni di controllo e in 10 TBOA micromolari e li dotano di una funzione multi esponenziale, creano una funzione ascendente istantanea che decade mono esponenzialmente in base a questa funzione e che descrive al meglio la fase di decadimento del trasportatore Corrente registrata a 10 TBOA micromolari. Quindi devolvere la funzione esponenziale mono dall'adattamento della corrente del trasportatore registrata in 10 micromolari TBOA per derivare il filtro. Quindi devolvere il filtro dall'adattamento della corrente del trasportatore in condizioni controllate.

Per ottenere una stima quantitativa dell'andamento temporale complessivo della clearance del glutammato, calcolare l'OID della forma d'onda durante il tentativo di questa procedura. È importante confermare che l'occorrenza del trasporto viene registrata in condizioni sperimentali in cui il filtro opera in un regime lineare e introduce solo distorsioni lineari del trasporto. L'onda di corrente da questi può essere eseguita controllando le manipolazioni che modificano la dimensione della corrente di trasporto.

Non modificare il suo corso di timbro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le registrazioni astrocitarie per estrarre informazioni sul glutammato, la diffusione e l'assorbimento nel cervello.