Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

L'obiettivo generale dell'esperimento è stimare l'andamento temporale della rimozione del glutammato dalle membrane astrocitiche dopo il suo rilascio dalle sinapsi eccitatorie. Il primo passaggio di questo processo consiste nel registrare l'attivazione sinaptica del trasporto di glutammato da parte degli astrociti in fette cerebrali acute in assenza e in presenza di una concentrazione sub-saturante dell'antagonista a spettro ampio dei trasportatori del glutammato, TBOA. Il secondo passaggio consiste nell'analizzare le registrazioni per isolare le correnti dei trasportatori del glutammato attivate sinapticamente da tutti gli altri componenti della risposta evocata.

Successivamente, il corso temporale del filtro viene stimato analizzando le correnti del trasportatore registrate in presenza di TBOA, mediante la desovrapposizione del filtro dall'evento di trasporto registrato in condizioni controllate. Viene ottenuto il corso temporale della rimozione del glutammato dalle membrane astrocitiche. I risultati mostrano che negli astrociti dell'ippocampo del topo sono necessari solo pochi millisecondi per rimuovere il glutammato rilasciato sinapticamente dallo spazio extracellulare.

Questo approccio fornisce uno strumento sensibile per rilevare i cambiamenti nella capacità di assorbimento degli astrociti in diverse regioni del cervello durante condizioni fisiologiche e patologiche. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto ad altre tecniche, basate ad esempio sull'analisi dello spostamento di antagonisti recettoriali del glutammato a rapida dissociazione su indicatori fluorescenti del glutammato o su simulazioni computazionali di diffusione e reazione, consiste nella capacità di fornire un'acquisizione sperimentale diretta con elevata risoluzione temporale della rimozione del glutammato da parte degli astrociti. Questo metodo ci permette di comprendere la dinamica spaziale e temporale della trasmissione sinaptica nel cervello.

Può aiutarci a interpretare i cambiamenti fisiopatologici nel glutammato, nella diffusione e nell'assorbimento che possono verificarsi in determinati disturbi neurologici come la malattia di Alzheimer. Iniziare questa procedura effettuando cinque tagli su un cervello di topo dissezionato con un bisturi. Per prima cosa, rimuovere i bulbi olfattivi e la corteccia frontale.

In secondo luogo, rimuovere il cervelletto. Successivamente, rimuovere i lobi temporali sinistro e destro. Quindi separare i due emisferi cerebrali con un taglio sagittale mediano.

Successivamente, incollare la superficie laterale di ciascun taglio cerebrale sulla piastra di base fredda del vibrometro. Il lato dorsale del cervello deve essere rivolto verso la lama del vibrometro, mentre il lato ventrale del cervello deve essere a contatto con il blocco di agar, lontano dalla lama del vibrometro. Quindi fissare la piastra di base del vibrometro alla camera di dissezione.

Impostare lo spessore della fetta su 250 micrometri e regolare la larghezza della lama prima del taglio. Una volta che la lama ha attraversato la corteccia e l'ippocampo, utilizzare un bisturi per staccare la corteccia e l'ippocampo dal mesencefalo. Successivamente, posizionare una fetta nella camera di immersione a 34 gradi Celsius dopo aver mantenuto le fette a 34 gradi Celsius per 30 minuti.

Lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti prima di utilizzarli per le registrazioni di elettrofisiologia in questa procedura, quindi trasferire una sezione nella camera di registrazione. Ispezionare visivamente la sezione sotto l'illuminazione a punti o I-R-D-I-C. Gli astrociti possono essere identificati per il loro corpo cellulare piccolo e per il nucleo prominente a scopo di stimolazione sinaptica.

Posizionare un elettrodo bipolare in acciaio inossidabile a circa 100 micrometri di distanza dall'astrocita da patchare. Effettuare il patch dell'astrocita e passare alla configurazione a cellula intera applicando una leggerissima aspirazione. Quindi alternare stimoli singoli e accoppiati ogni 10-20 secondi per isolare le porzioni facilitate dell'occorrenza del trasporto attivato sinapticamente.

Prima di tutto, acquisire in media almeno 20 tracciati ottenuti con stimolazioni accoppiate in condizioni controllate e in presenza di 10 micromolare di antagonista a spettro ampio dei trasportatori del glutammato. TBOA, quindi acquisire in media un numero identico di tracciati ottenuti con stimolazioni singole in condizioni di controllo e in presenza di 10 micromolare di TBOA. Sottrarre il tracciato medio ottenuto con stimolazioni singole dal tracciato medio ottenuto con stimolazioni accoppiate. Questo passaggio permette di isolare il potenziale STO geometrico e la corrente di potassio sostenuta evocata dal secondo stimolo.

Nel passaggio successivo, sottrarre dalla traccia media ottenuta con stimolazioni singole mediante un intervallo temporale corrispondente all'intervallo PUL utilizzato per somministrare impulsi accoppiati, la risposta media spostata nel tempo ottenuta con stimolazioni singole dalla risposta media al secondo stimolo ottenuta in precedenza. Questo passaggio isola una porzione facilitata della corrente del trasportatore evocata dal secondo stimolo. Nella maggior parte dei casi, questo passaggio elimina completamente la corrente al potassio sostenuta.

Se questo è il caso, l'isolamento del FSTC è completo e si può procedere con l'analisi di deconvoluzione e ottenere il tracciato temporale della rimozione del glutammato dagli astrociti. In alcuni casi, tuttavia, è ancora presente una piccola corrente di potassio sostenuta ed è richiesta un'ulteriore analisi. Misurare l'ampiezza della corrente di potassio sostenuta residua dopo l'esecuzione.

L'analisi descritta in precedenza scala l'ampiezza della funzione mono-esponenziale all'ampiezza della corrente al potassio sostenuta residua impostando l'ampiezza della corrente al potassio sostenuta misurata come a in questa equazione. Tuttavia, la costante di tempo di salita rappresenta il valore medio della salita stimato in esperimenti separati nei quali una corrente al potassio sostenuta viene isolata. Farmacologicamente, utilizzando una concentrazione elevata e saturante di TBOA, si sottrae successivamente la funzione mono-esponenziale risultante dalla FSTC e dalla corrente al potassio sostenuta.

Per completare l'isolamento del FSTC. Per isolare l'occorrenza del trasporto attivato dal flash. Acquisire in media almeno 20 tracce ottenute con il percorso luminoso aperto in condizioni di controllo e in presenza di TBOA 10 micromolare, quindi acquisire lo stesso numero di tracce con il percorso luminoso chiuso in condizioni di controllo e in presenza di TBOA 10 micromolare; sottrarre la traccia media ottenuta con il percorso luminoso bloccato da quella ottenuta con il percorso luminoso aperto.

Questo passaggio permette di rimuovere l'artefatto di stimolo e di isolare le FTC; in questo passaggio, adattare la corrente di trasporto, sia FSTC che FTC registrata in condizioni di controllo e in presenza di TBOA 10 micromolare, con una funzione multi-esponenziale, creando una funzione che insorge istantaneamente e decade mono-esponenzialmente secondo tale funzione e che descrive al meglio la fase di decadimento della corrente del trasportatore registrata in presenza di TBOA 10 micromolare. Successivamente, deconvolvere la funzione mono-esponenziale dall'adattamento della corrente del trasportatore registrata in presenza di TBOA 10 micromolare per derivare il filtro. Quindi, deconvolvere il filtro dall'adattamento della corrente del trasportatore registrata in condizioni di controllo.

Per ottenere una stima quantitativa del corso temporale complessivo della rimozione del glutammato, calcolare l'OID della forma d'onda durante il tentativo di questa procedura. È importante verificare che gli eventi di trasporto siano registrati in condizioni sperimentali in cui il filtro opera in un regime lineare e introduce solo distorsioni lineari del trasporto. La forma d'onda della corrente da questi eventi può essere verificata controllando le manipolazioni che modificano l'ampiezza della corrente di trasporto.

Non modificare il suo percorso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare le registrazioni astrocitiche per estrarre informazioni riguardo al glutammato, alla diffusione e al reuptake nel cervello.