Name: Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Impara a stimare la durata di eliminazione del glutammato dalle membrane astrocitarie nel cervello di topo. Questo metodo elettrofisiologico offre una lettura diretta ad alta risoluzione temporale della clearance sinaptica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke del programma di ricerca intramurale (NS002986). Come ha scritto il manoscritto e implementato l&#39;analisi di deconvoluzione. JSD ha sviluppato la versione iniziale dell&#39;analisi deconvoluzione e commentato il testo.

<ol><li>Ventura, R., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+relationships+between+hippocampal+synapses+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes.</a> J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).</li>
<li>Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+perisynaptic+astroglia+during+synaptogenesis+in+the+mature+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus.</a> Glia. 55, 13-23 (2007).</li>
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<li>Herman, M. A., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glutamate+concentration+in+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice.</a> J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).</li>
<li>Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+independent+hippocampal+synapses+is+controlled+by+glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake.</a> Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).</li>
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<li>Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+glutamate+diffusion+in+the+hippocampus%3A+ultrastructural+constraints%2C+uptake%2C+and+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.</a> J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).</li>
<li>Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+coupling+in+a+neuronal+glutamate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flux coupling in a neuronal glutamate transporter.</a> Nature. 383, 634-637 (1038).</li>
<li>Eliasof, S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+cell+glutamate+transporter+is+coupled+to+an+anionic+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).</li>
<li>Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+associated+with+excitatory+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport.</a> Neuron. 15, 721-728 (1995).</li>
<li>Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+and+microscopic+properties+of+a+cloned+glutamate+transporter%2Fchloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel.</a> J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li>
<li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes%3A+transmitter+uptake+gets+faster+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).</li>
<li>Scimemi, A., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transporters+regulate+glutamate+clearance%2C+NMDA+receptor+activation%2C+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).</li>
<li>Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+enhances+glutamate+uptake+via+glutamate+transporters+in+rat+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells.</a> Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).</li>
<li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+%28Ambystoma%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li>
<li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li>
<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
<li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid%CE%B21-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.

Qui si descrive un approccio sperimentale per ottenere registrazioni elettrofisiologiche da astrociti, un protocollo analitico per isolare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e un metodo matematico per ricavare l&#39;andamento nel tempo della clearance di glutammato dalle correnti transporter astrociti. Il successo della analisi si basa sulla capacità di ottenere alta qualità registrazioni di patch clamp dagli astrociti e sulla precisione dei algoritmi di adattamento uti...

Astrociti sono uno dei più abbondanti tipi di cellule nel cervello con morfologia a forma di stella e sporgenze sottili membrane che si estendono per tutta la neuropil e raggiungono limitrofi sinaptica contatti 1,2. Membrana cellulare Le astrociti &#39;è densamente ricco di glutammato molecole trasportatrici 3. In condizioni fisiologiche, trasportatori del glutammato legano rapidamente glutammato extracellulare a lato della membrana e trasferirlo al citoplasma cellulare. Così facendo, i trasportatori mantenere bassa la concentrazione basale di glutammato nello spazio extracellulare 4. Trasportatori del glutammato nei processi astrocitici sottili adiacenti eccitatori sinapsi sono in posizione ottimale per legare il glutammato rilasciato durante gli eventi sinaptici come si diffonde lontano dalla fessura sinaptica. In questo modo, i trasportatori limitano anche spillover glutammato verso e peri-regioni extra-sinaptici e sulla sinapsi vicine, riducendo la diffusione spaziale del segnale eccitatorios nel cervello 5-7. Trasporto di glutammato è un processo elettrogenico stechiometricamente accoppiato al movimento di 3 Na + e 1 H + lungo il loro gradiente elettrochimico e alla contro-trasporto di K + 1 8. Trasporto di glutammato è associata con (ma non stechiometricamente accoppiata a) una conduttanza anionica permeabile SCN - (tiocianato)&gt; NO 3 - (nitrato) ≈ ClO 4 - (perclorato)&gt; I -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F -, non a CH 3 SO 3 - (metano sulfonato) e C 6 H 11 O 7 - (gluconato) 9-11. Entrambe le correnti (stechiometrico e non stechiometrico) possono essere registrati mediante l&#39;ottenimento di cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti, identificati visivamente sotto illuminazione Dodt o infrarossi contrasto di interferenza differenziale (IR-DIC) in acutposta del cervello fette 12. La componente stechiometrica della corrente associata trasporto di glutammato attraverso la membrana può essere isolato utilizzando CH 3 SO 3 -, o H 11 O 7 C 6 - soluzioni intracellulari based e può essere evocato dal glutammato flash-uncaging sugli astrociti 13,14, o attivando il rilascio di glutammato da sinapsi vicine, sia elettricamente 12 o con un controllo optogenetic mirato. L&#39;andamento temporale della componente stechiometrica della corrente trasportatore è modellato dalla durata del profilo di concentrazione glutammato in astrociti membrane (cioè clearance della glutammato), la cinetica di trasportatori del glutammato, le proprietà di membrana passivi di astrociti, e durante stimolazioni sinaptiche, dal sincronicità del rilascio di glutammato attraverso le sinapsi attivate 13. Qui si descrive in dettaglio: (1) un appr sperimentaleoach di isolare la componente stechiometrica delle correnti trasportatore del glutammato da cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti utilizzando acute del mouse fettine di ippocampo come esempio la preparazione sperimentale, (2) un approccio analitico per ricavare l&#39;andamento nel tempo della clearance di glutammato da queste registrazioni 13, 14. Questi metodi possono essere usati per registrare e analizzare le correnti trasportatore del glutammato dagli astrociti in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 sale disodico</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX sale disodico</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotossina</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-glutammato</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td>Elettrodi a</td></tr><tr><td>matrice</td> opzionali <td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 adesivo istantaneo</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Lampada Xe</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

derivando la durata di liquidazione glutammato con una analisi deconvoluzione delle correnti transporter astrociti

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

La più alta densità di trasportatori del glutammato nel cervello è trovato in astrociti. Glutammato trasportatori coppia il movimento del glutammato attraverso la membrana con il co-trasporto di Na + e 3 1 H + e la contro-trasporto di K + 1. La corrente stechiometrico generata dal processo di trasporto può essere monitorato con cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti. L&#39;andamento temporale della corrente registrata è modellato dalla decorso temporale del profilo glutammato concentrazione a cui sono esposti gli astrociti, la cinetica di trasportatori del glutammato, e le proprietà elettrotoniche passivi di membrane astrociti. Qui si descrivono i metodi sperimentali e analitici che possono essere utilizzati per registrare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e isolare l&#39;andamento nel tempo della clearance di glutammato da tutti gli altri fattori che determinano la forma d&#39;onda delle correnti trasportatore astrociti. I metodi qui descritti possono essere utilizzati per stimare la durata of flash-Uncaged e sinapticamente-glutammato rilasciato a membrane astrocitici in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale durante salute e di malattia.

Il successo di questo approccio analitico descritto qui dipende criticamente ottenere registrazioni elettrofisiologiche alta qualità delle correnti Trasportatori dagli astrociti in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale. In acute del mouse fettine di ippocampo, astrociti possono essere facilmente identificati sotto Dodt illuminazione o IR-DIC causa del loro piccolo corpo cellulare (Ø = 10 micron) e nucleo prominente (Figura 1). Loro caratteristico morfologia a stella può essere apprezzato con ep...

Descriviamo un metodo analitico per stimare la durata del glutammato a membrane di astrociti da registrazioni elettrofisiologiche delle correnti trasportatore del glutammato negli astrociti.

Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

L'obiettivo generale dell'esperimento è stimare l'andamento temporale della rimozione del glutammato dalle membrane astrocitiche dopo il suo rilascio dalle sinapsi eccitatorie. Il primo passaggio di questo processo consiste nel registrare l'attivazione sinaptica del trasporto di glutammato da parte degli astrociti in fette cerebrali acute in assenza e in presenza di una concentrazione sub-saturante dell'antagonista a spettro ampio dei trasportatori del glutammato, TBOA. Il secondo passaggio consiste nell'analizzare le registrazioni per isolare le correnti dei trasportatori del glutammato attivate sinapticamente da tutti gli altri componenti della risposta evocata.Successivamente, il corso temporale del filtro viene stimato analizzando le correnti del trasportatore registrate in presenza di TBOA, mediante la desovrapposizione del filtro dall'evento di trasporto registrato in condizioni controllate. Viene ottenuto il corso temporale della rimozione del glutammato dalle membrane astrocitiche. I risultati mostrano che negli astrociti dell'ippocampo del topo sono necessari solo pochi millisecondi per rimuovere il glutammato rilasciato sinapticamente dallo spazio extracellulare.Questo ap

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La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni...

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Questo video mostra la valutazione del rilascio e della clearance del glutammato nelle singole sinapsi corticostriatali in una fetta di cervello di topo. La stimolazione elettrica facilita il rilascio di glutammato nella sinapsi. Il glutammato rilasciato altera la fluorescenza della proteina del sensore, che decade nel tempo, indicando l'efficienza del rilascio e della clearance.

Analisi del rilascio e della clearance del glutammato in una singola sinapsi neuronale in una fetta di cervello di topo

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Presentiamo un protocollo per valutare l'equilibrio tra il rilascio del glutammato e l'autorizzazione alle singole sinapsi glutamatergiche corticosterogiche in fette acute di topi adulti. Questo protocollo utilizza il sensore fluorescente iGluu per il rilevamento del glutammato, una telecamera sCMOS per l'acquisizione del segnale e un dispositivo per l'illuminazione laser focale.

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Impara a stimare la durata di eliminazione del glutammato dalle membrane astrocitarie nel cervello di topo. Questo metodo elettrofisiologico offre una lettura diretta ad alta risoluzione temporale della clearance sinaptica.

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