Decellularizzazione e ricellularizzazione polmonare di primati non umani utilizzando un bioreattore specializzato per grandi organi

La decellularizzazione dell'intero organo produce scaffold biologici naturali che possono essere utilizzati per la medicina rigenerativa. Viene presentata la descrizione di un modello di rigenerazione polmonare di primati non umani in cui interi polmoni vengono decellularizzati e quindi seminati con cellule staminali adulte e cellule endoteliali in un bioreattore che facilita la circolazione vascolare e la ventilazione con mezzi liquidi.

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare matrici biologiche di interi organi dai polmoni di Reus Maccas e utilizzare queste matrici come scaffold per lo studio delle applicazioni di ingegneria dei tessuti polmonari. Ciò si ottiene decellularizzando prima i polmoni interi di Maca di Reuss con detergenti, sali ed enzimi. Il secondo passo consiste nell'installare gli scaffold polmonari decellularizzati in un bioreattore in grado sia di ventilare le vie aeree che di perfondere la vascolarizzazione polmonare con terreni di coltura cellulare liquida.

Successivamente, gli scaffold polmonari sono posizionati con le cellule staminali attraverso le vie aeree e le cellule endoteliali attraverso il sistema vascolare polmonare. La fase finale consiste nel coltivare le cellule all'interno dell'impalcatura polmonare nelle condizioni di ventilazione e perfusione fornite dal bioreattore per il periodo di tempo desiderato, seguita dall'analisi della morfologia cellulare e tissutale risultante. In definitiva, la reizzazione degli scaffold polmonari acellulari di Maca con cellule staminali e cellule endoteliali si traduce in un tessuto ingegnerizzato che imita le caratteristiche anatomiche e istologiche dei tessuti polmonari nativi.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria del tessuto polmonare, come ad esempio se le cellule staminali o progenitrici possono essere utilizzate per rigenerare il tessuto polmonare da sole o in concerto con cellule epiteliali ed endoteliali polmonari mature. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per le malattie polmonari allo stadio terminale, poiché l'analisi di matrici polmonari acellulari con cellule staminali o progenitrici derivate da pazienti ha il potenziale per aumentare il numero di polmoni donatori disponibili per il trapianto di polmone. Inoltre, i polmoni risultanti ingegnerizzati utilizzando le cellule staminali del paziente possono essere resistenti al rigetto immunitario.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo visto un video di Joe precedentemente pubblicato dai membri del laboratorio della dottoressa Laura Nicholson all'Università di Yale. Qui presentiamo le modifiche della loro procedura per i roditori per soddisfare le esigenze del nostro modello di animale di grossa taglia Resus Meac. È necessario prestare la massima attenzione per prevenire incidenti di esposizione infettiva quando si lavora con i fazzoletti di maca.

Prima di maneggiare tessuti di primati non umani, indossare dispositivi di protezione individuale tra cui maschera chirurgica, visiera, uno strato di guanti chirurgici, camice monouso e un secondo strato di guanti chirurgici con i polmoni distesi in un vassoio di dissezione, incannulare l'arteria polmonare utilizzando un connettore per esca femmina con una punta di dimensioni adeguate. Fissare la cannula in posizione con una fascetta sterilizzata con alcol. Infilare una fascetta di plastica intorno alla trachea.

Inserire un connettore femmina per esche nell'apertura tracheale e stringere la fascetta attorno all'aletta del connettore per tenere la trachea in posizione attorno all'aletta . Rimuovere l'aria intrappolata dai polmoni instillando soluzione salina tamponata con fosfato o PBS contenente 30 unità per millilitro di eparina e cinque microgrammi per millilitro di nitropressa di sodio lato. Gli SNP abbreviati consentono di espellere la soluzione per rinculo naturale prima di ripetersi.

Installazione altre due volte dopo la terza installazione delle vie aeree con la soluzione SNP PBS Heparin. Chiudere la cannula dell'esca tracheale con un tappo dell'esca. Tagliare l'apice del cuore e irrigare i ventricoli interni con PBS Eparina SNP per rimuovere il sangue residuo lacerato entrambi gli atri per facilitare il drenaggio dei circuiti polmonari dopo la perfusione.

Collegare una siringa da 60 cc riempita con la soluzione di SNP eparina PBS alla cannula dell'arteria polmonare e rimuovere con cautela lo stantuffo per consentire al liquido di fluire nel sistema vascolare. Rimuovere il tappo dalla cannula tracheale e consentire l'espulsione del fluido nelle vie aeree per rinculo naturale. Continuare la perfusione fino a rimuovere quanto più sangue possibile dal sistema vascolare polmonare.

L'aspetto più difficile della procedura è il risciacquo e il lavaggio efficaci delle vie aeree polmonari Con i liquidi, il flusso di liquidi è inibito rispetto ai gas poiché le vie aeree non sono destinate a condurre liquidi, il tempo e i pazienti sono necessari per eseguire questi passaggi, si consiglia di continuare con il protocollo, nonostante il liquido residuo rimanga nelle vie aeree man mano che la decellularizzazione progredisce e i detriti cellulari vengono espulsi, la viscosità del fluido rimarrà bassa e i polmoni saranno in grado di espellere efficacemente i liquidi il primo giorno. Immergere il blocco cuore-polmone in acqua deionizzata, gonfiare e perfondere il polmone con acqua deionizzata utilizzando siringhe da 60 cc attaccate rispettivamente alla cannula tracheale e arteriosa sommersa. Ripetere efficacemente i lavaggi delle vie aeree e vascolari con acqua deionizzata.

Altre quattro volte per un totale di cinque risciacqui da 0,5 a un litro ciascuno dopo cinque lavaggi, rimuovere i polmoni dall'acqua e immergere il blocco nella soluzione di Triton. Gonfiare e perfondere i polmoni con la soluzione di Tritone. Come prima, ripetere l'installazione una seconda volta e incubare gli organi sommersi in soluzione di Triton durante la notte a quattro gradi Celsius.

Dopo un'incubazione notturna, rimuovere il blocco polmonare dalla soluzione di Triton e lavare esternamente con acqua deionizzata. Quindi immergere il blocco in acqua fresca deionizzata. Instillare l'acqua deionizzata nella trachea e nell'arteria polmonare cinque volte per lavare via la soluzione di Triton e i detriti cellulari.

Togliere i polmoni dall'acqua deionizzata e immergerli in una soluzione di deossi coate di sodio al 2% o SDC. Gonfiare e perfondere con la soluzione SDC allo stesso modo. Immergere i polmoni in una soluzione SDC per una notte a quattro gradi Celsius il terzo giorno.

Lavare nuovamente il tessuto con acqua deionizzata esternamente e attraverso le vie aeree e il sistema vascolare cinque volte. Come prima, rimuovere il tessuto dall'acqua deionizzata e immergerlo nella soluzione di cloruro di sodio a un molare. Gonfiare e perfondere con una soluzione di cloruro di sodio come prima e immergere il tessuto in una soluzione di cloruro di sodio per un'ora a temperatura ambiente dopo aver lavato i polmoni dalla soluzione di cloruro di sodio con cinque risciacqui di acqua deionizzata.

Come prima, immergili in una soluzione di DNA fresco e instilla questa soluzione nelle vie aeree e nel sistema vascolare. Incubare i polmoni in una soluzione di DNA per un'ora a temperatura ambiente. Quindi rimuovere i polmoni dalla soluzione di DNA e lavare esternamente con la soluzione di PBS.

Immergere i polmoni in una soluzione di PBS e lavare questa soluzione cinque volte attraverso le vie aeree e il sistema vascolare. Come in precedenza, conservare i polmoni in soluzione PBS in un contenitore sigillato per una notte a quattro gradi Celsius il quarto giorno. Lavare i polmoni in una soluzione di PBS fresca e ghiacciata cinque volte attraverso le vie aeree e il sistema vascolare.

Quindi conservarli in soluzione PBS in un contenitore sterile sigillato a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Assemblare i componenti del bioreattore sotto una cappa a flusso laminare secondo lo schema. Nel protocollo di testo, riempire la camera principale con terreno di coltura che è stato bilanciato all'atmosfera al 5% di CO2 di un incubatore per colture cellulari immediatamente prima dell'uso nel bioreattore, applicare gli adattatori della cannula tracheale e vascolare alla cannula polmonare.

Installare gli organi nella camera principale del bioreattore immergendo i polmoni nel terreno di coltura e collegando gli adattatori della cannula alle porte appropriate nel coperchio modificato. Una volta collegato, fissare il coperchio in modo sicuro e stretto. La camera non verrà riaperta per tutta la durata della reazione, aspirare l'aria dal tubo utilizzando le porte della siringa e una siringa da 60 CCC dotata di un ago calibro 18 che sposta la direzionalità dei rubinetti di arresto a tre vie per dirigere il flusso di liquido nella siringa.

Spostare le camere del bioreattore sigillate e collegate in modo contiguo con gli organi installati in un incubatore per colture tissutali per bilanciare temperatura e gas. Ventilare i polmoni utilizzando una pompa a siringa collegata alla camera principale a circa un respiro completo ogni due minuti e perfondere il sistema vascolare tramite la pompa peristaltica a circa 10 millilitri al minuto per un totale di 30 minuti per la seduta delle vie aeree. Gonfiare i polmoni con la sospensione cellulare iniettando delicatamente attraverso la porta della siringa collegata al rubinetto di arresto a tre vie nel circuito di respirazione.

Tenere i polmoni staticamente a 37 gradi Celsius, 5% di CO2 durante la notte senza vie aeree o perfusione vascolare per consentire alle cellule di attaccarsi alla matrice polmonare decellularizzata. Dopo l'incubazione notturna, riavviare il programma standard di ventilazione delle vie aeree e la coltura, gli organi per tre-sette giorni per la seduta vascolare. La direzionalità del percorso del flusso può essere modificata dalla camera principale a un serbatoio di sede endoteliale ruotando la valvola sul rubinetto di arresto posizionato nel tubo che collega questi due compartimenti seminando gradualmente le cellule endoteliali utilizzando la pompa peristaltica mentre si agita delicatamente utilizzando l'agitazione magnetica quando la semina è completa.

Calpestare la perfusione e incubare staticamente per circa quattro-sei ore. Ricominciare la perfusione vascolare con il terreno della camera principale a una velocità di circa 10 millilitri al minuto. Coltura da tre a sette giorni con perfusione vascolare continua in concomitanza con il periodo di coltura della ventilazione delle vie aeree.

Durante il processo di decellularizzazione, i polmoni MCCA hanno mostrato uno sbiancamento progressivo che culmina in un aspetto traslucido alla fine del processo. Tuttavia, i polmoni hanno mantenuto le loro caratteristiche anatomiche grossolane e sono rimasti in gran parte elastici e in grado di produrre un rinculo naturale dopo il gonfiaggio con il liquido. A livello microscopico.

L'ultrastruttura istologica è rimasta intatta dopo la decellularizzazione. Cioè, bronchi, respiratori, bronchiali, sacchi alveolari. I vasi sanguigni e i capillari erano ancora distinguibili abbastanza chiaramente dalla microscopia a bassa potenza.

La microanatomia istologica, tuttavia, ha dimostrato che mentre l'anatomia macroscopica e l'ultrastruttura del polmone erano lievemente disturbati dalla decellularizzazione, il tessuto mancava completamente di cellule intatte, come si vede qui. Solo tracce di DNA sono rimaste nei tessuti decellularizzati. Inoltre, l'oligoDNA, che è stato concentrato per precipitazione alcolica e visualizzato in un gel AROS allo 0,8%, era composto per lo più da frammenti degradati a basso peso molecolare.

L'efficienza della rimozione cellulare delle proteine è stata valutata mediante analisi western blot di proteine polmonari native e decellularizzate. Lisati Utilizzando un anticorpo contro la beta actina, la beta actina è stata facilmente rilevata nei lisati polmonari nativi, ma non nei lisati polmonari decellularizzati, suggerendo che la decellularizzazione ha impoverito drasticamente le cellule e rimosso il materiale proteico associato alle cellule 14 giorni dopo la semina delle vie aeree con cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo di maca o BMC e la coltura del bioreattore con circa un ciclo di espirazione ogni due minuti. Il parenchima dei polmoni di Maca decellularizzati è stato efficacemente izzato.

Le BMC rivestivano i septi alveolari mantenendo un lume alveolare chiaro e aperto. La matrice denudata delle grandi vie aeree è stata anche inibita dalle BMC utilizzando il bioreattore, la superficie luminale di un bronco dello stelo principale è stata rivestita con un monostrato di squamoso come le BMC dopo 14 giorni di coltura. Nel bioreattore mostrato qui c'è un lobo polmonare reus decellularizzato cinque giorni dopo aver seminato il sistema vascolare con cellule endoteliali microvascolari e aver fornito una perfusione vascolare costante con terreno di coltura endoteliale a cinque millilitri al minuto.

L'analisi istologica ha rivelato cellule che rivestono il piccolo sistema vascolare nel parenchima polmonare. In alcuni casi, le cellule sembravano essere attaccate alla matrice tramite diverse proiezioni cellulari attraverso il lume, mentre altre sezioni trasversali di vasi mostravano cellule che rivestivano la superficie endoteliale con un lume chiaro. Seguendo questa procedura.

Altri metodi come l'immunoistochimica, il western blot e la PCR quantitativa in tempo reale possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come se le cellule staminali seminate si differenziano in cellule di linea polmonare una volta coltivate sulla matrice polmonare acellulare o con cellule epiteliali ed endoteliali mature all'interno del bioreattore. Dopo aver visto questo video, dovremmo avere una buona comprensione di come decellularizzare i polmoni dei primati non umani e successivamente utilizzare i polmoni acellulari risultanti come scaffold per la coltura di cellule staminali, cellule epiteliali e cellule endoteliali in un sistema di bioreattore. Non dimenticare che lavorare con tessuti di primati non umani può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale completi, tra cui una visiera e un doppio strato di lattice o nitrile.