Name: Una piattaforma basata FRET-compatibile ad alta-velocità per lidentificazione e la caratterizzazione di neurotossina botulinica di luce modulatori catena (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Scopri come identificare inibitori della catena leggera della neurotossina botulinica BoNT/A LC con un saggio FRET ad alta velocità. Questo metodo consente lo screening di grandi librerie di composti per la scoperta di farmaci.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del National Institutes of Health (AI082190 a T.J.D.) e del California Institute for Regenerative Medicine (TB1-01186 e CL1-00502).

Screening Manuale o Determinazione IC50
Questo protocollo può essere utilizzato per determinare la potenza relativa di un composto (valore IC50) preparando una serie di diluizioni del composto, o per selezionare manualmente gli inibitori di piccole molecole a una singola concentrazione.
1. Preparazione dei tamponi, dei reagenti e della strumentazione necessaria
<ol>
	<li>Preparare 50 ml di tampone per il test (40 mM HEPES, pH 7,4 e 0,01% Tween-20) e sterilizzare con filtro. Il tampone può essere conservato a temperatura ambiente (RT) per diversi mesi.</li>
	<li>Preparare una diluizione di lavoro a 70 nM di neurotossina botulinica ricombinante/catena leggera A (LC/A (1-425))17 in tampone di analisi, vorticare delicatamente e conservare su ghiaccio. Il test di ciascun composto richiede almeno 120 μl di diluizione di lavoro LC/A.</li>
	<li>Preparare una diluizione di lavoro del substrato LC BoNT/A a base di FRET da 7 μM in tampone di saggio contenente il 10% di DMSO. Inizialmente diluire una soluzione madre da 5 mM del substrato in un volume appropriato di DMSO al 100%, quindi aggiungere lentamente (goccia a goccia) il tampone del saggio mescolando delicatamente. Avvolgere in un foglio e conservare sul ghiaccio. L'analisi di ciascun composto richiede almeno 130 μl di diluizione di lavoro del substrato.</li>
	<li>Configurare un lettore di piastre per microtitolazione a fluorescenza in modo che agiti la piastra a velocità media per 10 secondi, quindi monitorare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 490 nm e 523 nm, rispettivamente, ogni 5 minuti (modalità cinetica) per 90 minuti a RT. Si noti che la formazione del prodotto (cioè l'aumento della fluorescenza) è lineare durante questo periodo di tempo (Figura 1A).</li>
</ol>
2. Preparazione della serie di diluizione composta
<ol>
	<li>Determinare l'intervallo di concentrazione del composto (cioè il numero di diluizioni nella serie di diluizione e il fattore di diluizione); l'intervallo di concentrazione viene scelto in base al valore IC50 previsto per garantire un adattamento ottimale della curva. Per i composti con IC50 sconosciuto, utilizzare il brodo non diluito come concentrazione massima del composto.</li>
	<li>Etichettare le provette con il nome e la concentrazione del composto appropriati.</li>
	<li>Aliquotare 100% DMSO su tutte le provette per prepararle alla diluizione seriale del composto. Si raccomanda un volume di diluizione finale minimo di 2 μl, dove viene utilizzato 1 μl di ciascuna concentrazione per pozzetto nella piastra di analisi. Ad esempio, una serie di diluizione standard 1:3 richiede la miscelazione di 2 μl di composto con 4 μl di DMSO per provetta.</li>
	<li>Preparare diluizioni seriali di composti e vortice o miscelare accuratamente manualmente tra una diluizione e l'altra; sostituire i puntali delle pipette tra una diluizione e l'altra. Per la serie di diluizione standard 1:3, aggiungere 2 μl del composto non diluito a 4 μl di DMSO nella prima provetta della serie di diluizione e mescolare bene. Con un nuovo puntale della pipetta, rimuovere 2 μl della prima diluizione e aggiungere 4 μl di DMSO nella seconda provetta; Mescolate bene. Ripetere per le diluizioni rimanenti. Assicurati di mescolare bene le diluizioni dei composti per assicurarti che le concentrazioni dei composti siano accurate.</li>
	<li>Coprire i tubi del composto e mettere da parte a RT.</li>
</ol>
3. Preparazione e spotting delle piastre (Tabella 1)
<ol>
	<li>Ottenere una piastra nera a 96 pozzetti, opaca a fondo piatto. Vedere la configurazione consigliata della piastra nella Tabella 1, dove ogni serie di diluizione del composto è formattata in file di una piastra a 96 pozzetti. Erogare manualmente 1 μl della rispettiva diluizione del composto direttamente sul fondo di ciascun pozzetto corrispondente (pozzetti 1-9). Erogare 1 μl della massima concentrazione di composto da testare fino al pozzetto 11 (controllo della fluorescenza intrinseca del composto).</li>
	<li>Erogare manualmente 1 μl di un potente inibitore noto al pozzetto 12 (controllo positivo) e 1 μl di DMSO al 100% al pozzetto 10 (controllo negativo).</li>
	<li>Con un pipettatore automatizzato, erogare 79 μl di tampone del saggio a lato dei pozzetti 1-10 e 12 (diluizioni del composto e controllo positivo) e 89 μl a lato del pozzetto 11 (controllo della fluorescenza intrinseca del composto). Assicurati di non toccare la punta sul fondo del pozzetto dove è presente il composto in modo da non contaminare i pozzetti. </li>
	<li>Agitare la diluizione di lavoro LC/A e utilizzare un pipettatore automatizzato per aggiungere 10 μl sul lato di ciascun pozzetto, ad eccezione del pozzetto 11 (controllo della fluorescenza intrinseca del composto). Picchiettare delicatamente la piastra per assicurarsi che tutto l'enzima aggiunto vada sul fondo del pozzetto.</li>
	<li>Mescolare, coprire e incubare delicatamente la piastra per 5 minuti a RT. Questa incubazione fornisce una fase di pre-equilibrio per i composti per legarsi alla LC/A prima dell'aggiunta del substrato.</li>
</ol>
4. Aggiunta di substrato e misurazione della fluorescenza
<ol>
	<li>Agitare delicatamente il substrato BoNT/A LC e, utilizzando un pipettatore automatico, aggiungere 10 μl di substrato sull'altro lato di ciascun pozzetto. Assicurati di aggiungere il substrato sul lato del pozzetto opposto a quello in cui l'enzima è stato aggiunto in precedenza.</li>
	<li>Picchiettare delicatamente la piastra per miscelare i reagenti, inserirla immediatamente nel lettore di piastre e iniziare la misurazione della fluorescenza con le impostazioni precedentemente specificate al punto 1.4.</li>
	<li>Le velocità enzimatiche sono calcolate dalla pendenza della linea generata rappresentando graficamente l'unità di fluorescenza relativa (RFU) rispetto al tempo durante il periodo lineare della reazione.</li>
</ol>
Tabella 1.Layout suggerito della piastra di analisi.
<bordo della tabella="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Bene #</th>
			<th>Descrizione del pozzo</th>
			<th>composto</th>
			<th>Tampone per saggi</th>
			<th>substrato</th>
			<th>Lc</th>
			<th>Dmso</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Dose composta 1</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl </td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero arabo</td>
			<td>Dose composta 2</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Dose composta 3</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Dose composta 4</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Dose composta 5</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Dose composta 6</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Dose composta 7</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>Dose composta 8</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Dose composta 9</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Controllo negativo 
			(100% attività LC)</td>
			<td>---</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Controllo della fluorescenza intrinseca del composto</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>89 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>Controllo positivo 
			(0% attività LC)</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Operazione automatizzata per la vagliatura ad alto rendimento
5. Preparazione di tamponi, reagenti, piastre composte, codici a barre e strumentazione necessaria
<ol>
	<li>Scongelare le piastre di pasta sigillate a temperatura ambiente per almeno 1 ora.</li>
	<li>Preparare 500 ml (o più, a seconda del numero di composti da analizzare) del tampone del saggio (40 mM HEPES, pH 7,4 e 0,01% Tween-20) e sterilizzare con filtro. Il tampone filtrato può essere conservato in RT per diversi mesi.</li>
	<li>Preparare una diluizione di lavoro di 8,75 nM di BoNT/A LC ricombinante (1-425) in tampone di saggio, vortice e conservare su ghiaccio. Ogni pozzetto in una piastra a 384 pozzetti a basso volume richiede 8 μl. Preparare un eccesso del 10-15%, ovvero circa 3,7 ml o ogni piastra a 384 pozzetti a basso volume.</li>
	<li>Preparare una diluizione di lavoro del substrato LC BoNT/A a base di FRET da 3,5 μM in un tampone di saggio contenente il 10% di DMSO. Inizialmente diluire la soluzione madre da 5 mM del substrato direttamente nel volume appropriato di DMSO al 100%, quindi aggiungere lentamente (goccia a goccia) il tampone del saggio mescolando delicatamente. Avvolgere in un foglio e conservare sul ghiaccio. Ogni pozzetto in una piastra a 384 pozzetti a basso volume richiede 2 μl. Preparare un eccesso del 10-15%, o circa 1 ml per ogni piastra a 384 pozzetti a basso volume.</li>
	<li>Preparare i codici a barre per ogni piastra per microtitolazione nera a 384 pozzetti a basso volume [piastra di analisi] e far aderire l'etichetta direttamente al lato della piastra in modo che lo scanner di codici a barre possa leggerla; assicurarsi che l'etichetta non si estenda oltre il lato della piastra, altrimenti potrebbe interferire con la manipolazione e l'impilamento delle piastre. Impilate i piatti in ordine numerico e mettete da parte. Coprire la piastra superiore. Si noti che questo passaggio è facoltativo, ma facilita il tracciamento dei risultati dei composti corrispondenti quando vengono utilizzate più piastre.</li>
	<li>Centrifugare le piastre di pasta scongelate e sigillate a 200 x g per 30 secondi a RT. Rimuovere con cautela il sigillo della piastra, assicurarsi di rimuovere l'adesivo rimanente e coprire la piastra con un coperchio di plastica pulito per evitare l'evaporazione. Si noti che se è presente dell'adesivo sulla superficie della piastra, potrebbe interferire con il trasferimento automatico del coperchio e l'impilamento delle piastre. Posizionare la piastra coperta in un hotel collegato al gestore del liquido. Non tenere le piastre scoperte o si verificherà l'evaporazione.</li>
	<li>Configura un lettore di piastre per microtitolazione a fluorescenza impilate per leggere la fluorescenza di ciascuna piastra di saggio a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 490 nm e 523 nm, rispettivamente, ogni 30 minuti (modalità cinetica) per 3-6 cicli a RT.</li>
</ol>
6. Preparazione dello strumento Pin
<ol>
	<li>Ispezionare visivamente l'utensile a perno con testa 384 per eventuali anomalie, tra cui deformazioni, scheggiature o detriti di grandi dimensioni.</li>
	<li>Riempire tre vassoi separati con circa 1 pollice di metanolo al 100% (grado HPLC), isopropanolo al 100% (grado HPLC) e soluzione per la pulizia degli utensili a spillo diluita in acqua ultrapura.</li>
	<li>Riempire la stazione di pulizia di un dispositivo di movimentazione liquidi con DMSO al 100%.</li>
	<li>Impila 2-3 pezzi di carta assorbente nuova e pulita in un vassoio. È importante calibrare il robot sull'asse z in modo che i perni entrino in contatto con la carta assorbente, ma non la forino.</li>
	<li>Fissare un attacco a ventola all'area di lavoro per asciugare i perni dopo il lavaggio.</li>
	<li>Collegare lo strumento a spillo al braccio robotico del gestore di liquidi e prepulire i perni immergendoli in DMSO, asciugandoli su carta assorbente, immergendoli per 2 minuti in una soluzione detergente, asciugandoli su carta assorbente, immergendoli in isopropanolo, asciugandoli su carta assorbente, immergendoli in metanolo, asciugandoli su carta assorbente e infine asciugandoli sulla ventola.</li>
</ol>
7. Preparazione del distributore di liquidi a basso volume
<ol>
	<li>Collegare una cassetta a basso volume (1-10 μl) all'erogatore di liquidi e collegare una linea di scarico a un recipiente appropriato.</li>
	<li>Ispezionare visivamente gli ugelli di erogazione della cassetta e verificare che non siano deformati, strappati o ostruiti. È importante mantenere puliti i canali e gli ugelli poiché le precipitazioni o i detriti influenzeranno la distribuzione del liquido.</li>
	<li>Adescare i canali facendo scorrere 30 ml di acqua ultrapura, 30 ml di etanolo al 70%, quindi 30 ml di acqua ultrapura direttamente nel recipiente dei rifiuti.</li>
	<li>Posizionare una piastra di dosaggio a 384 pozzetti a basso volume nell'erogatore di liquidi e aggiungere un volume noto di acqua a ciascun pozzetto. Ispezionare visivamente per assicurarsi che ogni pozzetto riceva il volume corretto e che non vi siano fuoriuscite o erogazioni di soluzione tra i pozzetti.</li>
	<li>Adescare i tubi con aria per circa 5 secondi per rimuovere l'acqua e asciugare i canali.</li>
</ol>
8. Erogazione della catena leggera BoNT/A nella piastra di analisi
<ol>
	<li>Immergere la linea di aspirazione dell'erogatore di liquidi nella soluzione di lavoro BoNT/A LC, adescare per rimuovere l'aria ed erogare 8 μl in ciascun pozzetto di una piastra di saggio a 384 pozzetti a basso volume. Si noti che le piastre possono essere posizionate manualmente sull'area di lavoro del gestore di liquidi o posizionate e riimpilate automaticamente utilizzando un hotel di piastre collegato.</li>
	<li>Coprire ogni piastra con un coperchio di plastica pulito e impilarla in una colonna diversa dell'hotel per piastre attaccata al gestore di liquidi. Non tenere le piastre non sigillate o si verificherà l'evaporazione.</li>
	<li>Pulire l'erogatore del liquido facendo scorrere 30 ml di acqua ultrapura, 30 ml di etanolo al 70%, 30 ml di acqua ultrapura direttamente nel recipiente dei rifiuti.</li>
	<li>Adescare i tubi con aria per circa 5 secondi per asciugare i canali.</li>
</ol>
9. Stampaggio di composti nella piastra di saggio
<ol>
	<li>Assegnate le aree sulla piattaforma di movimentazione dei liquidi per le piastre composte, le piastre di analisi e i contenitori con soluzioni detergenti.</li>
	<li>Programmare il gestore dei liquidi in modo che posizioni le piastre composte e le piastre di analisi nelle posizioni designate e rimuova i coperchi delle piastre prima della stampa.</li>
	<li>Tamponare 50 nl del composto direttamente nella piastra di analisi contenente 8 μl di BoNT/A LC. Durante la calibrazione del programma di stampaggio, assicurarsi che i perni siano sommersi, ma non graffiare il fondo della piastra di analisi. Si noti che l'aggiunta di composti nel DMSO al 100% può creare una zona locale di denaturazione enzimatica durante la dispersione. Pertanto, occorre prestare attenzione a valutare il livello di denaturazione enzimatica confrontando il solo controllo con DMSO con il controllo non trattato (cioè enzima senza aggiunta di DMSO).</li>
	<li>Pulire i perni dopo ogni piastra immergendoli nel DMSO, asciugandoli su carta assorbente, immergendoli in isopropanolo, asciugandoli su carta assorbente, immergendoli nel metanolo, asciugandoli su carta assorbente e infine asciugandoli sulla ventola.</li>
	<li>Dopo che i composti sono stati stampati nella piastra di analisi con l'enzima, impilare separatamente le piastre di composti stock e le piastre di analisi. Coprire la piastra del saggio superiore nella pila per evitare l'evaporazione e metterla da parte. Assicurati di incubare LC con composti per almeno 5 minuti a RT; Tempi di incubazione più lunghi possono essere utilizzati quando si timbra un gran numero di piastre.</li>
</ol>
10. Erogazione del substrato nella piastra di analisi
<ol>
	<li>Immergere la linea di aspirazione del gestore di liquidi nella soluzione di lavoro del substrato BoNT/A LC e proteggere dalla luce. Controllare gli ugelli di erogazione per assicurarsi che siano asciutti e non ostruiti. Adescare i canali per rimuovere tutte le bolle d'aria.</li>
	<li>Disimpilare le piastre del saggio ed erogare 2 μl di diluizione di lavoro del substrato in ciascun pozzetto. Verificare che il substrato venga erogato direttamente in ogni pozzetto. Impilare le piastre e posizionare una piastra di saggio vuota sopra la prima piastra e una piastra vuota sotto la piastra inferiore della pila per evitare l'evaporazione durante la lettura e il reimpilamento nel lettore di piastre.</li>
</ol>
11. Misure di fluorescenza
<ol>
	<li>Caricare immediatamente la pila di piastre di analisi in un lettore di piastre a fluorescenza.</li>
	<li>Iniziare la misurazione della fluorescenza con le impostazioni precedentemente specificate al punto 5.7. La velocità di analisi per ciascun composto è calcolata da un grafico dell'unità di fluorescenza relativa (RFU) nel tempo. Si noti che è importante includere un controllo negativo (DMSO) per ottenere un tasso disinibito; A ciascuna piastra può essere aggiunto anche un controllo positivo con un inibitore noto. Nella Figura 2 viene illustrato un output rappresentativo da un singolo punto temporale.</li>
</ol>
12. Pulizia
<ol>
	<li>Sigillare ogni piastra di stoccaggio composta con un foglio di alluminio utilizzando un rullo e conservare a -80 °C.</li>
	<li>Dopo la lettura di ciascuna piastra di analisi, eliminare le piastre, eventuali LC/A rimanenti o diluizioni del substrato nei rifiuti a rischio biologico.</li>
</ol>

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<li>Eubanks, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+and+in+vivo+disconnect+uncovered+through+high-throughput+identification+of+botulinum+neurotoxin+A+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2602-2607 (2007).</li>
<li>Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+botulinum+neurotoxin+type+A+light+chain+contributes+to+solubility%2C+catalysis%2C+and+stability.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability.</a> Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+discovery+of+potent+inhibitors+of+botulinum+neurotoxin+A%3A+development+of+a+robust+LC+MS+based+assay+operational+from+low+to+subnanomolar+enzyme+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations.</a> Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).</li>
<li>Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+proteins+as+enhanced+FRET-based+substrates+for+botulinum+neurotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity.</a> Toxicon. 53, 392-399 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio di LC BoNT/A basato su FRET qui descritto rappresenta un metodo interessante per identificare e caratterizzare piccole molecole che modulano l'attività di LC BoNT/A. La natura basata sulla soluzione del test rende questo protocollo suscettibile di screening ad alto rendimento descritto nella sezione Funzionamento automatizzato del testo del protocollo. Il fattore Z viene spesso utilizzato per determinare l'idoneità di un test per le campagne HTS18. Determinato come Z = 1 - 3 (σp + σn<...

La neurotossina botulinica A (BoNT/A), la tossina più potente attualmente conosciuta (LD50 ~1 ng/kg)1, è una potente neurotossina prodotta dal batterio Clostridium botulinum. All'interno di un ospite affetto, BoNT/A interrompe la neurotrasmissione alla giunzione neuromuscolare legando i motoneuroni, internalizzandosi nel citosol e, infine, scindendo le proteine neuronali che sono essenziali per l'esocitosi dell'acetilcolina. Una volta all'interno di un neurone, la BoNT/A può persistere fino a diversi mesi2. L'inibizione a lungo termine del rilascio di acetilcolina ostacola la normale contrazione muscolare e provoca una paralisi flaccida che, nei casi più gravi, può provocare insufficienza cardiaca e/o respiratoria. A causa della sua estrema potenza, facilità di produzione ed effetti a lungo termine all'interno dell'ospite, il CDC ha etichettato tutti i sierotipi di BoNT come agenti di bioterrorismo ad alto rischio.
Il meccanismo d'azione della tossina coinvolge numerosi passaggi, tra cui il legame con i recettori della superficie neuronale, l'assorbimento cellulare tramite endocitosi mediata dal recettore e la traslocazione nel citosol neuronale. La BoNT/A è composta da due catene, una pesante e una leggera, ed entrambe le catene sono necessarie per la tossicità. La catena pesante (HC) contiene domini di legame e traslocazione, mentre la catena leggera (LC) è una metalloproteasi zinco-dipendente che trasloca dall'endosoma al citoplasma. Una volta all'interno del citosol, la metalloproteasi LC/A si localizza nella membrana citoplasmatica interna e scinde la proteina ospite legata alla membrana SNAP-25. SNAP-25 è un membro della famiglia di proteine SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor), che svolge un ruolo cruciale nell'esocitosi dell'acetilcolina (rivista nel riferimento3). La scissione LC/A di SNAP-25 compromette la funzione del complesso SNARE, che inibisce il rilascio del neurotrasmettitore aceticolina e compromette la contrazione muscolare.
Attualmente, il trattamento per il botulismo è limitato e spesso include la somministrazione di un anticorpo neutralizzante equino4; tuttavia, poiché la tossina viene rapidamente internalizzata nei neuroni, l'anticorpo ha una finestra temporale di somministrazione ristretta. Pertanto, molti ricercatori ritengono che il BoNT/A LC possa essere un bersaglio terapeutico migliore. Poiché la LC è una metalloproteasi zinco-dipendente, un approccio per inibire l'attività della LC/A è stato quello di sviluppare composti che chelano lo ione zinco del sito attivo. Ad esempio, i composti idrossimati chelano lo zinco nel sito attivo e hanno un'eccellente potenza in vitro (Ki del miglior inibitore di piccole molecole BoNT/A LC fino ad oggi è 77 nM)5. Tuttavia, molte piccole molecole non riescono a progredire come terapie a causa di vari problemi ex vivo o in vivo, tra cui scarsa solubilità acquosa, metabolismo rapido e/o elevata citotossicità. Pertanto, sono necessari nuovi composti con proprietà farmacologiche e farmacocinetiche migliorate. L'identificazione di composti di piccole molecole spesso comporta lo screening ad alto rendimento (HTS) per identificare nuovi scaffold. I metodi iniziali per lo screening dell'attività della LC BoNT/A si basavano sul rilevamento HPLC della scissione corta del substrato peptidico, che richiede molto tempo e non è suscettibile di applicazioni HTS6-8. Successivamente, Schmidt e colleghi9 hanno sviluppato un test di attività LC BoNT/A ad alto rendimento che utilizza un substrato peptidico marcato con fluoresceina attaccato in modo covalente a una piastra per microtitolazione. Il BoNT/A LC scinde il substrato e rilascia fluoresceina, che può essere quantificata con un fluorimetro. Il formato a piastra di questo test consente di eseguire lo screening simultaneo di numerosi composti; Tuttavia, il test richiede l'etichettatura di peptidi sintetici con fluoresceina e il rivestimento delle piastre del saggio con molecole di substrato derivatizzate, che sono tecniche ingombranti. Un metodo molto più semplice per rilevare l'attività di BoNT/A LC a basse concentrazioni è stato successivamente descritto da Schmidt et al., in cui una serie di substrati fluorogenici sono stati utilizzati per monitorare l'attività di BoNT LC in tempo reale10. Ulteriori tecniche descritte in letteratura includono un saggio basato sul trasferimento di energia di depolarizzazione dopo risonanza per rilevare e quantificare l'attività di BoNT negli estratti grezzi; questo metodo può essere utilizzato per applicazioni ad alto rendimento10,11, sebbene richieda apparecchiature sofisticate per misurare il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET) e i segnali di polarizzazione. Infine, sono stati riportati diversi modelli cellulari per l'intossicazione da BoNT (esaminati nel riferimento11) che consentiranno ai ricercatori di studiare le proprietà spesso limitanti dei composti precedentemente menzionati, tra cui citotossicità, permeabilità cellulare e stabilità. Tuttavia, la maggior parte dei saggi basati su cellule esistenti non sono suscettibili di HTS e richiedono lavoro e tempo.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per un metodo HTS che utilizza il substrato LC BoNT/A basato su FRET disponibile in commercio. Il substrato si basa sulla sequenza di scissione SNAP-25 ed è un peptide sintetico 13-mer che contiene un fluoroforo terminale e un quencher. La scissione BoNT/A separa il fluoroforo e il quencher, abolendo il FRET e aumentando la fluorescenza misurata, che può essere misurata continuamente in un lettore di piastre fluorimetriche. Il test viene utilizzato di routine nei nostri laboratori, così come in altri laboratori, per identificare nuove classi di inibitori della LC BoNT/A o per determinare la potenza relativa di composti precedentemente identificati5,12-15. Questo test è adatto per l'HTS grazie alla sua semplicità, al potenziale di automazione, al basso costo dei materiali e alla capacità di esaminare numerosi composti contemporaneamente (vedi riferimento16; Caglič et al., presentato; Bompiani et al., in preparazione). Oltre all'HTS, questo test può essere utilizzato per confrontare la potenza relativa dei composti determinando il valore IC50 (concentrazione necessaria per inibire il 50% dell'attività di BoNT/A LC) di un composto. Il test può essere eseguito manualmente in un formato a 96 pozzetti (sezione Screening manuale del testo del protocollo) o può essere automatizzato in un formato a 384 pozzetti per HTS (sezione Automated Operation del testo del protocollo).

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Teknova</td><td>H1021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (grado HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo (grado HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Piastra per saggio nera</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>384 pozzetti Piastra per test nera a basso volume</td><td>Greiner</td><td>788076</td><td></td></tr><tr><td>substrato SNAPtide FITC/Dabcyl</td><td>Elenco Laboratori</td><td>biologici 521</td><td>Substrato BoNT/A LC a base di FRET</td></tr> Soluzione <tr><td>per la pulizia dei perni</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 110</td><td></td></tr><tr><td>Carta assorbente priva di lanugine</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 540DB</td><td></td></tr><tr><td>Biomek Seal e campione Coperchi in foglio di alluminio</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

una piattaforma basata fret-compatibile ad alta-velocità per l&#39;identificazione e la caratterizzazione di neurotossina botulinica di luce modulatori catena

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

La neurotossina botulinica (BoNT) è una tossina batterica potente e potenzialmente letale che si lega ai motoneuroni ospiti, viene internalizzata nella cellula e slega le proteine intracellulari che sono essenziali per il rilascio dei neurotrasmettitori. La BoNT è composta da una catena pesante (HC), che media il legame e l'internalizzazione della cellula ospite, e da una catena leggera (LC), che scinde le proteine dell'ospite intracellulare essenziali per il rilascio di acetilcolina. Mentre le terapie che inibiscono il legame/internalizzazione della tossina hanno una finestra temporale di somministrazione ridotta, i composti che mirano all'attività intracellulare della LC hanno una finestra temporale di somministrazione molto più ampia, particolarmente rilevante data l'emivita estremamente lunga della tossina. Negli ultimi anni, le piccole molecole sono state ampiamente analizzate come potenziali inibitori della LC sulla base della loro aumentata permeabilità cellulare rispetto a terapie più grandi (peptidi, aptameri, ecc.). L'identificazione dei lead spesso comporta lo screening ad alto rendimento (HTS), in cui vengono esaminate grandi librerie di piccole molecole in base alla loro capacità di modulare la funzione del bersaglio terapeutico. Qui descriviamo un saggio basato su FRET con un substrato commerciale di LC BoNT/A e LC ricombinante che può essere automatizzato per HTS di potenziali inibitori di BoNT. Inoltre, descriviamo una tecnica manuale che può essere utilizzata per lo screening secondario di follow-up o per confrontare la potenza di diversi composti candidati.

Il saggio basato su FRET per la BoNT/A LC può essere eseguito manualmente in modo a bassa capacità per caratterizzare inibitori noti o per esaminare piccole librerie; in alternativa, il protocollo può essere ridotto e automatizzato per schermature ad alta capacità (HTS) con librerie ampie, al fine di identificare nuovi inibitori della BoNT/A LC. Indipendentemente dall'approccio adottato, si dovrebbe osservare un aumento della fluorescenza nel tempo quando la BoNT/A LC viene incubata con il substrato (Figura 1A</s...

La catena leggera della neurotossina botulinica di tipo A (BoNT/A LC) è una metalloproteasi che entra nei motoneuroni, slega il suo substrato SNAP-25 e interrompe la neurotrasmissione, provocando così una paralisi flaccida. Utilizzando un saggio basato su FRET compatibile con ad alto rendimento, è possibile eseguire lo screening di grandi librerie di piccole molecole per verificarne l'impatto sull'attività enzimatica del LC BoNT/A.

Una piattaforma basata FRET-compatibile ad alta-velocità per l&#39;identificazione e la caratterizzazione di neurotossina botulinica di luce modulatori catena

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare piccole molecole per la neurotossina botulinica, un'inibizione delle catene leggere. Ciò si ottiene preparando prima una serie di diluizione del composto con elevata accuratezza e precisione. Il secondo passo consiste nel trasferire le diluizioni del composto in una piastra nera a 96 pozzetti.Successivamente, l'enzima a catena leggera diluito viene aggiunto alla piastra e l'enzima viene incubato con il composto per cinque minuti a temperatura ambiente. La fase finale è l'aggiunta del substrato di fret a catena leggera per avviare la reazione, che viene monitorata con un lettore di piastre a fluorescenza. In definitiva, dovrebbero essere impiegati schermi secondari che utilizzano un substrato peptidico non fluorescente per confermare l'attività del composto e determinare costanti cinetiche più rigorose come la costante di dissociazione dell'inibitore o ki.Il vantaggio principale di questo test rispetto ai metodi esistenti, come quelli basati su HPLC o su cellule, è che è semplice da eseguire, facilmente automatizzato e può essere utilizzato per confrontare la potenza relativa di un certo numero di composti. Gli individui possono avere difficoltà quando sono nuovi a questo metodo quando preparano una serie di diluizioni composte e mescolano correttamente la piastra una volta aggiunti tutti i componenti. Iniziare questa procedura preparando i tamponi e i reagenti come descritto nel protocollo di testo.Configurare il lettore di piastre per agitare la piastra a velocità media per 10 secondi, quindi per monitorare la fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 490 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 523 nanometri ogni cinque minuti in modalità cinetica per un'ora e 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver determinato l'intervallo di concentrazione del composto, etichettare le provette con il nome e la concentrazione del composto appropriati, Eloqua, 100% dimetilsulfo ossido o DMSO su tutte le provette per prepararle per la diluizione dei cereali composti. Successivamente, preparare la diluizione seriale dei composti per le serie standard da una a tre diluizioni.Aggiungere due microlitri di composto non diluito a quattro microlitri di DMSO nella prima provetta della serie di diluizione e mescolare bene con un nuovo puntale per pipetta. Rimuovere due microlitri della prima diluizione e aggiungere a quattro microlitri di DMSO nella seconda miscela di provette. Ripetere bene per le diluizioni rimanenti.Assicurati di mescolare bene le diluizioni dei composti per assicurarti che le concentrazioni dei composti siano accurate. Coprire le provette del composto e metterle da parte A temperatura ambiente, ottenere una piastra a fondo piatto, nera opaca a 96 pozzetti. Utilizzando la configurazione della piastra consigliata che si trova nel protocollo di testo.Erogare manualmente un microlitro della rispettiva diluizione del composto direttamente sul fondo di ciascun pozzetto corrispondente per i pozzetti da uno a nove, erogare un microlitro della più alta concentrazione di composto da testare nel pozzetto.11. Per fungere da controllo della fluorescenza intrinseca del composto. Questo controllo serve a determinare se i composti stessi sono fluorescenti e/o influenzano l'idrolisi del substrato.Erogare manualmente un microlitro di un potente inibitore noto al pozzetto, 12 come controllo positivo e un microlitro di DMSO al 100% al pozzetto. 10 come controllo negativo con un pipettatore automatizzato. 79 microlitri di tampone di saggio a lato dei pozzetti, uno a 10 e 12 e 89 microlitri a lato del pozzetto, 11.Assicurarsi di non toccare la punta sul fondo del pozzetto dove è presente il composto per evitare la contaminazione incrociata dei pozzetti. Vortex, l'enzima a catena leggera diluito, e utilizzare un pipettatore automatico per aggiungere 10 microlitri dell'enzima sul lato di ciascun pozzetto, ad eccezione del pozzetto 11. Picchiettare delicatamente la piastra per assicurarsi che il volume totale dell'enzima aggiunto vada sul fondo del pozzetto, mescolare, coprire e incubare delicatamente la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente.Questa incubazione fornisce una fase di equilibrio preliminare per i composti per legarsi alla catena leggera. Prima dell'aggiunta del substrato, agitare delicatamente la neurotossina botulinica, un substrato a catena leggera. Quindi, utilizzando una pipetta automatica, aggiungere 10 microlitri di substrato sul lato di ciascuno.Beh, assicurati di aggiungere il substrato sul lato del pozzetto opposto a dove l'enzima è stato aggiunto in precedenza. Picchiettare delicatamente la piastra per miscelare immediatamente i reagenti. Posizionare la piastra in un lettore di piastre per microtitolazione a fluorescenza e iniziare il programma precedentemente configurato.Al termine del programma, calcolare le velocità enzimatiche rappresentando graficamente l'unità di fluorescenza relativa rispetto al tempo e calcolando la pendenza della linea durante il periodo lineare della reazione. Prepararsi per il funzionamento automatizzato per lo screening ad alto rendimento come descritto nel protocollo di testo, Dimostrare una parte del protocollo di screening ad alto rendimento sarà de giovane un postdoc nel mio laboratorio. Mostrerà come i composti vengono trasferiti nelle piastre per lo screening ad alta produttività utilizzando apparecchiature di automazione di laboratorio Dopo aver dispensato la neurotossina botulinica diluita, un enzima a catena leggera, nella piastra del test.Assegnate le aree sulla piattaforma di movimentazione dei liquidi per le piastre composte, le piastre di analisi e i contenitori con soluzioni detergenti. Programmare il gestore dei liquidi in modo che posizioni le piastre composte e le piastre di analisi nelle posizioni designate e rimuova i coperchi delle piastre prima della stampa. Calibrare il software del programma di stampaggio e assicurarsi che i perni di stampaggio siano immersi ma non graffino il fondo della piastra di analisi.Timbro 50 nanolitri del composto direttamente nella piastra del saggio contenente otto microlitri di neurotossina botulinica. Una catena leggera. Pulire i perni dopo ogni piastra immergendoli nel DMSO e poi asciugandoli su carta assorbente e ripetendo questo processo con isopropanolo e metanolo.Infine, asciugare i perni sopra la ventola dopo che i composti sono stati stampati nelle piastre di saggio con l'enzima. Separatamente, impilare le piastre dei composti di riserva e le piastre di analisi coprire la piastra di analisi superiore della pila per evitare l'evaporazione e metterle da parte. Assicurati di incubare la catena leggera con composti per almeno cinque minuti a temperatura ambiente.Tempi di incubazione più lunghi possono essere utilizzati quando si timbra un gran numero di piastre. Infine, erogare il substrato nelle piastre di analisi e misurare la fluorescenza come descritto nel protocollo di testo. Sia che si esegua il test della neurotossina botulinica a base di fret in un saggio a bassa o alta produttività, si dovrebbe osservare un aumento della fluorescenza nel tempo quando la neurotossina botulinica, una catena leggera, viene incubata con il substrato.Se vengono testate diluizioni seriali di un composto, spesso si ottiene una serie di linee con pendenze variabili. Qui. La concentrazione finale di un composto a base di idrossiato è elencata in unità micromolari. Bene, 10 nel layout della targa qui descritto funge da controllo negativo in cui viene aggiunto solo il veicolo.La velocità di questa reazione è definita come 100% di attività enzimatica e le velocità in presenza di composto possono essere normalizzate a questa velocità per ottenere la velocità relativa o l'inibizione percentuale. Quando il test viene eseguito con diluizioni seriali di un composto, è possibile utilizzare un grafico della velocità della reazione rispetto alla concentrazione dell'inibitore per determinare la concentrazione inibitoria semimassima o IC 50. L'intervallo di diluizione deve essere scelto in modo che il grafico appaia a forma di sigma per un adattamento ottimale della curva.Il valore IC 50 è una misura relativa della potenza, meglio descritta come un valore KI apparente, in quanto dipende dalla concentrazione dell'enzima presente nel test. Questo valore può quindi essere utilizzato per confrontare e classificare la potenza di diversi composti, se testati. Parallelamente, una corretta miscelazione della piastra dopo l'aggiunta di ciascun componente è fondamentale per ottenere un aumento lineare regolare della fluorescenza nel tempo, necessario per determinare con precisione le velocità iniziali.Questo grafico mostra un esperimento rappresentativo in cui la miscelazione è stata insufficiente e il tasso di formazione del prodotto non è lineare nel tempo. Una volta padroneggiata questa tecnica, può essere eseguita in meno di due ore per un massimo di otto composti. Dopo questo esperimento, altri saggi possono essere eseguiti con substrati peptidici non fluorescenti per confermare che i composti inibiscono la neurotossina botulinica, la catena leggera e l'attività somatica.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la potenza relativa degli inibitori delle catene leggere della neurotossina botulinica. Il protocollo è stato realizzato in tre fasi. Innanzitutto, la preparazione di una serie di diluizioni composte.In secondo luogo, l'aggiunta di un enzima a catena leggera ricombinante e, in terzo luogo, l'aggiunta di un substrato fluorescente e la successiva misurazione su un lettore di piastre fluorescenti.

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