Una piattaforma basata FRET-compatibile ad alta-velocità per l'identificazione e la caratterizzazione di neurotossina botulinica di luce modulatori catena

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare piccole molecole per la neurotossina botulinica, un'inibizione delle catene leggere. Ciò si ottiene preparando prima una serie di diluizione del composto con elevata accuratezza e precisione. Il secondo passo consiste nel trasferire le diluizioni del composto in una piastra nera a 96 pozzetti.

Successivamente, l'enzima a catena leggera diluito viene aggiunto alla piastra e l'enzima viene incubato con il composto per cinque minuti a temperatura ambiente. La fase finale è l'aggiunta del substrato di fret a catena leggera per avviare la reazione, che viene monitorata con un lettore di piastre a fluorescenza. In definitiva, dovrebbero essere impiegati schermi secondari che utilizzano un substrato peptidico non fluorescente per confermare l'attività del composto e determinare costanti cinetiche più rigorose come la costante di dissociazione dell'inibitore o ki.

Il vantaggio principale di questo test rispetto ai metodi esistenti, come quelli basati su HPLC o su cellule, è che è semplice da eseguire, facilmente automatizzato e può essere utilizzato per confrontare la potenza relativa di un certo numero di composti. Gli individui possono avere difficoltà quando sono nuovi a questo metodo quando preparano una serie di diluizioni composte e mescolano correttamente la piastra una volta aggiunti tutti i componenti. Iniziare questa procedura preparando i tamponi e i reagenti come descritto nel protocollo di testo.

Configurare il lettore di piastre per agitare la piastra a velocità media per 10 secondi, quindi per monitorare la fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 490 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 523 nanometri ogni cinque minuti in modalità cinetica per un'ora e 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver determinato l'intervallo di concentrazione del composto, etichettare le provette con il nome e la concentrazione del composto appropriati, Eloqua, 100% dimetilsulfo ossido o DMSO su tutte le provette per prepararle per la diluizione dei cereali composti. Successivamente, preparare la diluizione seriale dei composti per le serie standard da una a tre diluizioni.

Aggiungere due microlitri di composto non diluito a quattro microlitri di DMSO nella prima provetta della serie di diluizione e mescolare bene con un nuovo puntale per pipetta. Rimuovere due microlitri della prima diluizione e aggiungere a quattro microlitri di DMSO nella seconda miscela di provette. Ripetere bene per le diluizioni rimanenti.

Assicurati di mescolare bene le diluizioni dei composti per assicurarti che le concentrazioni dei composti siano accurate. Coprire le provette del composto e metterle da parte A temperatura ambiente, ottenere una piastra a fondo piatto, nera opaca a 96 pozzetti. Utilizzando la configurazione della piastra consigliata che si trova nel protocollo di testo.

Erogare manualmente un microlitro della rispettiva diluizione del composto direttamente sul fondo di ciascun pozzetto corrispondente per i pozzetti da uno a nove, erogare un microlitro della più alta concentrazione di composto da testare nel pozzetto.11. Per fungere da controllo della fluorescenza intrinseca del composto. Questo controllo serve a determinare se i composti stessi sono fluorescenti e/o influenzano l'idrolisi del substrato.

Erogare manualmente un microlitro di un potente inibitore noto al pozzetto, 12 come controllo positivo e un microlitro di DMSO al 100% al pozzetto. 10 come controllo negativo con un pipettatore automatizzato. 79 microlitri di tampone di saggio a lato dei pozzetti, uno a 10 e 12 e 89 microlitri a lato del pozzetto, 11.Assicurarsi

di non toccare la punta sul fondo del pozzetto dove è presente il composto per evitare la contaminazione incrociata dei pozzetti. Vortex, l'enzima a catena leggera diluito, e utilizzare un pipettatore automatico per aggiungere 10 microlitri dell'enzima sul lato di ciascun pozzetto, ad eccezione del pozzetto 11. Picchiettare delicatamente la piastra per assicurarsi che il volume totale dell'enzima aggiunto vada sul fondo del pozzetto, mescolare, coprire e incubare delicatamente la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente.

Questa incubazione fornisce una fase di equilibrio preliminare per i composti per legarsi alla catena leggera. Prima dell'aggiunta del substrato, agitare delicatamente la neurotossina botulinica, un substrato a catena leggera. Quindi, utilizzando una pipetta automatica, aggiungere 10 microlitri di substrato sul lato di ciascuno.

Beh, assicurati di aggiungere il substrato sul lato del pozzetto opposto a dove l'enzima è stato aggiunto in precedenza. Picchiettare delicatamente la piastra per miscelare immediatamente i reagenti. Posizionare la piastra in un lettore di piastre per microtitolazione a fluorescenza e iniziare il programma precedentemente configurato.

Al termine del programma, calcolare le velocità enzimatiche rappresentando graficamente l'unità di fluorescenza relativa rispetto al tempo e calcolando la pendenza della linea durante il periodo lineare della reazione. Prepararsi per il funzionamento automatizzato per lo screening ad alto rendimento come descritto nel protocollo di testo, Dimostrare una parte del protocollo di screening ad alto rendimento sarà de giovane un postdoc nel mio laboratorio. Mostrerà come i composti vengono trasferiti nelle piastre per lo screening ad alta produttività utilizzando apparecchiature di automazione di laboratorio Dopo aver dispensato la neurotossina botulinica diluita, un enzima a catena leggera, nella piastra del test.

Assegnate le aree sulla piattaforma di movimentazione dei liquidi per le piastre composte, le piastre di analisi e i contenitori con soluzioni detergenti. Programmare il gestore dei liquidi in modo che posizioni le piastre composte e le piastre di analisi nelle posizioni designate e rimuova i coperchi delle piastre prima della stampa. Calibrare il software del programma di stampaggio e assicurarsi che i perni di stampaggio siano immersi ma non graffino il fondo della piastra di analisi.

Timbro 50 nanolitri del composto direttamente nella piastra del saggio contenente otto microlitri di neurotossina botulinica. Una catena leggera. Pulire i perni dopo ogni piastra immergendoli nel DMSO e poi asciugandoli su carta assorbente e ripetendo questo processo con isopropanolo e metanolo.

Infine, asciugare i perni sopra la ventola dopo che i composti sono stati stampati nelle piastre di saggio con l'enzima. Separatamente, impilare le piastre dei composti di riserva e le piastre di analisi coprire la piastra di analisi superiore della pila per evitare l'evaporazione e metterle da parte. Assicurati di incubare la catena leggera con composti per almeno cinque minuti a temperatura ambiente.

Tempi di incubazione più lunghi possono essere utilizzati quando si timbra un gran numero di piastre. Infine, erogare il substrato nelle piastre di analisi e misurare la fluorescenza come descritto nel protocollo di testo. Sia che si esegua il test della neurotossina botulinica a base di fret in un saggio a bassa o alta produttività, si dovrebbe osservare un aumento della fluorescenza nel tempo quando la neurotossina botulinica, una catena leggera, viene incubata con il substrato.

Se vengono testate diluizioni seriali di un composto, spesso si ottiene una serie di linee con pendenze variabili. Qui. La concentrazione finale di un composto a base di idrossiato è elencata in unità micromolari. Bene, 10 nel layout della targa qui descritto funge da controllo negativo in cui viene aggiunto solo il veicolo.

La velocità di questa reazione è definita come 100% di attività enzimatica e le velocità in presenza di composto possono essere normalizzate a questa velocità per ottenere la velocità relativa o l'inibizione percentuale. Quando il test viene eseguito con diluizioni seriali di un composto, è possibile utilizzare un grafico della velocità della reazione rispetto alla concentrazione dell'inibitore per determinare la concentrazione inibitoria semimassima o IC 50. L'intervallo di diluizione deve essere scelto in modo che il grafico appaia a forma di sigma per un adattamento ottimale della curva.

Il valore IC 50 è una misura relativa della potenza, meglio descritta come un valore KI apparente, in quanto dipende dalla concentrazione dell'enzima presente nel test. Questo valore può quindi essere utilizzato per confrontare e classificare la potenza di diversi composti, se testati. Parallelamente, una corretta miscelazione della piastra dopo l'aggiunta di ciascun componente è fondamentale per ottenere un aumento lineare regolare della fluorescenza nel tempo, necessario per determinare con precisione le velocità iniziali.

Questo grafico mostra un esperimento rappresentativo in cui la miscelazione è stata insufficiente e il tasso di formazione del prodotto non è lineare nel tempo. Una volta padroneggiata questa tecnica, può essere eseguita in meno di due ore per un massimo di otto composti. Dopo questo esperimento, altri saggi possono essere eseguiti con substrati peptidici non fluorescenti per confermare che i composti inibiscono la neurotossina botulinica, la catena leggera e l'attività somatica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la potenza relativa degli inibitori delle catene leggere della neurotossina botulinica. Il protocollo è stato realizzato in tre fasi. Innanzitutto, la preparazione di una serie di diluizioni composte.

In secondo luogo, l'aggiunta di un enzima a catena leggera ricombinante e, in terzo luogo, l'aggiunta di un substrato fluorescente e la successiva misurazione su un lettore di piastre fluorescenti.