Isolamento e quantificazione della neurotossina botulinica da matrici complesse usando il BoTest Matrix saggi

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'attività proteolitica della neurotossina botulinica in matrici complesse come campioni farmaceutici, ambientali e alimentari. Ciò viene ottenuto innanzitutto processando, se necessario, i campioni di prova e quelli per la curva standard, al fine di stabilire condizioni adeguate di pH e viscosità. Successivamente, la neurotossina botulinica viene immunoprecipitata dai campioni utilizzando sfere magnetiche rivestite con anticorpi.

Successivamente, le perle magnetiche vengono accuratamente lavate per rimuovere eventuali composti interferenti e risospese in un buffer di reazione ottimizzato. Infine, le perle lavate vengono incubate con un reporter proteico e la scissione del reporter viene misurata spettroscopicamente nel tempo. In definitiva, il confronto della scissione del reporter nei campioni in esame rispetto ai campioni della curva standard consente di quantificare l'attività della tossina botulinica nei campioni in esame con una sensibilità vicina a quella del saggio biologico su topo.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come il saggio su topo, i saggi biologici, i metodi immunologici e altri metodi fluorescenti, sono che questo saggio non richiede l'uso di animali ed è stato dimostrato efficace nell'analisi di matrici altamente complesse presenti in campioni alimentari, ambientali e farmaceutici. In generale, coloro che si approcciano per la prima volta a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché è richiesta un'accurata lavorazione e diluizione dei campioni. A illustrare questa procedura sarà il dottor Mark Dunning, un ricercatore di Bio Sentinel.

Preparare i tamponi secondo il protocollo descritto per generare una curva standard per la quantificazione dei campioni in esame; pesare 10 più o meno 0,01 grammi di campione alimentare solido in un tubo conico da 50 millilitri e mettere da parte questo campione, che verrà utilizzato come diluente. In un secondo tubo, pesare 2 più o meno 0,01 grammi di campione alimentare solido. Aggiungere la neurotossina botulinica o il prodotto commerciale sulla superficie del campione alimentare da due grammi, fino a una concentrazione finale di 30.000 MLD 50 per grammo di alimento. Incubare i campioni diluenti e quelli arricchiti a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius per due ore, in modo da consentire alla tossina botulinica di interagire con la matrice alimentare.

Imitando una contaminazione naturale, fare riferimento al protocollo testuale per ulteriori tipi di campione. Successivamente, aggiungere un millilitro di GPB per grammo di alimento ai campioni spikeati e non spikeati ed utilizzare una pestella per omogeneizzare fino a quando non saranno completamente mescolati. Estrapolare il volume totale del campione spikeato di due grammi dal volume totale approssimativo del campione diluito di 10 grammi.

Quindi aggiungere un decimo del volume di tampone di neutralizzazione 10x al campione di diluente da 10 grammi e al campione arricchito da due grammi in base ai loro volumi totali. Mescolare bene i campioni mediante inversione, quindi chiarificarli parzialmente per centrifugazione a 6.000 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere immediatamente i soprannatanti e trasferirli in nuove provette, utilizzando il campione arricchito come D1 e il campione non arricchito come diluente, quindi preparare i restanti campioni della curva standard in provette microcentrifughe da 1,5 millilitri.

Per preparare campioni solidi, iniziare pesando due più o meno 0,01 grammi di campione solido incognito in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere due millilitri di GPB e utilizzare una pestella per omogeneizzare il campione. Successivamente, aggiungere un decimo del volume di buffer di neutralizzazione 10x al campione e mescolare bene per inversione, dopo aver parzialmente chiarito il campione mediante centrifugazione per 10 minuti a 6.000 volte la forza di gravità e a quattro gradi Celsius; trasferire immediatamente almeno 750 microlitri di soprannatante in un tubo da microcentrifuga.

Questa è la diluizione sconosciuta uno. Aggiungere 675 microlitri del diluente a due provette etichettate come diluizione sconosciuta due e tre. Il diluente sarà lo stesso materiale processato utilizzato per la generazione della curva standard.

Utilizzare il diluizione uno per eseguire una diluizione seriale, trasferendo 75 microlitri della diluizione uno nel tubo della diluizione due e mescolando. Successivamente, trasferire 75 microlitri della diluizione due nel tubo della diluizione tre e mescolare. Per chiarificare i campioni, centrifugarli per cinque minuti a almeno 14.000 ×g.

Rimuovere immediatamente i soprannatanti e trasferirli in nuove provette per preparare una piastra per i campioni; aggiungere 20 microlitri di buffer di legame 10 x in ciascun pozzetto. Ciascun campione sconosciuto e i campioni della curva standard D da uno a otto richiedono tre pozzetti, mentre il campione D nove richiede sei pozzetti. Aggiungere 200 microlitri di ciascun campione nei rispettivi pozzetti e utilizzare un agitatore per micropiastre per mescolare la piastra per 10 secondi. Vortexare le perle IPA per 10 secondi alla velocità massima o fino a completa risospensione.

Quindi pipettare 20 microlitri delle perle in ciascun pozzetto del campione e mescolare la piastra per 30 secondi. Incubare la piastra in un incubatore per piastre rotante per due ore a 750 giri al minuto e 25 gradi Celsius o a temperatura ambiente per lavare la piastra utilizzando un lavatore automatizzato di piastre. Dopo aver eseguito il programma di preriscaldamento, posizionare la piastra sulla piastra di separazione delle perle magnetiche da 96 pozzetti presente sul lavatore di piastre.

Eseguire quindi il programma di lavaggio principale. Al termine del programma, rimuovere la piastra dal lavatore. Aggiungere 50 microlitri di tampone di reazione 1x in ciascun pozzetto del campione e mescolare per 30 secondi.

Per avviare il saggio della matrice bot, aggiungere 50 microlitri di reporter AE 0,5 micromolare. In ogni pozzetto del campione per prevenire effetti marginali, aggiungere 100 microlitri di acqua in ogni pozzetto non utilizzato. Sigillare la piastra con nastro adesivo per tappi, proteggerla dalla luce e incubare a 750 giri al minuto e 25 gradi Celsius o a temperatura ambiente.

A ogni tempo di lettura, rimuovere la piastra dall'incubatore. Rimuovere il nastro superiore e posizionare immediatamente la piastra sulla piastra di separazione magnetica per piastre a 96 pozzetti, lasciando separare le perle magnetiche per due minuti. Posizionare quindi la piastra nel lettore di micropiastre e misurare le emissioni a circa 470 e circa 526 nanometri con eccitazione a circa 434 nanometri.

Se si desiderano ulteriori tempi di lettura, dopo aver risosospeso le perle per 30 secondi sul mixer per micropiastre, sigillare nuovamente la piastra e riporla nell'incubatore. Qui vengono mostrati i risultati del saggio utilizzando bot a olo tossina aggiunta in PBS e analizzata dopo incubazioni di due, quattro e 24 ore con il reporter AE. Il taglio del reporter da parte della bot viene misurato come riduzione del rapporto di emissione misurato dal nostro lettore di piastre, da circa 2,7 per il reporter integro a circa 0,7 per il reporter completamente scisso.

I valori specifici varieranno tra i diversi lettori di piastre, come indicato dallo spostamento verso sinistra della curva; un tempo di incubazione più lungo con il reporter determina un aumento della scissione del reporter. I punti dati testati in triplicato mostrano una bassa deviazione standard della media e seguono l'andamento previsto di un rapporto di emissione crescente al diminuire del carico tossico. L'insuccesso del saggio nel seguire questo andamento atteso potrebbe indicare un errore durante la preparazione delle diluizioni o nella rappresentazione grafica dei rapporti di emissione. I rapporti di emissione dei controlli privi di bot A rimangono stabili durante l'incubazione, indicando l'assenza di attività proteasica non specifica.

Questa figura illustra la metodologia generale utilizzata per rilevare o quantificare un campione sconosciuto in confronto a una curva standard e quantifica campioni farmaceutici di bot. Una curva standard è stata generata in PBS con bot purificata, una olo tossina, ed è stata processata in parallelo con diluizioni del prodotto farmaceutico ottenute da un singolo flaconcino da 100 unità di Botox liofilizzato ricostituito in soluzione salina allo 0,9%. In questo saggio, la porzione lineare della curva standard si colloca tra un rapporto di emissione di 2,11 e 1,05 ed è indicata dalla box tratteggiata nella figura. Le concentrazioni dei tre campioni sconosciuti che rientrano in questo intervallo lineare sono state quindi interpolate dalla curva standard.

In questo esperimento, pomodori freschi e latte al 2% sono stati utilizzati come matrici alimentari solide e liquide e contaminati con bot A, un complesso costituito dalla core hollo, toin e proteine associate alla neurotossina. Questa combinazione è stata scelta perché assomiglia alla tossina prodotta durante una contaminazione naturale da clostridio, come mostrato qui. Viene osservato il recupero di bot A in entrambe le matrici.

Inoltre, un tempo di incubazione più lungo con il reporter aumenta la sensibilità del saggio, ma non determina una riduzione dei rapporti di emissione nei controlli senza tossina, indicando che il taglio osservato è dovuto alla bot A e non a un trasferimento non specifico di proteasi dagli alimenti nel saggio. La bot A-L-O-D-L-O-Q e la CE 50 per entrambi gli alimenti a ciascun punto temporale riportato sono riassunte in questa tabella. Il LDO e il LDQ sono definiti come il campione alla concentrazione più bassa con un rapporto di emissione inferiore rispettivamente a tre e dieci deviazioni standard al di sotto del valore di fondo.

È prevista una certa variabilità tra matrice e matrice nei valori di LOD e LOQ, poiché gli effetti della matrice possono influenzare il legame della tossina alle perle e il recupero delle perle durante il lavaggio. Sebbene dai dati sembri esserci un recupero maggiore di tossina dal latte al 2% rispetto ai pomodori, gran parte di questa differenza deriva dalla ulteriore diluizione necessaria per omogeneizzare i campioni di pomodoro nel GPB. Oltre a essere una matrice alimentare solida, i pomodori rappresentano un tipo di campione significativo in cui l'aggiustamento di pH e forza ionica è fondamentale per il successo del saggio.

Questa figura illustra le risposte del saggio durante il test di pomodori con o senza l'aggiunta del buffer di neutralizzazione 10x. L'omissione del buffer determina un recupero scadente della tossina bot A dai campioni, come dimostrato da un rapporto di emissione costante a tutte le concentrazioni di bot A testate. L'aggiunta del buffer di neutralizzazione 10x, tuttavia, consente una rilevazione sensibile della tossina. Le proteasi aspecifiche possono essere endogene al campione alimentare oppure introdotte utilizzando preparazioni di bot non purificate, come i supernatanti di colture di Clostridium, e possono scindere il reporter AE provocando risultati falsamente positivi. Questo esempio dimostra l'attività di proteasi aspecifiche presenti nei supernatanti di colture di Clostridium bot A, utilizzando un reporter modificato che non viene più scisso dalla bot A. I livelli elevati di scissione del reporter indicano la presenza della coltura.

Il surnatante contiene una significativa attività proteasica, che viene efficacemente annullata dall'aggiunta di inibitori delle proteasi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un tempo totale compreso tra quattro e 26 ore, a seconda del tipo di campione e del carico tossico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare e quantificare la neurotossina botulinica da campioni complessi utilizzando l'immunoprecipitazione in un sistema di rilevamento proteico basato sulla fluorescenza.

Non dimenticare che lavorare con neurotossine botuliniche può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura si dovrebbero adottare precauzioni come l'uso di guanti, codici di laboratorio e cappe di sicurezza chimica e biologica.