Isolamento e quantificazione della neurotossina botulinica da matrici complesse usando il BoTest Matrix saggi

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'attività proteolitica della neurotossina botulinica in matrici complesse come campioni farmaceutici, ambientali e alimentari. Ciò si ottiene elaborando prima i campioni di test e curve standard, se necessario, per stabilire condizioni di pH e viscosità adeguate. Successivamente, la neurotossina botulinica viene immunoprecipitata dai campioni utilizzando perle magnetiche rivestite di anticorpi.

Quindi le biglie magnetiche vengono lavate accuratamente per rimuovere eventuali composti interferenti e risospese in un tampone di reazione ottimizzato. Infine, le perle lavate vengono incubate con un reporter proteico e misurano spettroscopicamente la scissione del reporter nel tempo. In definitiva, il confronto della scissione del reporter nei campioni di prova rispetto ai campioni della curva standard viene utilizzato per quantificare l'attività della tossina botulinica nei campioni di prova con sensibilità del biodosaggio da topo a quasi topo.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi come il topo, il biotest, l'immunologia e altri metodi fluorescenti sono che questo test non richiede l'uso di animali ed è stato dimostrato per l'uso in matrici altamente complesse presenti in campioni alimentari, ambientali e farmaceutici. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché è necessaria un'attenta elaborazione e diluizione del campione. A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Mark Dunning, uno scienziato di Bio Sentinel.

Preparare i tamponi secondo il protocollo di testo per generare una curva standard per quantificare i campioni di prova, pesare 10 più o meno 0,01 grammi di campione di cibo solido in una provetta conica da 50 millilitri e mettere da parte questo campione verrà utilizzato come diluente in una seconda provetta pesare due più o meno 0,01 grammi di campione di cibo solido. Aggiungere la neurotossina botulinica o acquistarla sulla superficie del campione di cibo da due grammi fino a una concentrazione finale di 30.000 MLD 50 per grammo di cibo. Incubare il diluente e i campioni addizionati a temperatura ambiente o quattro gradi Celsius per due ore per dare al robot il tempo di interagire con la matrice alimentare.

Per imitare una contaminazione naturale, fare riferimento al protocollo di testo per ulteriori tipi di campioni. Quindi, aggiungere un millilitro di GPB per grammo di cibo ai campioni addizionati e non addizionati e utilizzare un pestello per omogeneizzare fino a quando non sarà completamente amalgamato. Estrapolare il volume totale del campione addizionato da due grammi dal volume totale approssimativo del campione di diluente da 10 grammi.

Quindi aggiungere un decimo volume di 10 x tampone di neutralizzazione al campione di diluente da 10 grammi e due grammi hanno acquistato un campione addizionato in base ai loro volumi totali. Miscelare bene i campioni per inversione, chiarificare parzialmente entrambi i campioni centrifugando per 10 minuti a 6.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere immediatamente i surnatanti e trasferire in nuove provette utilizzando il bot un campione addizionato come quello D e il campione non addizionato come diluente generano i restanti campioni della curva standard in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Per preparare campioni di cibo solido, iniziare pesando due grammi più o meno 0,01 grammi di campione solido sconosciuto in una provetta conica da 50 millilitri. Aggiungere due millilitri di GPB e utilizzare un pestello per omogeneizzare il campione. Quindi, aggiungere un decimo del volume di 10 volte il tampone di neutralizzazione al campione e mescolare bene per inversione dopo aver parzialmente chiarificato il campione mediante centrifugazione per 10 minuti a 6.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius trasferire immediatamente almeno 750 microlitri di surnatante in una provetta per microcentrifuga.

Questa è una diluizione sconosciuta. Aggiungere 675 microlitri di diluente a due provette etichettate come diluizione sconosciuta due e tre. Il diluente sarà lo stesso materiale lavorato utilizzato per la generazione di curve standard.

Utilizzare la diluizione uno per effettuare la diluizione seriale trasferendo 75 microlitri di diluizione uno nella provetta di diluizione due e mescolando. Quindi trasferire 75 microlitri di diluizione due nella provetta di diluizione tre e mescolare. Per chiarificare i campioni, centrifugarli per cinque minuti almeno 14.000 volte. Gravità.

Rimuovere immediatamente i surnatanti e trasferirli in nuove provette per preparare una piastra per i campioni, aggiungere 20 microlitri di tampone legante 10 x a ciascun pozzetto, ogni campione sconosciuto e i campioni curvi standard da D uno a D otto richiedono tre pozzetti e il campione D nove richiede sei pozzetti. Aggiungere 200 microlitri di ciascun campione ai rispettivi pozzetti e utilizzare un miscelatore per micropiastre per mescolare la piastra per 10 secondi. Agitare le perle IPA per 10 secondi alla massima velocità o fino a quando non sono completamente risospese.

Quindi pipettare 20 microlitri di perle in ogni pozzetto del campione e mescolare la piastra per 30 secondi. Incubare la piastra in un incubatore a piastre rotanti per due ore a 750 giri/min e 25 gradi Celsius o a temperatura ambiente per lavare la piastra utilizzando una lavatrice automatica per piastre. Dopo aver eseguito il programma di adescamento, posizionare la piastra sulla piastra di separazione delle microsfere magnetiche a 96 pozzetti sulla rondella per piastre.

Quindi eseguire il programma di lavaggio principale. Al termine del programma, rimuovere la piastra dalla lavatrice. Aggiungere 50 microlitri di un tampone di reazione a ciascun pozzetto del campione e mescolare per 30 secondi.

Per avviare il test della matrice di test del bot, aggiungere 50 microlitri di reporter AE 0,5 micromolari. A ogni pozzetto del campione per evitare effetti di bordo, aggiungere 100 microlitri di acqua a ogni inutilizzato. Usa del nastro adesivo per soffitto per sigillare la piastra, proteggerla dalla luce e incubarla a 750 giri/min e 25 gradi Celsius o a temperatura ambiente.

Ad ogni lettura, rimuovere la piastra dall'incubatrice. Rimuovere il nastro del soffitto e posizionare immediatamente la piastra sulla piastra di separazione delle perline magnetiche a 96 pozzetti, lasciare che le perline si separino per due minuti. Posizionare la piastra nel lettore di micropiastre e misurare le emissioni a circa 470 e circa 526 nanometri sotto eccitazione a circa 434 nanometri.

Se si desiderano tempi di lettura aggiuntivi, dopo aver sospeso nuovamente le perle per 30 secondi sul miscelatore per micropiastre, richiudere la piastra e rimetterla nell'incubatore. Di seguito sono mostrati i risultati del test Utilizzando un ologramma inserito in PBS e testato dopo incubazioni di due, quattro e 24 ore con il reporter AE. La scissione del reporter da parte del bot è misurata come una riduzione del rapporto di emissione misurata dal nostro lettore di targhe da circa 2,7 per il reporter intatto a circa 0,7 per il reporter completamente scisso.

I valori specifici saranno diversi tra i lettori di piastre, come si vede dallo spostamento verso sinistra della curva, il tempo di incubazione prolungato con il reporter si traduce in un aumento della scissione del reporter. I punti dati testati in triplice copia mostrano una bassa deviazione standard della media e seguono la tendenza prevista di un aumento del rapporto di emissioni con una diminuzione del carico di tossine. Il fatto che il test non segua questa tendenza prevista può indicare un errore durante la generazione della diluizione o che i dati che tracciano i rapporti di emissione dei controlli che non contengono bot A rimangano stabili durante l'incubazione, indicando la mancanza di attività proteasica non specifica.

Questa figura dimostra la metodologia generale utilizzata per rilevare o quantificare qualsiasi campione sconosciuto rispetto a una curva standard e quantifica i campioni farmaceutici a. Una curva standard è stata generata in PBS con bot purificato, un olotoin e processata in parallelo con diluizioni del prodotto farmaceutico generate da una singola fiala da 100 unità di Botox liofilizzato reidratato in soluzione salina allo 0,9% in questo saggio, la porzione lineare della curva standard cade tra un rapporto di emissione di 2,11 e 1,05 ed è indicata dalla casella tratteggiata in figura. Le concentrazioni delle tre incognite che rientrano in questo intervallo lineare sono state quindi interpolate dalla curva standard.

In questo esperimento, i pomodori freschi e il 2% di latte sono stati utilizzati come matrici alimentari solide e liquide e arricchite con un complesso composto dalle proteine associate al nucleo hollo, toin e neurotossina. Questa combinazione è stata scelta perché assomiglia alla tossina prodotta durante una contaminazione naturale da clostridium, come mostrato qui. Il recupero del bot A si osserva con entrambe le matrici.

Inoltre, l'aumento del tempo di incubazione con il reporter aumenta la sensibilità del saggio, ma non si traduce in una diminuzione dei rapporti di emissione per i controlli senza tossine, indicando che i risultati della scissione osservati dal bot A e non la proteasi non specifica riportata dal cibo nel saggio. Il bot A-L-O-D-L-O-Q e EC 50 per entrambi gli alimenti in ogni punto temporale mostrato sono riassunti in questa tabella. Il LOD e il LOQ sono definiti come il campione a più bassa concentrazione con un rapporto di emissione inferiore rispettivamente a tre e 10 deviazioni standard al di sotto del fondo.

Ci si aspetta una certa variabilità da matrice a matrice in LOD e LOQ poiché gli effetti della matrice possono influenzare il legame della tossina alle perle e il recupero delle perle durante il lavaggio. Mentre sembrerebbe che ci sia stato un maggiore recupero di tossine dal 2% di latte rispetto ai pomodori dai dati, gran parte di questa differenza deriva dalla diluizione aggiuntiva necessaria per omogeneizzare i campioni di pomodoro in GPB. Oltre ad essere una matrice alimentare solida, i pomodori sono un tipo di campione degno di nota in cui la regolazione del pH e della forza ionica è fondamentale per il successo del test.

Questa figura illustra le risposte del test durante l'analisi dei pomodori con o senza l'inclusione del tampone di neutralizzazione 10x. La mancata aggiunta del tampone si traduce in uno scarso recupero del bot A dai campioni ed è dimostrata da un rapporto di emissione costante in tutte le concentrazioni di bot A testate L'aggiunta del tampone di neutralizzazione 10 volte, tuttavia, si traduce in un rilevamento di tossine sensibili, le proteasi non specifiche possono essere endogene al campione di cibo o introdotte quando si utilizzano preparati bot non purificati come la coltura di Clostridium, surnatanti e può spaccare il segnalatore AE portando a risultati falsi positivi. Questo esempio dimostra l'attività della proteasi non specifica trovata nei surnatanti di coltura di Clostridium bot, a, utilizzando un reporter modificato che non viene più scisso dal bot A.Gli alti livelli di scissione del reporter indicano la coltura.

Il surnatante contiene una significativa attività proteasica, che viene efficacemente annullata dall'aggiunta di inibitori della proteasi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un tempo di analisi totale compreso tra quattro e 26 ore, a seconda del tipo di campione e del carico di tossine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e quantificare la neurotossina botulinica da campioni complessi utilizzando l'immunoprecipitazione in un sistema reporter proteico basato sulla fluorescenza.

Non dimenticare che lavorare con le neurotossine botuliniche può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere utilizzate precauzioni come guanti, codici di laboratorio e armadi di sicurezza chimica e biologica.