Name: Isolamento e quantificazione della neurotossina botulinica da matrici complesse usando il BoTest Matrix saggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Impara a isolare e quantificare la neurotossina botulinica da matrici complesse come alimenti e campioni ambientali usando il saggio BoTest Matrix. Questo metodo immunoprecipitazione con perline magnetiche offre sensibilità paragonabile al biossaggio su topo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori desiderano ringraziare H. Olivares e D. Ruge per le discussioni importanti e consigli. Questa ricerca è stata sostenuta in parte da un premio NSF SBIR (IIP-1.127.245 a BioSentinel Inc.) e del Dipartimento della Difesa contratto (W81XWH-07-2-0045 a BioSentinel Inc.).

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin e WC Tucker sono dipendenti o proprietari di BioSentinel Inc. BioSentinel attualmente produce e ha commercializzato alcuni dei reagenti presentati in questo rapporto.

Questo protocollo descrive le procedure per la quantificazione BoNT / A complesso, holotoxin, o Clostridium cultura surnatante in matrici complesse. Il protocollo è lo stesso, però, quando prova diversi sierotipi di BoNT (ad es BoNT / B, E e F) con i rispettivi saggi Matrix 56,60, anche se la sensibilità del test varia di tutti i sierotipi e saggi. Questo protocollo non tiene conto di ogni tipo di campione possibile e alcune modifiche può essere richiesto a seconda della composizione del cam...

Neurotossine botuliniche (BoNT) sono le sostanze più letali noti, con via endovenosa dosi letali umane stimate a 1-3 ng / kg 1,2. Sette sierotipi strutturalmente simili di BoNT, etichettati A a G, esistere, ciascuno costituito da un dominio catena pesante responsabile cella vincolante, assorbimento e traslocazione nel citosol e una catena leggera che codifica una endopeptidasi zinco 3-5. La tossicità squisita BoNT deriva da, in parte, la sua voce specifica di legame e in motoneuroni a livello della giunzione neuromuscolare 6. Una volta all&#39;interno del neurone, la endopeptidasi catena leggera specificamente fende uno o più dei solubile N-etilmaleimmide sensibile proteina recettore fattore di attacco (SNARE) proteine ​​necessarie per la fusione delle vescicole, inibendo il rilascio dei neurotrasmettitori e portando alla paralisi flaccida 7-14. Comunemente conosciuta come la malattia &quot;botulismo&quot;, paralisi del diaframma e muscoli intercostali di BoNT in ultima analisi,insufficienza respiratoria e morte a meno che la diagnosi precoce e il trattamento vengono ricevuti. Origine alimentare umana botulismo è più comunemente associato con BoNT sierotipi A, B, E e F (BoNT / A, BoNT / B, ecc) e solitamente deriva dalla ingestione di alimenti contaminati 15,16, anche se, diversi casi di botulismo della ferita sono stati segnalati tra gli utenti tossicodipendenti per via endovenosa 17,18. Negli Stati Uniti, botulismo infantile derivante dall&#39;ingestione di spore di Clostridium dai bambini sotto l&#39;anno di età è la forma più comune di botulismo 19-21. Tuttavia, focolai di origine alimentare BoNT derivanti da conserviera casa improprio e trasformazione dei prodotti alimentari sono stati riportati sia negli Stati Uniti e all&#39;estero. Tra il 2000-2009, di almeno 338 casi di botulismo alimentare sono stati segnalati in tutto il mondo tra cui sei decessi 22. La capacità di rilevare rapidamente e sensibilmente focolai di botulismo di origine alimentare è un&#39;indicazione importante che potrebbe aiutare la diagnosi precoce 23,24. Inoltre, i metodi di rilevamento che consentono di costo-efficacia e analisi degli alimenti di routine porteranno a migliorare la sicurezza alimentare. Specificità neuronale di BoNT e lunga emivita biologica rende anche un potente terapeutico. Negli Stati Uniti, i farmaci a base di BoNT sono approvati dalla Food and Drug Administration per il trattamento di condizioni cosmetiche e disturbi neuromuscolari legati comprese le linee glabellari, distonia cervicale, emicranie, vescica iperattiva, e strabismo. Numerose applicazioni &quot;off-label&quot; sono documentati, compresi i trattamenti ad alte dosi per gravi disfunzioni muscolo 25-28. Accurate tossina quantificazione è fondamentale per il corretto dosaggio, come sottodosaggio può portare a un trattamento inefficace mentre sovradosaggio mette i pazienti a rischio di effetti collaterali potenzialmente dannosi. Purtroppo, nessun protocollo di dosaggio potenza standard è condiviso tra i produttori, con conseguente disparità di definizione dell&#39;unità tra produttori farmaco a base di BoNTcts 29-31. Il test standard per BoNT è il biotest sui topi in cui BoNT contenenti campioni vengono iniettati per via intraperitoneale in topi e il numero di morti registrati oltre 1-7 giorni 16,32,33. Il biotest sui topi è molto sensibile, con limiti di rilevabilità (LOD) di 5-10 pg BoNT / A 34, tuttavia, le preoccupazioni etiche sull&#39;uso degli animali, l&#39;alto costo della formazione del personale e manutenzione degli impianti di polizia, i tempi di analisi lunghi, e la mancanza di protocolli standardizzati portato nelle chiamate a sviluppare standard, privo di animali BoNT prove e metodi di quantificazione 35-39. Recentemente, diversi alternativi metodi di quantificazione BoNT sono stati sviluppati che offrono mouse o quasi il mouse sensibilità bioassay 40-49. Questi metodi usano comunemente fluorescenza, spettrometria di massa, o metodi immunologici e offrono tempi di analisi molto più breve dei biotest sui topi senza l&#39;uso degli animali. Spettrometria di massa approcci combinati con Techniq immunologicaUES hanno mostrato di rilevare e quantificare BoNT contenuta negli alimenti e altri campioni complessi, tuttavia, le esigenze di formazione del personale e limite di attrezzature specializzate questi saggi 50-55. La maggior parte degli altri test alternativi non sono facilmente applicabili a una prova a campione complessa o non hanno la velocità necessaria per l&#39;analisi di routine BoNT. La natura altamente variabile della viscosità del campione alimentare, pH, contenuto di sale, e costituenti della matrice rappresenta una sfida particolarmente difficile quando si cerca di sviluppare metodi in vitro test con la sensibilità per abbinare l&#39;estrema potenza di BoNT. Inoltre, anche i sistemi tampone semplici e relativamente benigni, come quelli derivanti dalla risospensione dei prodotti farmaceutici a base di BoNT, contengono sale, albumina, zucchero e stabilizzanti (cioè eccipienti) che hanno un impatto significativo in vitro BoNT potenza 56. È necessaria purificazione tossina per il test dell&#39;attività accurata di tutti, ma il più semplice dei campioni 56-59. IlBoTest saggi Matrix sono stati progettati per una rapida, high-throughput, e la quantificazione coerente del BoNT da campioni altamente complessi che utilizzano attrezzature che si trovano comunemente nei laboratori di ricerca 56,60. Questi saggi usano perline paramagnetiche covalentemente legati ad anticorpi sierotipo-specifici anti-BoNT di legare e sequestrare BoNT su un campione e poi rimuovere composti interferenti matrice mediante lavaggio. Dopo il lavaggio, legato attività proteolitica BoNT viene quindi quantificata in un tampone di reazione ottimizzato utilizzando un giornalista compatibile con il sierotipo BoNT in fase di test. Questi giornalisti sono proteine ​​fluorogeniche costituiti da una proteina fluorescente ciano N-terminale (PCP) frazione e un C-terminale giallo fluorescente derivato proteico (Venere) frazione collegate da un substrato BoNT, residui SNAP25 141-206 o residui sinaptobrevina 33-94 costituisce il BoTest A / E o B / D / giornalisti F / G, rispettivamente, 45. Reporter scissione da BoNT è controllata mediante Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET). Quando tegli giornalista è intatto, eccitazione del CFP si traduce in FRET a Venere, tempra emissione CFP ed emozionante emissione di Venere. Clivaggio del reporter da BoNT impedisce FRET, portando ad un aumento delle emissioni CFP e diminuzione delle emissioni Venus. Attività BoNT può essere misurato quantitativamente utilizzando il rapporto tra le emissioni PCP e Venus. LOD di sotto del 3 pg sono possibili da una vasta gamma di alimenti utilizzando un formato piastra a 96 pozzetti high-throughput 56. Maggiore sensibilità può essere ottenuta usando campioni di volume poiché il test permette concentrazione della tossina sulla superficie delle sfere. I saggi Matrix BoTest per BoNT A, B, E e F sono stati sviluppati e testati con il cibo, farmaceutica e campioni ambientali 56,60. Qui, descriviamo le procedure per l&#39;esecuzione di questi test per la rilevazione di BoNT a bassa complessità (ad es farmaceutica, BoNT in tampone) e elevata complessità (ad esempio alimenti, ambientale) campioni. Metodi di lavorazione specificiper diversi tipi di campioni sono affrontati in questo protocollo e tipi di campioni qui non descritti possono solitamente essere adattati utilizzando una combinazione dei metodi presentati. Il protocollo è stato sviluppato e testato con BoNT / A, ma è adattabile ad altri sierotipi BoNT utilizzando i rispettivi saggi come dimostrato altrove 56,60.

<table><tbody><tr><td>Kit di rilevamento della neurotossina botulinica BoTest Matrix A</td> Sono <td>disponibili anche i kit di rilevamento BioSentinel A1015 per BoNT/B e F.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre a fluorescenza Varioskan Flash</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>È possibile utilizzare la maggior parte delle unità basate su monocromatore o filtro con eccitazione di 434 nm e capacità di emissione di 470 nm e 526 nm.</td></tr><tr><td>Piastra di separazione a microsfere magnetiche a 96 pozzetti</td><td>V& P Scientific</td><td>VP771H</td><td>Possono essere utilizzate altre piastre magnetiche, ma la piastra deve essere progettata in modo da separare le perle dal lato del pozzetto.</td></tr><tr><td>Lavapiastre compatibile con perline magnetiche</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>Opzionale, necessaria solo per il lavaggio automatico delle lastre. Possono essere utilizzate anche altre rondelle per piastre compatibili con le perline magnetiche, ma devono essere testate prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td></td><td></td><td>Opzionale, necessaria solo per i campioni che necessitano di centrifugazione.</td></tr><tr><td>Miscelatore a piastre MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td><td></td><td></td> orbitale <td>Utilizzato a temperatura ambiente o a 25 ° C Se è disponibile il controllo della temperatura</td></tr><tr><td>, le compresse per inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>necessarie solo per i test alimentari o ambientali. Gli inibitori della proteasi devono essere privi di EDTA.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>Metabiologics</td><td></td><td>Opzionale, richiesto solo per scopi di standardizzazione e quantificazione</td></tr><tr><td>Piastre nere, a fondo piatto a 96 pozzetti Le</td> piastre <td>NUNC</td><td>237105</td><td>non devono essere trattate</td></tr><tr><td>Nastro sigillante per piastre a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e quantificazione della neurotossina botulinica da matrici complesse usando il botest matrix saggi

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

È richiesto il rilevamento preciso e la quantificazione di neurotossina botulinica (BoNT) in matrici complesse per il settore farmaceutico, ambientale e test campione alimentare. È necessario un rapido BoNT sperimentazione di prodotti alimentari durante forense epidemia, la diagnosi del paziente, e la prova di sicurezza alimentare, mentre è richiesto il test di potenza accurate per la fabbricazione di prodotti a base di droga-BoNT e la sicurezza del paziente. Il biotest sui topi ampiamente usato per il test BoNT è altamente sensibile, ma manca la precisione e la velocità necessarie per un rapido e di routine test BoNT. Inoltre, l&#39;uso del saggio biologico degli animali ha portato a inviti da parte delle autorità di regolamentazione dei prodotti di droga e sostenitori dei diritti degli animali negli Stati Uniti e all&#39;estero per sostituire il biotest sui topi per il test BoNT. Diversi pezzi in vitro sono stati sviluppati che funzionano bene con purificata BoNT nel buffer semplici, ma la maggior parte non hanno dimostrato di essere applicabile a test in matrici molto complesse. Qui, un protocollo per la rilevazione diBoNT in matrici complesse utilizzando le BoTest Matrix test è presentato. Il saggio consiste di tre parti: la prima parte prevede la preparazione dei campioni per le prove, la seconda parte è un passo immunoprecipitazione con anticorpi anti-BoNT paramagnetici branelli rivestiti con anticorpo per purificare BoNT dalla matrice, e la terza parte quantifica proteolitica isolato di BoNT all&#39;attività utilizzando un giornalista fluorogenica. Il protocollo è scritto per prove ad alta velocità in piastre a 96 pozzetti utilizzando matrici sia liquidi che solidi e richiede circa 2 ore di preparazione manuale con tempi totali dosaggio di 4-26 ore a seconda del tipo di campione, carico tossina, e la sensibilità desiderata. I dati sono presentati per BoNT / A test con soluzione salina tamponata con fosfato, un farmaco, supernatante di coltura, 2% latte e pomodori freschi e comprende discussione dei parametri critici di successo dosaggio.

Un diagramma che riassume i passaggi del protocollo descritto è illustrato nella Figura 2. Il test richiede tra 4-26 ore per completare a seconda del tipo di campione e dalla sensibilità del test desiderato, ma solo ~ 2 ore di hands-on tempo. Il test viene eseguito in piastre da 96 pozzetti e, a seconda del tipo di test in corso, permette test triplicato di fino a 20 campioni anche standard per piastra. La figura 3 mostra i risultati del test rappresentativi...

La neurotossina botulinica BoTest Matrix (BoNT) test di rilevazione rapida purificano e quantificare BoNT da una gamma di matrici. Qui vi presentiamo un protocollo per l&#39;individuazione e la quantificazione delle BoNT da matrici sia solide e liquide e dimostriamo il test con BOTOX, i pomodori e il latte.

Isolamento e quantificazione della neurotossina botulinica da matrici complesse usando il BoTest Matrix saggi

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'attività proteolitica della neurotossina botulinica in matrici complesse come campioni farmaceutici, ambientali e alimentari. Ciò viene ottenuto innanzitutto processando, se necessario, i campioni di prova e quelli per la curva standard, al fine di stabilire condizioni adeguate di pH e viscosità. Successivamente, la neurotossina botulinica viene immunoprecipitata dai campioni utilizzando sfere magnetiche rivestite con anticorpi.Successivamente, le perle magnetiche vengono accuratamente lavate per rimuovere eventuali composti interferenti e risospese in un buffer di reazione ottimizzato. Infine, le perle lavate vengono incubate con un reporter proteico e la scissione del reporter viene misurata spettroscopicamente nel tempo. In definitiva, il confronto della scissione del reporter nei campioni in esame rispetto ai campioni della curva standard consente di quantificare l'attività della tossina botulinica nei campioni in esame con una sensibilità vicina a quella del saggio biologico su topo.I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come il saggio su topo, i saggi biologici, i metodi immunologici e altri

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video mostra un test immunologico multiplex basato su microsfere per quantificare più bersagli di citochine in un campione. Una miscela di microsfere distinte coniugate ad anticorpi specifici per le citochine viene utilizzata per legare le citochine presenti nel campione. I reporter marcati con streptavidina vengono immobilizzati sulle citochine legate utilizzando anticorpi di rilevamento biotinilati. La citometria a flusso identifica le citochine legate in base alle dimensioni uniche e...

Un test immunologico multiplex basato su microsfere per quantificare più bersagli di citochine

La catena leggera della neurotossina botulinica di tipo A (BoNT/A LC) è una metalloproteasi che entra nei motoneuroni, slega il suo substrato SNAP-25 e interrompe la neurotrasmissione, provocando così una paralisi flaccida. Utilizzando un saggio basato su FRET compatibile con ad alto rendimento, è possibile eseguire lo screening di grandi librerie di piccole molecole per verificarne l'impatto sull'attività enzimatica del LC BoNT/A.

Una piattaforma basata FRET-compatibile ad alta-velocità per l&#39;identificazione e la caratterizzazione di neurotossina botulinica di luce modulatori catena

La neurotossina botulinica è una delle tossine più potenti tra gli agenti di minaccia biologica di categoria A, ma non è disponibile una terapia post-esposizione. L'approccio di imaging ad alto contenuto è una potente metodologia per identificare nuovi inibitori in quanto consente lo screening multiparametrico utilizzando motoneuroni biologicamente rilevanti, il bersaglio principale di questa tossina.

Un alto dosaggio Imaging contenuti per l&#39;identificazione di neurotossina botulinica inibitori

Viene descritto un protocollo personalizzato per differenziare le cellule ES di topo in popolazioni definite di neuroni altamente puri che esibiscono sinapsi funzionanti e un comportamento di rete emergente. L'analisi elettrofisiologica dimostra la perdita della trasmissione sinaptica in seguito all'esposizione ai sierotipi di neurotossina botulinica /A-/G e alla neurotossina tetanica.

Valutazione funzionale di neurotossine biologiche in Culture in rete di cellule staminali derivate dal Sistema Nervoso Centrale Neuroni

Questo protocollo presenta un metodo convalidato di cromatografia liquida-spettrometria di massa a mobilità ionica ad alta risoluzione per determinare la presenza di alcaloidi dell'ergot negli alimenti in conformità con il Regolamento della Commissione (UE) 2023/915 recentemente pubblicato.

Rilevazione di alcaloidi regolati dell'ergot in matrici alimentari mediante cromatografia liquida-spettrometria di mobilità ionica intrappolata-spettrometria di massa a tempo di volo

Espianti dal sistema dopaminergico mesencefalo e striato sono utilizzati in un saggio per la matrice di...

Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale

Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l'utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.

Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex

Questo video mostra una strategia semplice e affidabile per la preparazione di colture pure di cellule endoteliali del prosencefalo embrionale entro 10-12 giorni e sarà utile per la ricerca focalizzata su molti aspetti della angiogenesi cerebrale.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Questo articolo descrive un sistema di coltura neuronale che può essere utilizzato per ottenere grandi quantità di campioni assonali puri per analisi biochimiche e immunocitochimiche. Questa tecnica consentirà una migliore comprensione della normale fisiologia assonale e delle vie di segnalazione che portano alla neurodegenerazione.

Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l&#39;analisi biochimica Uso dei filtri porosi

colture neuronali sono un buon modello per lo studio delle tecniche di stimolazione cerebrale emergenti tramite il loro effetto sui singoli neuroni o di una popolazione di neuroni. Qui presentati sono diversi metodi per la stimolazione di colture neuronali modellate da un campo elettrico prodotto direttamente dalla elettrodi bagno o indotto da un campo magnetico variabile nel tempo.

Eccitazione esterna dei neuroni Usando campi elettrici e magnetici in mono e culture bidimensionali

Impara a isolare e quantificare la neurotossina botulinica da matrici complesse come alimenti e campioni ambientali usando il saggio BoTest Matrix. Questo metodo immunoprecipitazione con perline magnetiche offre sensibilità paragonabile al biossaggio su topo.

Isolamento e quantificazione della neurotossina botulinica da matrici complesse usando il BoTest Matrix saggi

Esplora altri video