Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare rapidamente topi con deficit genetico con l'aiuto di nucleasi della coda o artigli. Ciò si ottiene progettando e assemblando prima costrutti di DNA che codificano specifiche coppie di taloni, che fungono da modelli per la trascrizione in vitro per generare mRNA di Talon. I passaggi successivi della procedura sono l'isolamento dei citi di topo fecondati e quindi la microiniezione con il T.Il passaggio finale consiste nel trasferire chirurgicamente i citi iniettati nelle madri adottive pseudo gravide.

La progenie F zero risultante mostra frequentemente delezioni sito-specifiche delle sequenze genomiche che spesso portano alla perdita della funzione del gene bersaglio. Sebbene il metodo qui presentato possa fornire informazioni sulla funzione genica nei topi, l'approccio di base può essere adattato anche ad altri organismi modello come ratti e pesci. Innanzitutto, accedi al sito Web del bersaglio nucleotide effettore TAL sul sito.

Scegli il programma di targeting TN e incolla la sequenza del gene target. Per questo protocollo. Usa i costrutti di espressione P-C-A-G-T e il kit di effettori Golden Gate Talen e T disponibili sul gene AD.

Se per l'assemblaggio Talen vengono utilizzati altri costrutti o kit di assemblaggio, le impostazioni potrebbero essere diverse per la lunghezza ottimale del distanziatore e il numero di RV di coda, scegliere l'opzione Miller Etal 2011 nell'impostazione Usa un'architettura preimpostata. Quindi seleziona NN nella scheda Sostituto G. Il programma genera un file di testo con potenziali siti di destinazione generati da questo elenco.

Seleziona la coppia o le coppie Talen richieste e procedi con il montaggio del Golden Gate. Questo protocollo funziona con i ceppi di topi da laboratorio più comunemente usati, tra cui C 57, BL sei J e BDF one super ovulare 10 femmine donatrici a quattro settimane di età utilizzando un'iniezione intraperitoneale di cinque unità di gonadotropina sierica di cavalla gravida. 48 ore dopo somministrare alle femmine cinque unità di gonadotropina corionica umana anche mediante iniezione intraperitoneale immediatamente dopo l'iniezione di gonadotropina corionica umana compagno, le femmine uno a uno con i maschi in età riproduttiva lo stesso giorno, preparano le madri adottive pseudo gravide. Altri.

La mattina dopo, sacrifica le femmine e recupera gli ovociti fecondati sezionando i ciottoli. Quindi rilasciare le stringhe degli ovociti in una capsula per coltura d'organo contenente un millilitro di terreno M 2. Rimuovere tutte le cellule del cumulo aggiungendo 10 microlitri di soluzione di ialuronidasi bovina allo 0,1% in un piatto contenente frizioni di citi in terreno M due.

Quindi utilizzare la pipetta orale per lavare gli embrioni attraverso due o tre cambi di terreno M 2 per rimuovere la ialuronidasi. Continuare il trattamento con ialuronidasi per gli embrioni che non si sono ancora dissociati dalle cellule del cumulo. Gli embrioni isolati possono essere conservati in M 16, terreno a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando non vengono microiniettati.

Preparare 100 microlitri di soluzione iniettabile contenente 10 nanogrammi per microlitro di ciascuna coda. Nucleasi, mRNA, accoppiare e centrifugare per 30 minuti a 30.000 G in pellet. Eventuali particelle che possono ostruire gli aghi per iniezione.

Quindi tenere il composto sul ghiaccio. Pianifica di iniettare gli ovociti nella loro fase pronucleare nel primo pomeriggio. Immergere circa 100 embrioni in mezzo M two sotto uno strato di olio minerale e lavorare su un microscopio invertito senza ottica DIC marsy.

Con un ingrandimento inferiore a 20x, selezionare i citi con pronuclei distinti. Lo smistamento degli ovociti può essere effettuato utilizzando un carico capillare di iniezione vuoto, il capillare di iniezione appena prima di essere utilizzato con uno o due microlitri di soluzione iniettabile. Quindi collegarlo alla testina di microiniezione.

Quindi aspirare un cito selezionato con un capillare di tenuta ed effettuare un'iniezione superficiale dell'mRNA della nucleasi nel citoplasma. Evitare il contatto con i pronuclei. Il volume di iniezione deve essere mantenuto basso.

Al primo segno di distensione citoplasmatica, ritirare l'ago. Normalmente, circa l'80-90% degli embrioni dovrebbe sopravvivere senza immediatezza. Per aumentare la quantità di mRNA iniettato, rendere la soluzione più concentrata dopo la microiniezione dei citi disponibili.

Trasferirli in un terreno M 16 utilizzando una pipetta per bocca. Incubare gli embrioni per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi trasferisci quelle che sopravvivono in madri adottive pseudo incinte.

Il giorno prima della microiniezione indurre una pseudo gravidanza in topi femmina di MC di età compresa tra tre e sei mesi, accoppiandoli con maschi settorizzati VA. La mattina successiva selezionare le femmine con un tappo chiaro da utilizzare come riceventi di embrioni. Le femmine inutilizzate torneranno dal loro stato di pseudo gravidanza in tre settimane e possono essere riutilizzate in seguito.

Posiziona una femmina madre adottiva anestetizzata su una superficie calda sull'addome. Quindi disinfettare l'area dell'incisione spruzzandola con etanolo al 70%. Pettinare i capelli bagnati lontano dal sito di incisione previsto.

Ora taglia la cavità peritoneale con le forbici ed esternalizza il corno uterino. Per fare questo. Tirare il cuscinetto adiposo attaccato all'ovaio e immobilizzare gli organi riproduttivi con una pinza per bulldog.

Inoltre, assicurati di mantenere gli organi umidi con una soluzione riscaldata di cloruro di sodio allo 0,9%. A questo punto, smistate da 12 a 20 embrioni vitali e caricateli in un sottile capillare di vetro. Usando la pipetta per la bocca, aspirare prima una piccola bolla d'aria, quindi aspirare gli embrioni usando una pinza fine.

Afferra delicatamente l'UCT appena a monte dell'amplificatore e crea un piccolo foro nella parete dell'UCT usando un ago calibro 30. Inserisci il capillare caricato nel foro e soffia delicatamente gli embrioni nell'amplificatore fino a quando non vedi che la bolla d'aria è stata spostata dal capillare. Quindi rimuovere il capillare.

Riposizionare immediatamente gli organi riproduttivi nella cavità corporea e chiudere la cavità peritoneale con una sola sutura. Quindi, chiudere la pelle utilizzando una o due clip per ferite da nove millimetri. Rimetti l'animale nella sua gabbia di casa e sorveglialo fino a quando l'anestesia non svanisce.

Quindi ospitare le femmine in gruppi sociali stabili di due o tre topi per ridurre al minimo lo stress per i primi tre giorni postoperatori, assicurarsi di fornire un analgesico come DEF Falcon nell'acqua potabile per ogni locusta nel genoma del topo che è preso di mira con nucleasi progettate. Un test basato sulla PCR è progettato per identificare gli animali fondatori che portano un allele mutato desiderato. Nel primo esempio, fondatori originati dalla microiniezione di una coppia di nucleasi della coda.

Il targeting della regione di rivestimento del gene della proteina prionica del topo è stato analizzato mediante digestione endonucleasica T sette di un prodotto PCR. Il saggio di digestione dell'endonucleasi T seven si basa sulla formazione di etero duplex tra filamenti di DNA di prodotti PCR generati da alleli mutati e wild type. La mutagenesi indotta da Talon all'interno della regione genomica mirata di singoli fondatori è stata rivelata dalla comparsa di prodotti per la digestione lunga accoppiati a 250 e 110 basi in aggiunta al prodotto PCR a lunghezza intera.

In alternativa, i prodotti della PCR possono essere sottoposti a un digest di restrizione se un sito di restrizione diagnostica adatto si trova all'interno della regione dello spaziatore della coppia di nucleasi designer. Nel secondo esempio, ZFN prende di mira un sito di restrizione XPO one situato all'interno dell'introduzione, uno dei locus Rosa 26 del topo. Qui le bande non digerite indicano la presenza di mutazioni.

Gli asterischi segnano, l'assenza di qualsiasi prodotto digerito suggerisce fortemente un fondatore portatore di mutazioni in entrambi gli alleli del gene bersaglio. La clonazione e il sequenziamento di questi prodotti PCR non digeriti rivela che i topi fondatori possono ospitare due o più modifiche distinte dell'allele bersaglio. L'assenza di sequenze wild type indica la completa ablazione del gene bersaglio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della progettazione della nucleasi della coda, dell'assemblaggio della coda, dei costrutti della nucleasi e di come usarli per generare topi mutanti mediante microiniezione diretta di oside. Questo metodo può essere adattato per funzionare con altre classi di nucleasi progettate, come lo zinco, i nuclei a dito o CAS nine crispr. Può anche facilitare la modifica del genoma mediante ricombinazione omologa attraverso la co-iniezione simultanea della nucleasi e del modello di targeting genico appropriato.