Name: Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Impara a generare topi geneticamente modificati usando TALEN per modifiche precise del genoma. Questo metodo include microiniezione di mRNA in ovociti fecondati e trasferimento in madri portatrici.

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Vorremmo ringraziare Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, e Ewa Skoczylas per l&#39;eccellente assistenza tecnica. Questo studio è stato finanziato dal FNS Sinergia concessione CRSI33-125.073 a PP.

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</ol>

Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.

Genoma approcci editing nucleasi-driven Designer hanno notevolmente ampliato la gamma di specie suscettibili di modifiche mirate dei rispettivi genomi 10,12. Nei topi,-gene targeting nelle cellule ES è una tecnica standard per oltre due decenni; tuttavia, si è rivelato difficile per adattarsi alle cellule staminali provenienti da specie diverse del mouse, anche se c&#39;è stata qualche recente successo in cellule ES ratto. Anche con la disponibilità di &quot;off-the-shelf&quot; cloni di cellule ES topo gene targeting fornite da consorzi come EUCOMM, KOMP, o NorCOMM 3 modifica del genoma da ZFN e TALEN fornisce una maggiore precisione e flessibilità per quanto riguarda la gamma di modifiche che possono essere introdotto nel genoma del mouse. Fondatore animali portatori di mutazioni nucleasi-mediata sembrano essere altamente linea germinale competente 4-6,20,21, che non è sempre il caso di chimere provenienti da blastocisti iniezioni di cellule staminali. Pertanto, in alcuni casi microiniezione di desnucleasi igner possono provocare generazione significativamente più veloce delle linee di nuovi mouse con modificazioni del genoma mirati. Il successo generazione di topi knockout per iniezione di ZFN e TALEN dipende in larga misura l&#39;attività della coppia nucleasi iniettato. Talens hanno dimostrato di avere un alto tasso di successo in mira una vasta gamma di geni in un numero di organismi; Tuttavia, studi recenti suggeriscono che TALEN legame è sensibile alla citosina metilazione 30,31. Così, coppie nucleasi appena generati, per esempio Talens clonati in vettori pCAG-T7, possono essere trasfettate transitoriamente in una linea cellulare di topo come NIH-3T3 o Neuro -2a, che imitano lo stato della cromatina embrione di topo in una certa misura. Qui, nucleasica può essere stimata utilizzando la T7 endonucleasi test o una restrizione digest del prodotto di PCR come descritto nel capitolo 5 prima sintesi di mRNA e microiniezione. Si consiglia di sequenziamento della regione genomica di interesse nel rispettoive linea cellulare e il ceppo del mouse utilizzato per esperimenti di microiniezione. In zigoti del mouse, diverse coppie Talen o ZFN lavoreranno in maniera ottimale a diverse concentrazioni di mRNA e quindi la concentrazione di lavoro ottimale della microiniezione nucleasi mRNA possono essere determinati sperimentalmente. A seconda della coppia di nucleasi, una concentrazione troppo bassa comporterà alcuna scissione, mentre troppo alta può causare letalità embrionale. A seconda della coppia nucleasi, abbiamo avuto successo usando concentrazioni di mRNA totale compresi fra 2 ng / ml e alto come 200 mcg / ul. Questi effetti sono difficili da prevedere da esperimenti in coltura cellulare e la concentrazione ottimale nucleasi sia per la sopravvivenza degli embrioni e la velocità di modifica del locus bersaglio deve essere determinato empiricamente. Altamente attivo ZFN o TALEN possono fendere la loro sequenza bersaglio oltre la fase unicellulare dell&#39;embrione microiniezione e quindi causare complessi schemi di mutagenesi und mosaicismo in fondatori. Noi e altri 4 abbiamo osservato tre o più alleli mutati distinte in un unico fondatore (Figura 5C). Così, quando si stabilisce una nuova linea di topi da questi fondatori, prole devono essere attentamente monitorati mediante sequenziamento per la presenza della mutazione favorevole da saggi di digestione forniscono la prova che solo una mutazione indefinito è presente. Una delle critiche spesso hanno espresso contro i sistemi ZFN e Talen è la possibilità che questi nucleases sono anche in grado di scindere sequenze presenti altrove nel genoma che sono simili ai siti di destinazione. Tali effetti off-target sono stati osservati con i reagenti di prima generazione utilizzando il dominio omodimerica FokI e costrutti eterodimero stati progettati per alleviare gli effetti 25 off-target. Potenziali siti off-bersaglio possono essere previsti in una certa misura in silico 32,33 e screening mediante PCR e sequenziamento. Un evidente vantaggio of usando ZFNs e Talens per la generazione di topi piuttosto che linee cellulari è la possibilità di rimuovere off mutazioni di destinazione non collegate alla modificazione del genoma desiderato eseguendo diversi reincroci ad un ceppo selvatico di scelta. Per l&#39;analisi di un gran numero di topi fondatori, prossima generazione sequenziamento dei prodotti di PCR generati dal locus nucleasi targeting e in silico previsti off-target loci potrebbe offrire una lettura qualitativa e quantitativa alternativa ai saggi di digestione dei prodotti di PCR. Le tecniche di riproduzione assistita descritte in questo protocollo sono ottimizzati per i ceppi mouse standard utilizzati per esperimenti di microiniezione come C57BL/6J o B6D2F1. I topi di diversa origine, quali ceppi dell&#39;esoincrocio, in linea di principio essere utilizzati per approcci modifica del genoma e potrebbero fornire un background genetico più adatto per domande di ricerca specifiche. Le prestazioni di tecniche di riproduzione assistita come la superovulazione può essere predicatoCTED per un numero di ceppi 34-36 ma potrebbe richiedere ulteriore ottimizzazione per i ceppi non standard al fine di ottenere un numero sufficiente di embrioni per nucleasi microiniezione. Oltre ZFN e TALEN, nuove nucleasi di design come il sistema CRISPR/Cas9 RNA-guidata 9,37,38 ora sono stati introdotti per applicazioni di editing genoma. Tutti i metodi per la microiniezione e l&#39;analisi di animali fondatori qui descritti sono applicabili a CRISPR/Cas9 e le modalità future di modifica del genoma anche.

I topi sono di gran lunga la piattaforma più popolare per la generazione di modelli animali transgenici. Il toolbox versatile per l&#39;ingegneria genetica dell&#39;embrione topo 1-3 è stato recentemente prorogato di approcci di modifica del genoma basato su nucleases stilisti come nucleasi dito di zinco (ZFN) 4-6, trascrizione nucleases effettrici attivatore-like (Talen) 7,8, ed i cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) / Sistema CRISPR-associato (CAS) 9 9. ZFN e la funzione TALEN come coppie di due domini progettati su misura a base di proteine ​​che legano il DNA (array di proteine ​​dita di zinco e ripetere variabile di-residui (RVDS), rispettivamente) che sono ciascuno accoppiato al endonucleasi FokI 10-12. Viceversa, la specificità di taglio del DNA Cas9-mediata è fornito da transattivazione RNA CRISPR (crRNA e tracrRNA, che possono anche essere combinati in una singola molecola di RNA chimerico guida definito RNA) 11 che agiscono in un complesso con l&#39;Proteine ​​CRISPR. Talens con una sequenza definita di RVDS può essere rapidamente costruito dagli sperimentatori individuali con una moltitudine di strategie di assemblaggio scegliere 13-17. CRISPR/Cas9 promette ancor meno generazione ad alta intensità di manodopera di nucleasi di design, tuttavia la specificità della guida RNA-DNA-binding non è ancora completamente risolto 18,19. Generazione di ZFNs misura è stata finora limitata a laboratori accademici specializzati e fornitori commerciali come Sangamo Biosciences e il servizio Sigma CompoZr. In generale, genome editing con nucleasi design mira a introdurre doppie rotture del filamento (DSB) a loci genomici definito, che poi attirano fine nonhomologous giunzione (NHEJ) o ricombinazione omologa (HR) di riparazione del DNA macchinari 10,12. Riparazione NHEJ-mediata di un DSB provoca spesso l&#39;introduzione di inserzioni e delezioni in prossimità del sito di riparazione. Così NHEJ riparazione cun essere sfruttati per buttare giù la funzione di un gene bersaglio introducendo una mutazione frame-shift ai geni codificanti proteine ​​sequenza 4,7,9. In alternativa, aggiunta o sostituzione di informazioni genetiche definite possono essere raggiunti realizzando un donatore DNA insieme alle nucleasi progettista. Un donatore di DNA comprende ricercatore-progettato sequenze di DNA fiancheggiati da regioni di omologia con il locus bersaglio, quindi servire come modello per la riparazione DSB da HR. Entrambi i plasmidi 5,6,20 e singolo filamento oligonucleotidi 8,9,21 sono stati utilizzati con successo come donatori. Né-NHEJ né HR-mediata editing genoma richiedono l&#39;introduzione di un marcatore selezionabile nel genoma dell&#39;embrione mouse, che rende queste strategie particolarmente adatto per la creazione di piccole alterazioni nella sequenza nucleotidica senza disturbare l&#39;architettura genetica complessiva. In questo protocollo si descrivono tutte le procedure essenziali per l&#39;editing genoma nellaembrione di topo usando Talens. Questi includono 1) individuazione di un sito di destinazione TALEN 22, 2) la costruzione di Talens dal Golden Gate clonazione 13, 3) la sintesi in vitro di TALEN mRNA, 4) la microiniezione di mRNA TALEN in ovociti di topo fecondati, 5) le procedure chirurgiche per il trasferimento di embrioni e 6) analisi di mutagenesi TALEN indotta in animali fondatori. Ci concentriamo su TALEN mRNA microiniezione e lo screening dei fondatori per NHEJ-indotte inserzioni / delezioni. A questo scopo abbiamo generato bifunzionali costrutti Talen che permettono sia l&#39;espressione in cellule di mammifero, quando trasfettate come plasmidi e nella sintesi in vitro di TALEN mRNA per microiniezione in embrioni di topo. Questi costrutti comprendono una spina dorsale RACCONTO troncato 23 fusi per eterodimerica FokI domini 24,25 per ottimizzare la modifica del genoma nelle cellule di mammifero. Questo protocollo può anche essere adottata per microiniezione di altre nucleasi di design o per le iniezioni combinate di nucleasi di designe costrutti donatori (disegno di donatori di DNA è stata descritta in eccellenti pubblicazioni tecniche Wefers et al. 26,27). Dichiarazione etica Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti del veterinario cantonale del Canton Zurigo.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S o L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202S o L</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomicina</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasi sicura per plasmidi</td><td>Epicentro</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Kit Midi plasmidico</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit di purificazione</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGGIO mMACHINE T7 Ultra Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Spin Columns</td><td>Invitrogen</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Formaldyde Load Dye</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA Millennium Markers</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE tampone</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonucleasi</td><td>NEB</td><td>M0302S o L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector System I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>cavalla incinta&#039; s gonadotropina sierica (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>gonadotropina corionica umana (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 terreno di coltura embrionale</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 terreno di coltura embrionale</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale, embrionale testato</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Attrezzatura/Strumenti</td></tr><tr><td>Microscopio invertito con ottica Nomarski DIC (ad esempio Nikon Eclipse TE200)</td><td>Unità</td> di micromanipolatore Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>(ad esempio Narishige, NT88NF)</td>Capillari di tenuta per embrioni <td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Capillari per iniezione di embrioni</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore capillare (ad esempio Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge (ad esempio Narishige MF-900)</td>Forbici per pelle <td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonda chirurgica</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di clip per ferite riflesse (9 mm)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Clip per ferite riflesse (9 mm)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fine Dumont 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva Moria</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fine Moria</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto bulldog Dietrich</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J topi</td><td>Jackson Labs</td><td>ceppo codice 000664</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 topi</td><td>Charles River</td><td>ceppo codice 000664</td><td></td></tr></tbody></table>

genoma ingegneria mouse usando nucleases designer

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Topi transgenici portatori modificazioni sito-specifiche genoma (knockout, knock-in) sono di importanza vitale per sezionare sistemi biologici complessi nonché per la modellazione malattie umane e testare strategie terapeutiche. I recenti progressi nell&#39;uso di nucleasi design come nucleasi dito di zinco (ZFNs), trascrizione attivatore-come nucleases effettrici (Talens), ed i cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) / CRISPR-associato (CAS) Sistema 9 per il sito- specifico ingegneria genomica aperta la possibilità di effettuare una rapida modificazione genoma mirata in virtualmente qualsiasi specie di laboratorio senza la necessità di fare affidamento su staminali embrionali (ES) tecnologia cellulare. Un esperimento editing genoma inizia tipicamente con l&#39;identificazione di design nucleasi siti bersaglio all&#39;interno di un gene di interesse seguita dalla costruzione di domini leganti il ​​DNA personalizzati per dirigere l&#39;attività nucleasi al locus genomico investigatore definito. Plasmidi Designer nucleasi sono in vitro &lt;/ Em&gt; trascritto per produrre mRNA per la microiniezione degli ovociti di topo fecondati. Qui, forniamo un protocollo per realizzare la modifica del genoma di mira da iniezione diretta di TALEN mRNA in oociti di topo fecondati.

Abbiamo costruito plasmidi destinazione compatibili con l&#39;assieme dorato GateTALEN pubblicato da Cermak et al. 13 che permettono l&#39;espressione di Talens in cellule di mammifero e in vitro sintesi di mRNA dal promotore T7 fago (Figura 1C). Questi plasmidi carry domains Foki eterodimeriche (mutazioni eld o KKR) oggi dimostrati ridurre gli effetti fuori bersaglio relativamente per omodimeri Foki ea potenziare l&#39;attività scissione rispetto alla prima generazione FokI eterodimeri 25,29. Le reazioni di montaggio Golden gate # 1 e # 2 sono di solito molto efficiente e ogni colonia bianca, quando analizzato da colonia PCR, mostra il modello previsto per il particolare numero di RVDS clonati (Figure 1B e 1D). Gel di analisi in vitro sintetizzato mRNA (Figura 2) dovrebbe rivelare una singola banda distinguibile con poca o nessuna sbavatura per ogni campione analizzato. Ci dovrebbe essere un cambiamento chiara dimensione tra i campioni L1/R1 e L2/R2, L3/R3, che indica poliadenilazione successo. Animali fondatori possono essere sottoposti a screening per alleli mutati NHEJ indotte mediante genotipizzazione PCR seguito da digestione T7 endonucleasi (figura 3) o una digestione di restrizione usando un enzima che scinde la sequenza wild type all&#39;interno della regione distanziatore della coppia nucleasi (Figura 4). Il saggio T7 endonucleasi è applicabile a qualsiasi tipo di mutazione indipendentemente dalla sequenza genomica specifica all&#39;interno della regione distanziatore della coppia nucleasi iniettato; tuttavia, si rileva solo i disallineamenti tra i filamenti di DNA in prodotti di PCR eteroduplici. Così, nel raro caso in cui uno dei fondatori porta due alleli mutati in modo identico, i prodotti di PCR potrebbero non mostrare alcun modello T7 digestione. Questa distinzione è tuttavia sempre possibile quando un sito di restrizione specifico si trova all&#39;interno della regione spacer nucleasi che verrà eliminato NHEJIndotta inserzioni / delezioni (Figura 5). Qui, le bande non digerito indicano la presenza di mutazioni, e l&#39;assenza di qualsiasi prodotto digeriti suggerisce fortemente fondatore trasportano mutazioni in entrambi gli alleli del gene targeting (contrassegnati con l&#39;asterisco sono obbligatori in Figura 4b). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> Figura 1. Golden Gate clonazione di Talen RVDS in eterodimeriche vettori pCAG-T7-Destination. A) Assemblea dei RVD matrici in vettori pFUS. Ecco un esempio viene mostrato per una coppia di TALEN con singoli array TALE composto da 15 RVDS e 17 RVDS, rispettivamente (per array TALE più di 21 RVDS, tre assemblee pFUS-RVDS sono necessari, non mostrato). Le frecce indicano primer per b) i prodotti pFUS specifico reazioni colonia PCR PCR.amplificato dalle assemblee pFUS corrette in genere mostrano una banda corrispondente alla durata totale di tutte RVDS clonati (ad esempio circa 1,1 kb per 10 RVDS) e C &quot;scala&quot; dei piccoli gruppi meno importanti a causa della natura ripetitiva di array RVD.) assemblaggio finale di array pFUS-RVD e un plasmide contenente l&#39;ultima ripetizione (PLR) in eterodimeriche vettori di espressione Talen con FokIELD e FokIKKR varianti, rispettivamente. La spina dorsale TALEN (annotato come N e C) ricorda l&#39;architettura pubblicato da Miller et al. 23 Il CAG (CMV elemento presto enhancer / pollo beta-actina) promotore assicura alti livelli di espressione in cellule di mammifero trasfettate, mentre il promotore T7 fago permette in sintesi vitro mRNA (utilizzare SacI per la linearizzazione del vettore a valle del codone di stop nucleasi). D) Colony PCR utilizzando primer indicati dalle frecce C) permette di identificare correttamente montato Talens. Full-lungezzah prodotti di PCR sono spesso meno evidenti, mentre l &#39;&quot;effetto scala&quot; rappresenta un indicatore affidabile di montaggio successo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> Figura 2. . Controllo di qualità dei nuclease mRNA in sintesi vitro mediante elettroforesi su gel di agarosio mRNA ZFN sono mostrati come esempio (L, sinistra ZFN, R, destra ZFN). I campioni L1/R1 mostrano mRNA prima di poliadenilazione, i campioni L2/R2 spettacolo poliadenilato mRNA e L3/R3 mostra purificato mRNA poliadenilato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img<html> alt = &quot;Figura 3&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 3. Esempio di endonucleasi saggio T7 utilizzato per l&#39;identificazione di animali fondatori portatori di mutazioni nucleasi indotta del locus bersaglio. A) Una coppia TALEN è stato progettato per fendere all&#39;interno della regione codificante del mouse gene della proteina prionica (PRNP, sequenza bersaglio TALEN può essere fornito su richiesta). Un prodotto di PCR viene generato utilizzando un primer forward (F) situato 110 bp a monte e un primer reverse (R) 250 bp a valle del sito di clivaggio TALEN. B) Il prodotto di PCR viene successivamente sottoposto a heteroduplex formazione e T7 digestione con endonucleasi. C) TALEN mutagenesi indotta all&#39;interno della regione genomica mirata di singoli fondatori è rivelato dalla presenza di un full-length prodotto PCR con prodotti di digestione di 250 e 110 bps.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> Figura 4. Esempio di una restrizione digest di prodotti di PCR utilizzati per l&#39;identificazione degli animali fondatori portatori di mutazioni nucleasi-indotte del luogo di destinazione. ZFN specifici per il mouse Rosa26 locus 29 bersaglio di un sito di restrizione XbaI all&#39;interno introni 1. A) Fondatori sono stati proiettati per la genotipizzazione PCR utilizzando un primer forward (F) situato a 500 bp a monte e un primer reverse (R) 250 bp a valle del sito di taglio. B) Digestione dei prodotti di PCR con XbaI svela i modelli di digestione che indicano topi con mutazioni bi-alleliche (contrassegnati con asterisco), mono alleliche mutazioni (bande digerito e digerito, ad esempio animali 2)e topi WT (digestione completa, ad esempio animali 21). C) sequenziamento di topi con potenziali modifiche bi-allelica mostra fino a 3 (24 animali) distinti inserzioni / delezioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome del Primer </td><td> Sequenza 5 &#39;a 3&#39; </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Sequenze di primer utilizzati per la PCR e sequenziamento delle colonie all&#39;interno del gruppo di Golden Gate TALENprotocollo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Plasmide / Collezione </td><td> Collaboratore </td><td> Addgene ID </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit 2.0 </td><td> Voytas lab </td><td> 1000000024 </td><td> Contiene tutti i plasmidi necessari per l&#39;assemblaggio Golden Gate TALEN </td></tr><tr><td> vettori di destinazione pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD </td><td> Pelczar lab </td><td> 40131, 40132 </td><td> Add-on plasmidi per l&#39;espressione TALEN in cellule di mammifero e in vitro sintesi di mRNA </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Plasmidi e collezioni plasmidi necessari per il montaggio Golden Gate TALEN possono essere ottenuti da Addgene ( <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> OnlineRisorsa </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> Progettazione di TALEN; TALEN previsione off-target </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> Progettazione di TALEN, APERTO ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> Progettazione di TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 previsione off-target </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> Assemblea dei TALEN sequenze per la conferma dei risultati di sequenziamento </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> Progettazione di assemblaggio modulare ZFN </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> Progettazione di assemblaggio modulare ZFN </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Risorse online per la progettazione ZFN, TALEN, e CRISPR/Cas9. </strong&gt;

Nucleasi di stilisti come nucleasi dito di zinco (ZFNs) e attivatore di trascrizione come nucleases effettrici (Talens) possono essere utilizzati per modificare il genoma di embrioni preimpianto di topo attivando sia la fine nonhomologous giunzione (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) percorsi. Questi progressi consentono la rapida generazione di mouse con precise modificazioni genetiche.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare rapidamente topi con deficit genetico con l'aiuto di nucleasi della coda o artigli. Ciò si ottiene progettando e assemblando prima costrutti di DNA che codificano specifiche coppie di taloni, che fungono da modelli per la trascrizione in vitro per generare mRNA di Talon. I passaggi successivi della procedura sono l'isolamento dei citi di topo fecondati e quindi la microiniezione con il T.Il passaggio finale consiste nel trasferire chirurgicamente i citi iniettati nelle madri adottive pseudo gravide.La progenie F zero risultante mostra frequentemente delezioni sito-specifiche delle sequenze genomiche che spesso portano alla perdita della funzione del gene bersaglio. Sebbene il metodo qui presentato possa fornire informazioni sulla funzione genica nei topi, l'approccio di base può essere adattato anche ad altri organismi modello come ratti e pesci. Innanzitutto, accedi al sito Web del bersaglio nucleotide effettore TAL sul sito.Scegli il programma di targeting TN e incolla la sequenza del gene target. Per questo protocollo. Usa i costrutti di espressione P-C-A-G-T e il kit di effettori Golden Gate Talen e T disponibili sul gene AD.Se per l'assemblaggio Talen vengono utilizzati altri costrutti o kit di assemblaggio, le impostazioni potrebbero essere diverse per la lunghezza ottimale del distanziatore e il numero di RV di coda, scegliere l'opzione Miller Etal 2011 nell'impostazione Usa un'architettura preimpostata. Quindi seleziona NN nella scheda Sostituto G. Il programma genera un file di testo con potenziali siti di destinazione generati da questo elenco.Seleziona la coppia o le coppie Talen richieste e procedi con il montaggio del Golden Gate. Questo protocollo funziona con i ceppi di topi da laboratorio più comunemente usati, tra cui C 57, BL sei J e BDF one super ovulare 10 femmine donatrici a quattro settimane di età utilizzando un'iniezione intraperitoneale di cinque unità di gonadotropina sierica di cavalla gravida. 48 ore dopo somministrare alle femmine cinque unità di gonadotropina corionica umana anche mediante iniezione intraperitoneale immediatamente dopo l'iniezione di gonadotropina corionica umana compagno, le femmine uno a uno con i maschi in età riproduttiva lo stesso giorno, preparano le madri adottive pseudo gravide. Altri.La mattina dopo, sacrifica le femmine e recupera gli ovociti fecondati sezionando i ciottoli. Quindi rilasciare le stringhe degli ovociti in una capsula per coltura d'organo contenente un millilitro di terreno M 2. Rimuovere tutte le cellule del cumulo aggiungendo 10 microlitri di soluzione di ialuronidasi bovina allo 0,1% in un piatto contenente frizioni di citi in terreno M due.Quindi utilizzare la pipetta orale per lavare gli embrioni attraverso due o tre cambi di terreno M 2 per rimuovere la ialuronidasi. Continuare il trattamento con ialuronidasi per gli embrioni che non si sono ancora dissociati dalle cellule del cumulo. Gli embrioni isolati possono essere conservati in M 16, terreno a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando non vengono microiniettati.Preparare 100 microlitri di soluzione iniettabile contenente 10 nanogrammi per microlitro di ciascuna coda. Nucleasi, mRNA, accoppiare e centrifugare per 30 minuti a 30.000 G in pellet. Eventuali particelle che possono ostruire gli aghi per iniezione.Quindi tenere il composto sul ghiaccio. Pianifica di iniettare gli ovociti nella loro fase pronucleare nel primo pomeriggio. Immergere circa 100 embrioni in mezzo M two sotto uno strato di olio minerale e lavorare su un microscopio invertito senza ottica DIC marsy.Con un ingrandimento inferiore a 20x, selezionare i citi con pronuclei distinti. Lo smistamento degli ovociti può essere effettuato utilizzando un carico capillare di iniezione vuoto, il capillare di iniezione appena prima di essere utilizzato con uno o due microlitri di soluzione iniettabile. Quindi collegarlo alla testina di microiniezione.Quindi aspirare un cito selezionato con un capillare di tenuta ed effettuare un'iniezione superficiale dell'mRNA della nucleasi nel citoplasma. Evitare il contatto con i pronuclei. Il volume di iniezione deve essere mantenuto basso.Al primo segno di distensione citoplasmatica, ritirare l'ago. Normalmente, circa l'80-90% degli embrioni dovrebbe sopravvivere senza immediatezza. Per aumentare la quantità di mRNA iniettato, rendere la soluzione più concentrata dopo la microiniezione dei citi disponibili.Trasferirli in un terreno M 16 utilizzando una pipetta per bocca. Incubare gli embrioni per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi trasferisci quelle che sopravvivono in madri adottive pseudo incinte.Il giorno prima della microiniezione indurre una pseudo gravidanza in topi femmina di MC di età compresa tra tre e sei mesi, accoppiandoli con maschi settorizzati VA. La mattina successiva selezionare le femmine con un tappo chiaro da utilizzare come riceventi di embrioni. Le femmine inutilizzate torneranno dal loro stato di pseudo gravidanza in tre settimane e possono essere riutilizzate in seguito.Posiziona una femmina madre adottiva anestetizzata su una superficie calda sull'addome. Quindi disinfettare l'area dell'incisione spruzzandola con etanolo al 70%. Pettinare i capelli bagnati lontano dal sito di incisione previsto.Ora taglia la cavità peritoneale con le forbici ed esternalizza il corno uterino. Per fare questo. Tirare il cuscinetto adiposo attaccato all'ovaio e immobilizzare gli organi riproduttivi con una pinza per bulldog.Inoltre, assicurati di mantenere gli organi umidi con una soluzione riscaldata di cloruro di sodio allo 0,9%. A questo punto, smistate da 12 a 20 embrioni vitali e caricateli in un sottile capillare di vetro. Usando la pipetta per la bocca, aspirare prima una piccola bolla d'aria, quindi aspirare gli embrioni usando una pinza fine.Afferra delicatamente l'UCT appena a monte dell'amplificatore e crea un piccolo foro nella parete dell'UCT usando un ago calibro 30. Inserisci il capillare caricato nel foro e soffia delicatamente gli embrioni nell'amplificatore fino a quando non vedi che la bolla d'aria è stata spostata dal capillare. Quindi rimuovere il capillare.Riposizionare immediatamente gli organi riproduttivi nella cavità corporea e chiudere la cavità peritoneale con una sola sutura. Quindi, chiudere la pelle utilizzando una o due clip per ferite da nove millimetri. Rimetti l'animale nella sua gabbia di casa e sorveglialo fino a quando l'anestesia non svanisce.Quindi ospitare le femmine in gruppi sociali stabili di due o tre topi per ridurre al minimo lo stress per i primi tre giorni postoperatori, assicurarsi di fornire un analgesico come DEF Falcon nell'acqua potabile per ogni locusta nel genoma del topo che è preso di mira con nucleasi progettate. Un test basato sulla PCR è progettato per identificare gli animali fondatori che portano un allele mutato desiderato. Nel primo esempio, fondatori originati dalla microiniezione di una coppia di nucleasi della coda.Il targeting della regione di rivestimento del gene della proteina prionica del topo è stato analizzato mediante digestione endonucleasica T sette di un prodotto PCR. Il saggio di digestione dell'endonucleasi T seven si basa sulla formazione di etero duplex tra filamenti di DNA di prodotti PCR generati da alleli mutati e wild type. La mutagenesi indotta da Talon all'interno della regione genomica mirata di singoli fondatori è stata rivelata dalla comparsa di prodotti per la digestione lunga accoppiati a 250 e 110 basi in aggiunta al prodotto PCR a lunghezza intera.In alternativa, i prodotti della PCR possono essere sottoposti a un digest di restrizione se un sito di restrizione diagnostica adatto si trova all'interno della regione dello spaziatore della coppia di nucleasi designer. Nel secondo esempio, ZFN prende di mira un sito di restrizione XPO one situato all'interno dell'introduzione, uno dei locus Rosa 26 del topo. Qui le bande non digerite indicano la presenza di mutazioni.Gli asterischi segnano, l'assenza di qualsiasi prodotto digerito suggerisce fortemente un fondatore portatore di mutazioni in entrambi gli alleli del gene bersaglio. La clonazione e il sequenziamento di questi prodotti PCR non digeriti rivela che i topi fondatori possono ospitare due o più modifiche distinte dell'allele bersaglio. L'assenza di sequenze wild type indica la completa ablazione del gene bersaglio.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della progettazione della nucleasi della coda, dell'assemblaggio della coda, dei costrutti della nucleasi e di come usarli per generare topi mutanti mediante microiniezione diretta di oside. Questo metodo può essere adattato per funzionare con altre classi di nucleasi progettate, come lo zinco, i nuclei a dito o CAS nine crispr. Può anche facilitare la modifica del genoma mediante ricombinazione omologa attraverso la co-iniezione simultanea della nucleasi e del modello di targeting genico appropriato.

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Genome Editing con nucleasi zinco Finger CompoZr personalizzati (ZFNs)

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Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

CRISPR-Cas è una potente tecnologia per progettare i complessi genomi delle piante e degli animali. Qui, dettagliamo un protocollo efficiente modificare il genoma umano usando diverse endonucleasi di Cas. Evidenziamo considerazioni importanti e parametri di progettazione per ottimizzare l'efficienza di editing.

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

Qui presentiamo un metodo modificato per la crioconservazione di embrioni unicellulari, nonché un protocollo che afcoppia l'uso di embrioni congelato ed elettroporazione per la generazione efficiente di topi geneticamente modificati.

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

Il presente protocollo descrive la microiniezione di zigote di CRISPR-Cas9 e DNA del donatore per produrre in modo efficiente topi knock-in e floxed con cassette geniche.

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

Qui, descriviamo una semplice tecnica destinata alla generazione efficiente di topi geneticamente modificati chiamata CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Questo metodo fornisce reagenti di editing mediante elettroporazione negli embrioni con un'efficienza vicina al 100%. Questo protocollo è efficace per mutazioni puntiformi, piccole inserzioni genomiche e delezioni in embrioni di mammifero.

Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

L'efficienza del metodo I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) è paragonabile alla microiniezione tradizionale, che richiede la raccolta di zigoti da femmine donatrici e il trasferimento a femmine pseudo-gravide. Questo protocollo dimostra la sua efficacia introducendo mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel locus ROSA26 sul cromosoma 6.

Miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

Approcci sperimentali di ingegneria dei tessuti

Impara a generare topi geneticamente modificati usando TALEN per modifiche precise del genoma. Questo metodo include microiniezione di mRNA in ovociti fecondati e trasferimento in madri portatrici.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

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