Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere le procedure necessarie per la generazione con successo di topi geneticamente modificati mediante microiniezione di ovociti. Questo protocollo può essere utile ai ricercatori e al personale tecnico coinvolti sia nel campo della generazione di topi, sia in quello del targeting genico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si basa sull'iniezione diretta negli ovociti di topo, sia per l'integrazione casuale, sia per il targeting genico, consentendo la generazione di topi geneticamente modificati in sole sei settimane.

Per preparare un singolo RNA guida, dopo aver selezionato le due sequenze bersaglio desiderate e aver preparato i primer secondo il protocollo indicato nel testo, sintetizzare un template di DNA lineare diluendo il plasmide PX330 a 10 nanogrammi per microlitro in acqua priva di nucleasi. Preparare un mix master, aggiungendo la polimerasi alla fine, e mantenere in ghiaccio. Quindi mescolare e suddividere la soluzione in otto provette per PCR.

Aggiungere un microlitro di PXR330 per ogni provetta ed eseguire il seguente programma. Successivamente, utilizzare un kit di purificazione PCR, un manifold e una fonte di vuoto per purificare il prodotto PCR. Aggiungere cinque volumi di buffer di legame a un volume del campione PCR e mescolare.

Posizionare la colonna con membrana di silicio sull'apparecchio. Per legare il DNA, applicare tutti e otto i campioni alla colonna sotto vuoto. Per lavare il campione, aggiungere 0,75 millilitri di tampone di lavaggio sulla colonna ed esercitare il vuoto.

Quindi, centrifugare la colonna a 12.000 × g per 60 secondi per eliminare l'etanolo residuo. Posizionare la colonna in una provetta microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri, quindi, per eluire il DNA, aggiungere 30 microlitri di acqua priva di nucleasi al centro della membrana. Lasciare riposare la colonna per un minuto e centrifugarla a 12.000 × g per 60 secondi.

Quindi utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione di DNA. Per eseguire la trascrizione in vitro utilizzando un kit di sintesi di RNA T7, preparare il mix master e incubare la reazione in un termociclatore a 37 °C per tre ore. Aggiungere 28 µL di acqua priva di nucleasi e 2 µL di DNAse I, e incubare la reazione per altri 15 minuti.

Per purificare l'RNA, sciogliere la polvere contenuta nella colonna centrifugabile fornita in 650 microlitri di tampone privo di nucleasi per microiniezione. Rimuovendo con attenzione tutte le bolle d'aria, chiudere il tubo e idratare la soluzione a temperatura ambiente per cinque-quindici minuti. Rimuovere il tappo blu inferiore e posizionare la colonna in un tubo da due millilitri.

Quindi centrifugare il tubo a 750 ×g a temperatura ambiente per due minuti. Successivamente, posizionare la colonna in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e applicare 50 microlitri della soluzione di RNA goccia a goccia al centro, senza toccare la parete della colonna. Quindi, centrifugare la colonna a 750 ×g per due minuti.

Misurare la concentrazione di RNA e valutare la qualità dell'RNA seguendo il protocollo indicato nel testo. Utilizzando un tampone di microiniezione privo di nucleasi, diluire l'mRNA della caseina nove a 50 nanogrammi per microlitro e gli sgRNA a 12,5 nanogrammi per microlitro per esperimenti di knockout genico. Aggiungere il template donatore a una concentrazione di 200 nanogrammi per microlitro, per la modifica del genoma basata sulla riparazione diretta mediante omologia, e mantenerlo sul ghiaccio.

Utilizzare il bocchino dell'aspiratore per lavare gli oociti con quattro gocce fresche di aminoacidi della caseina. Trasferirli quindi in una goccia finale di mezzo casome otto, ricoperta con olio minerale. Per eseguire l'iniezione pronucleare finalizzata all'integrazione casuale, sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare il bocchino dell'aspiratore per trasferire circa 50 uova in una goccia di mezzo m2, ricoperta con olio minerale, che fungerà da camera di iniezione.

Trasferire la camera di iniezione su un microscopio invertito e iniettare gli ovociti fecondati con alcuni picolitri della miscela di iniezione. Il pronucleo si gonfierà se l'iniezione ha successo. Eseguire l'iniezione citoplasmatica per il targeting genico, utilizzare un boccaglio per trasferire circa 50 uova in una goccia di casome A, contenente cinque microgrammi per millilitro di citocalasina B e incubare le uova a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque minuti.

Trasferire le uova nella camera di iniezione, quindi, a pressione molto bassa, iniettare alcune picolitri della miscela di iniezione nel citoplasma, utilizzando, ove possibile, la pressione di compensazione del micropipettatore automatico. Dopo l'iniezione, utilizzare il boccaglio per trasferire gli oociti nuovamente in una goccia di aminoacidi casomeici.

Mantenerli a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino al caricamento per il reimpianto nelle ovidutti di femmine pseudogravide. Dopo aver anestetizzato una topolina con copulazione verificata seguendo il protocollo descritto nel testo, per eseguire il reimpianto in condizioni sterili, esporre il tratto riproduttivo praticando con un bisturi un'incisione lunga un centimetro parallela alla linea mediana dorsale. Successivamente, con le forbici, tagliare il muscolo e utilizzare pinzette per afferrare il cuscinetto adiposo.

Estrarre delicatamente l'ovaio finché l'ovidotto e l'utero a esso collegati siano chiaramente visibili. Quindi utilizzare una pinza vascolare per fissare il cuscinetto adiposo. Sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare un paio di forbici microchirurgiche per praticare un'incisione nella parete dell'ovidotto, alcuni millimetri a monte dell'ampolla.

Inoltre, sotto il microscopio stereoscopico, caricare 25 uova microiniettate nella capillare di vetro collegata al boccaglio. Successivamente, inserire la capillare di vetro nell'ovidotto ed espellere le uova fino a quando non si osserva una bolla d'aria all'interno dell'ampolla. Per verificare che il reimpianto sia stato eseguito con successo, è necessario controllare la presenza della bolla d'aria nell'ampolla, il che garantisce che tutte le uova siano state espulse nella posizione corretta e che nessuna rimanga nella capillare di vetro.

Rimuovere delicatamente la capillare di vetro e riposizionare il tratto riproduttivo all'interno dell'addome. Quindi utilizzare tre punti di sutura chirurgica non assorbibili 0-0 per suturare l'incisione e successivamente chiudere la cute con graffette chirurgiche. Posizionare il topo su un tappetino riscaldato per evitare l'ipotermia ed iniettare un analgesico per via sottocutanea.

Monitorare il topo fino al completo recupero. Infine, eseguire il genotipaggio e il sequenziamento secondo il protocollo descritto nel testo. Questa figura mostra gel analitici che dimostrano la qualità della purificazione del transgene e della sintesi dell'sgRNA, entrambi fondamentali per generare con successo topi geneticamente modificati.

Qui mostrato c'è un tipico risultato di una sessione di microiniezione per l'integrazione casuale. L'innesco per il genotipaggio dovrebbe essere posizionato sul transgene ed essere progettato per generare un frammento di 200-800 paia di basi. In questo risultato per il targeting genico, gli inneschi sono stati selezionati per ibridarsi con il DNA genomico al di fuori della regione che verrà successivamente escissa dai due guy.

Questa strategia consente l'identificazione diretta di fondatori eterozigoti e omozigoti knock out. Come illustrato qui, quando ogni passaggio del protocollo viene ottimizzato, la percentuale di cuccioli transgenici dovrebbe raggiungere dal 10% al 25% per integrazione casuale, un valore piuttosto basso rispetto alla capacità dei componenti CRISPR di modificare il genoma murino. Utilizzando CRISPR per il targeting genico, il numero di fondatori è generalmente più elevato, compreso tra il 25% e il 100%; non è raro ottenere un'intera prole che risulta omozigote con successo dopo la modifica mediante CRISPR.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori in campi come, ad esempio, le neuroscienze o l'oncologia, di utilizzare nuovi modelli di mascheramento per scoprire meccanismi patologici e, eventualmente, tradurli in strategie terapeutiche.