Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere le procedure necessarie per la generazione di successo di topi geneticamente modificati mediante microiniezione di ovociti. Questo protocollo può aiutare i ricercatori e il personale tecnico coinvolto sia nel campo della genesi dei topi, ma anche nel targeting genico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si basa sull'iniezione diretta di ovociti di topo, sia per l'integrazione casuale, ma anche per il targeting genico, consentendo la generazione di topi geneticamente modificati in appena sei settimane.

Per preparare un singolo RNA guida, dopo aver selezionato le due sequenze target desiderate e aver realizzato i primer secondo il protocollo di testo, sintetizzare un modello di DNA lineare diluendo il plasmide PX330 a 10 nanogrammi per microlitro in acqua priva di nucleasi. Preparare un master mix, aggiungendo alla fine la polimerasi, e tenere in ghiaccio. Quindi mescolare e dividere la soluzione in otto provette per PCR.

Aggiungere un microlitro di PXR330 per provetta ed eseguire il seguente programma. Successivamente, utilizzare un kit di purificazione PCR, un collettore e una fonte di vuoto per purificare il prodotto PCR. Aggiungere cinque volumi di tampone legante a un volume del campione PCR e mescolare.

Posizionare la colonna di centrifuga con membrana in silicone sul collettore. Per legare il DNA, applicare tutti e otto i campioni alla colonna, sotto vuoto. Per lavare il campione, aggiungere 0,75 millilitri di tampone di lavaggio alla colonna e aspirare.

Quindi, centrifugare la colonna a 12.000 volte G per 60 secondi per eliminare l'etanolo residuo. Posizionare la colonna in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri, quindi, per eluire il DNA, aggiungere 30 microlitri di acqua priva di nucleasi al centro della membrana. Lasciare riposare la colonna per un minuto e centrifugarla, 12.000 volte G per 60 secondi.

Quindi utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione di DNA. Per effettuare la trascrizione in vitro utilizzando un kit di sintesi di RNA t7, preparare la miscela master e incubare la reazione in un termociclatore a 37 gradi Celsius per tre ore. Aggiungere 28 microlitri di acqua priva di nucleasi e due microlitri di DNAsi uno, e incubare la reazione per altri 15 minuti.

Per purificare l'RNA, sciogliere la polvere contenuta nella colonna di centrifuga fornita e 650 microlitri di tampone per microiniezione privo di nucleasi. Rimuovendo con cura tutte le bolle d'aria, tappare il tubo e idratare la soluzione a temperatura ambiente per cinque-15 minuti. Togliete il tappo blu sul fondo e mettete la colonna in un tubo da due millilitri.

Quindi centrifugare la provetta a 750 volte G a temperatura ambiente per due minuti. Quindi posizionare la colonna in una provetta fresca da 1,5 millilitri e applicare 50 microlitri di soluzione di RNA goccia a goccia verso il centro, senza toccare la parete della colonna. Quindi, centrifugare la colonna a 750 volte G per due minuti.

Misurare la concentrazione di RNA e valutare la qualità dell'RNA secondo il protocollo di testo. Utilizzando un tampone per microiniezione privo di nucleasi, diluire il caso nove mRNA a 50 nanogrammi per microlitro e gli sgRNA a 12,5 nanogrammi per microlitro per esperimenti di knockout genico. Aggiungere il modello del donatore a una concentrazione di 200 nanogrammi per microlitro, per l'editing del genoma basato sulla riparazione diretta dell'omologia e mantenerlo sul ghiaccio.

Utilizzare il boccaglio aspiratore, per lavare gli ovociti con quattro gocce fresche di aminoacidi caseinici. E trasferirli in un'ultima goccia di terreno di casome otto, ricoperti di olio minerale. Per eseguire l'iniezione pro nucleare per l'integrazione casuale, sotto lo stereomicroscopio, utilizzare il boccaglio dell'aspiratore per trasformare circa 50 uova in una goccia di m2 di terreno, ricoperta di olio minerale che verrà utilizzato come camera di iniezione.

Trasferire la camera di iniezione in un microscopio invertito e iniettare gli ovociti fecondati con alcuni picolitri della miscela per iniezione. Il pronucleo si gonfierà se l'iniezione ha successo. Eseguire l'iniezione citoplasmatica per il targeting genico, utilizzare un boccaglio per trasferire circa 50 uova in una goccia di casoma A, contenente cinque microgrammi per millilitro di citocalasina B e incubare le uova a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per cinque minuti.

Trasferire gli ovuli nella camera di iniezione, quindi, a una pressione molto bassa, iniettare alcuni picolitri della miscela per iniezione nel citoplasma. Utilizzando la pressione di compensazione del microiniettore automatizzato, ove possibile. Dopo l'iniezione, utilizzare il boccaglio per trasferire nuovamente gli ovociti in una goccia di casomeamino acidi.

Tienili a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino a quando non vengono caricati per il reimpianto nell'ovidotto delle femmine pseudo gravide. Dopo aver anestetizzato un topo femmina tappato secondo il protocollo di testo, per eseguire il reimpianto in condizioni sterili, esporre il tratto riproduttivo utilizzando un bisturi a un'incisione lunga un centimetro parallela alla linea mediana dorsale. Quindi, con le forbici, taglia il muscolo e usa una pinza per afferrare il cuscinetto adiposo.

Estrarre delicatamente l'ovaio, fino a quando l'ovidotto e l'utero attaccati sono chiaramente visibili. Quindi utilizzare un morsetto per vasi per fissare il cuscinetto adiposo. Sotto lo stereomicroscopio, con un paio di micro forbici si praticano un'incisione nella parete dell'ovidotto, pochi millimetri a monte dell'ampolla.

Inoltre, sotto lo stereomicroscopio, caricare 25 micro uova iniettate nel capillare di vetro collegato al boccaglio. Quindi, inserire il capillare di vetro nell'ovidotto ed espellere le uova fino a quando non è visibile una bolla d'aria all'interno dell'ampolla. Per assicurarsi che il reimpianto sia andato a buon fine, è necessario verificare la presenza della bolla d'aria nell'ampolla, che garantisce che tutti gli ovuli siano stati espulsi nella giusta posizione e che nessuno rimanga nel capillare di vetro.

Rimuovere delicatamente il capillare di vetro e riposizionare il tratto riproduttivo nell'addome. Quindi utilizzare tre punti di sutura chirurgici zero e non assorbibili per suturare l'incisione e quindi utilizzare clip per ferite per chiudere la pelle. Posiziona il mouse su un tappetino caldo per evitare l'ipotermia e inietta l'analgesico per via sottocutanea.

Monitorare il mouse fino al completo recupero. Infine, eseguire la tipizzazione e il sequenziamento del genoma secondo il protocollo di testo. Questa figura mostra i gel analitici che dimostrano la qualità della purificazione del transgene e la sintesi dell'sgRNA, fondamentali per generare con successo topi geneticamente modificati.

Di seguito è illustrata una lettura tipica di una sessione di micro iniezione per l'integrazione casuale. Il primer di genotipizzazione dovrebbe essere posizionato sul transgene e dovrebbe essere progettato per generare un frammento di 200-800 coppie di basi. In questa lettura per il targeting genico, i primer selezionati per ibridarsi con il DNA genomico al di fuori della regione alla fine asportati dai due ragazzi.

Questa strategia consente l'identificazione diretta di fondatori knock out eterozigoti e omozigoti. Come illustrato qui, quando ogni fase del protocollo è ottimizzata, la percentuale di cuccioli transgenici dovrebbe raggiungere dal 10% al 25% per l'integrazione casuale, che è piuttosto bassa rispetto alla capacità dei componenti CRISPR di modificare il genoma del topo. Utilizzando CRISPR per il targeting genico, il numero di fondatori è generalmente più alto, compreso tra il 25% e il 100%. Non è raro ottenere un'intera progenie che è omozigote con successo quando modificata utilizzando CRISPR.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori in campi come le neuroscienze o il cancro, ad esempio, di utilizzare nuovi modelli di maschere per scoprire meccanismi patologici e infine tradurli in strategie terapeutiche.