Quantificazione e Size-profiling dei extracellulare vescicole Utilizzando sintonizzabile resistivo Pulse Sensing

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare e dimensionare le vescicole extracellulari utilizzando il rilevamento dell'impulso resistivo sintonizzabile. L'approccio standard consiste nel confrontare le attuali misurazioni di blocco prese da vescicole extracellulari purificate con quelle prese dagli standard delle perline di polistirene. Un secondo approccio alla caratterizzazione delle vescicole extracellulari consiste nell'aggiungere al campione perline di polistirene, che viene utilizzato quando si lavora con campioni complessi come le vescicole extracellulari non purificate.

Nel terreno di coltura cellulare, i dati risultanti caratterizzano la dimensione e il numero delle vescicole extracellulari, siano esse purificate o non purificate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il western blotting o la citometria a flusso di vescicole ex extracellulari legate a perle di lattice, è che questo metodo caratterizza le particelle direttamente nei fluidi biologici senza la necessità di isolamento fisico o marcatura. In generale, gli individui nuovi al metodo avranno difficoltà perché le vescicole extracellulari sono di dimensioni eterogenee.

Quando si cerca di rilevare le vescicole più piccole, le vescicole più grandi possono ostruire il nanoporo. Abbiamo aggiunto alcuni consigli pratici e trucchi al protocollo per tornare rapidamente a condizioni praticabili. Abbiamo cercato di ridurre la produzione di vescicole extracellulari e avevamo bisogno di un metodo per quantificare la concentrazione di vescicole in coltura cellulare. Snet.

Nella ricerca di metodi per caratterizzare le particelle di nanos, ci siamo imbattuti in TRPS e abbiamo modificato i suoi protocolli per renderli più adatti alla caratterizzazione di sles e colture cellulari. S e altri fluidi biologici Iniziare collegando lo strumento TRPS a un computer su cui è installato il software Eyes on Control Suite. Assicurarsi di ridurre al minimo le interferenze elettriche come discusso nel protocollo di testo.

Ora scegli la dimensione Nanopore. Un NP 100 è la scelta migliore per vescicole da 70 a 200 nanometri, mentre un NP 150 può essere utilizzato per vescicole di dimensioni da 85 a 300 nanometri. Un NP 200 è più adatto a misurare vescicole da 100 a 400 nanometri.

Quindi selezionare le particelle di calibrazione complementari in polistirene per NP 100 e NP 150, selezionare le particelle di calibrazione CPC 100 per NP 200. Utilizzare particelle di calibrazione CPC 200. Agitare le particelle di calibrazione per 30 secondi.

Se sono ancora aggregati, utilizzare la sonicazione e diluire le particelle di calibrazione in PBS alla concentrazione target. In base alla dimensione dei nanopori, il volume finale deve essere di almeno 40 microlitri. A questo punto bagnare la cella fluida inferiore dello strumento applicando 78 microlitri di PBS e rimuovendola immediatamente.

Ciò riduce il rischio di formazione di bolle sotto il nanoporo. Quindi, posizionare il Nanopore nei bracci dello strumento. Misura la distanza tra i due bracci opposti utilizzando calibri digitali.

Inserisci questo valore nel software sotto il campo chiamato allungamento e una volta inserito, clicca su calibra allungamento utilizzando la rotella laterale che controlla la distanza tra i bracci contrapposti. Allungare il nanoporo a 47 millimetri. Una volta allungato a misura, riapplicare 78 microlitri di PBS sulla cellula fluida inferiore.

Iniziare il processo di calibrazione posizionando la cella del fluido superiore sul nanoporo e fissando la gabbia di schermatura. Quindi aggiungere 40 microlitri di particelle di calibrazione diluite nella cella del fluido superiore. Ora applicare almeno 0,8 kilopascal di pressione positiva.

Utilizzando il modulo a pressione variabile o VPM, selezionare una tensione positiva e fare clic su Attiva. Quindi riduci lentamente l'allungamento mentre analizzi il blocco. Eventi causati dalle particelle di calibrazione.

Man mano che l'allungamento diminuisce, l'altezza del blocco aumenterà gradualmente e il rapporto segnale/rumore migliorerà. L'aumento della tensione può anche aumentare l'altezza del blocco, ma può anche generare più rumore RMS. Interrompere la riduzione dell'allungamento quando i blocchi osservati superano adeguatamente i livelli di fondo, come indicato dal pannello di tracciamento del segnale.

In secondo luogo, osservare la velocità delle particelle. Tuttavia, questo ha un limite meno rigido. La velocità delle particelle dovrebbe idealmente essere di almeno 100 al minuto.

Tuttavia, se la velocità delle particelle è superiore a 2000 al minuto, diluire il campione e ricalibrare lo strumento. Un tasso così alto può portare a misurazioni imprecise per questa dimostrazione. Vengono caratterizzate vescicole extracellulari precedentemente purificate da una linea cellulare di tumore cerebrale.

Iniziare caricando le particelle di calibrazione nella pressa superiore della cella fluida. Accendere, quindi applicare pressione utilizzando il VPM e registrare qui almeno 500 particelle di dati. Viene applicata una pressione di 0,8 kilopascal.

Opzionalmente, è possibile effettuare anche una misurazione della pressione multipla per fare ciò, aumentare la pressione applicata e registrare un secondo file di calibrazione. Gli incrementi di pressione devono essere ora di almeno 0,2 kilopascal, rimuovere il campione dalla cella superiore e lavare la cella tre volte con 100 microlitri di PBS per lavaggio. Dopo i lavaggi, pulire la cella del fluido superiore con carta priva di lanugine.

Aggiungere l'esempio sperimentale successivo. La corrente di base deve essere entro il 3% della corrente osservata durante la misurazione delle particelle di calibrazione. In caso contrario, picchiettare o ruotare il cappuccio di schermatura, applicare lo stantuffo o rimuovere completamente il nanoporo e lavarlo con acqua.

Se la corrente osservata è buona, applicare esattamente le stesse pressioni applicate alle particelle di calibrazione. Quindi registra almeno 500 particelle e salva il file di dati. Se si verifica un'interruzione improvvisa del rilevamento delle particelle, un calo della corrente di base o un improvviso aumento del rumore RMS, mettere in pausa la registrazione e provare a sbloccare il nanoporo.

Come in precedenza, pipettare il campione su e giù. Picchiettare o ruotare il cappuccio di schermatura, applicare lo stantuffo o rimuovere completamente il nanoporo e lavarlo con acqua deionizzata. Un'altra strategia consiste nell'aumentare l'allungamento dei nanopori fino a 47 millimetri e massimizzare la pressione dal VPM per circa cinque minuti.

In quanto ciò può anche UNC scollegare l'NPO nel software. Vai alla scheda Analizza dati e avvia l'elaborazione dei dati facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'opzione dei file non elaborati e seleziona l'opzione dei file di processo. Quindi, per accoppiare il campione e i file di calibrazione, fare clic sulla casella di controllo accanto al campione.

Nella colonna calibrata, selezionare i file corrispondenti e va bene. Le scelte. Il software visualizzerà diverse caratteristiche del campione come dimensioni, distribuzione, durata della linea di base, larghezza completa, mezzi massimi e analisi della concentrazione.

Il seguente approccio viene utilizzato per campioni come i fluidi biologici che portano a un intasamento eccessivo utilizzando il metodo standard in preparazione, centrifugare almeno 50 microlitri di coltura cellulare. Supernatante contenente le vescicole extracellulari per sette minuti a 300 Gs.Preparare anche un solo controllo del terreno allo stesso modo sia per il campione che per il controllo. Trasferire 20 microlitri di surnatante in nuovi tubi e aggiungere 20 microlitri di PBS e 10 microlitri di perline di polistirene diluito a 335 nanometri a 10 milioni di perle per millilitro.

Ora impostate lo strumento come prima, utilizzando un NP 200 Nanopore e misurate il campione di controllo di sole perle in terreni. Innanzitutto, per garantire l'accuratezza, il rilevamento dello sfondo di piccole particelle non perline deve essere ridotto al minimo a meno del 10% dei rilevamenti di microsfere. A questo punto, misurare ogni campione una volta prima di registrare le repliche.

Questo distribuirà le condizioni fluttuanti dei nanopori sui campioni. Ogni campione deve essere misurato tre volte in tutta la finitura misurando nuovamente il campione del solo cordone di calibrazione. Dopo. Durante l'analisi dei dati, utilizzare un software per fogli di calcolo per eseguire calcoli di concentrazione.

Un esempio di calcolo è incluso nel protocollo scritto. Le vescicole extracellulari sono state purificate da tre colture cellulari di U 87 M-G-E-G-F-R-V, surnatante mediante ultracentrifugazione, e quindi misurate utilizzando il protocollo descritto utilizzando perle di calibrazione a 115 nanometri. È stata ottenuta una distribuzione dimensionale per le vescicole extracellulari.

Le vescicole extracellulari sono state anche quantificate direttamente dal surnatante della coltura cellulare di glioblastoma, utilizzando l'approccio alternativo che aggiunge al campione uno standard. Sono state osservate due popolazioni di nanoparticelle. Le vescicole extracellulari più piccole e lo standard noto più grande, la stima delle dimensioni delle due popolazioni basata sullo standard noto, hanno identificato la popolazione di vescicole come maggiore di 140 nanometri.

Le vescicole extracellulari più piccole potrebbero essere state rilevate utilizzando un'apertura dei nanopori più piccola, ma ci sarebbero state più ostruzioni una volta padroneggiate. Questa tecnica può essere eseguita da una a quattro ore a seconda del numero di campioni analizzati. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che i campioni possono richiedere aggiustamenti del setto nasale al protocollo.

Ad esempio, i campioni costituiti da vescicole più grandi possono richiedere l'uso di nanopori più grandi a un tratto relativamente grande, e anche le misurazioni possono essere facilitate filtrando la nostra centrifugazione di campioni per rimuovere i detriti cellulari, che possono cronometrare il nanoporo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare le vescicole extracellulari usando TRPS. A seconda del campione di vescicole extracellulari, è possibile applicare il protocollo standard o utilizzare il metodo del picco regolato.