Quantificazione e Size-profiling dei extracellulare vescicole Utilizzando sintonizzabile resistivo Pulse Sensing

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare e determinare il profilo dimensionale delle vescicole extracellulari mediante sensing resistivo a impulsi regolabile. L'approccio standard consiste nel confrontare le misurazioni del blocco di corrente ottenute da vescicole extracellulari purificate con quelle ottenute da standard di perline di polistirene. Un secondo approccio per la caratterizzazione delle vescicole extracellulari prevede l'aggiunta di perline di polistirene al campione, metodo utilizzato quando si lavora con campioni complessi come vescicole extracellulari non purificate.

In un mezzo di coltura cellulare, i dati ottenuti caratterizzano la dimensione e il numero delle vescicole extracellulari, indipendentemente dal fatto che siano purificate o non purificate. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il western blotting o la citometria a flusso di vescicole extracellulari legate a microsfera di lattice, consiste nel fatto che questo metodo caratterizza direttamente le particelle nei fluidi biologici senza necessità di isolamento fisico o marcatura. Generalmente, chi si approccia per la prima volta al metodo potrebbe incontrare difficoltà poiché le vescicole extracellulari sono eterogenee per dimensione.

Cercando di rilevare le vescicole più piccole, quelle più grandi possono ostruire il nanoporo. Abbiamo aggiunto alcune indicazioni pratiche e suggerimenti al protocollo per ripristinare rapidamente condizioni di lavoro accettabili. Abbiamo cercato di ridurre la produzione di vescicole extracellulari e avevamo bisogno di un metodo per quantificare la concentrazione di vescicole nel coltura cellulare.Snet.

Nella ricerca di metodi per caratterizzare le nanoparticelle, abbiamo individuato la TRPS e ne abbiamo modificato i protocolli per renderli più adatti alla caratterizzazione di sles, supernatanti cellulari e altri fluidi biologici. Iniziare collegando lo strumento TRPS a un computer sul quale sia installato il software Eyes on Control Suite. Assicurarsi di ridurre al minimo le interferenze elettriche, come descritto nel protocollo testuale.

Ora, scegliere la dimensione del nanoporo. Un NP 100 è la scelta migliore per vescicole di 70-200 nanometri, mentre un NP 150 può essere utilizzato per vescicole di dimensioni comprese tra 85 e 300 nanometri. Un NP 200 è più adatto per misurare vescicole di 100-400 nanometri.

Quindi selezionare le particelle di calibrazione in polistirene complementari per NP 100 e NP 150 e selezionare le particelle di calibrazione CPC 100 per NP 200. Utilizzare le particelle di calibrazione CPC 200. Vortexare le particelle di calibrazione per 30 secondi.

Se sono ancora aggregati, utilizzare la sonicazione, quindi diluire le particelle di calibrazione nel PBS alla concentrazione desiderata. In base alla dimensione dei nanopori, il volume finale deve essere di almeno 40 microlitri. Bagnare ora la cella fluida inferiore dello strumento applicando 78 microlitri di PBS e rimuovendoli immediatamente.

Questo riduce il rischio che si formino bolle sotto il nanoporo. Successivamente, posizionare il nanoporo tra i bracci opposti dello strumento. Misurare la distanza tra i due bracci opposti utilizzando un calibro digitale.

Inserire questo valore nel software nel campo denominato stretch e, una volta inserito, fare clic su calibrate stretch utilizzando la rotella laterale che controlla la distanza tra i bracci opposti. Allungare il nanoporo fino a 47 millimetri. Una volta raggiunta la dimensione desiderata, aggiungere nuovamente 78 microlitri di PBS alla cella fluida inferiore.

Iniziare il processo di calibrazione posizionando la cella fluidica superiore sul nanoporo e collegando la gabbia schermante. Aggiungere quindi 40 microlitri di particelle di calibrazione diluite nella cella fluidica superiore. Applicare ora una pressione positiva di almeno 0,8 kilopascal.

Utilizzando il modulo a pressione variabile o VPM, selezionare una tensione positiva e fare clic su accensione. Quindi ridurre lentamente l'allungamento analizzando il blocco. Eventi causati dalle particelle di calibrazione.

Al diminuire dello stretch, l'altezza del blocco aumenterà gradualmente e, di conseguenza, il rapporto segnale-rumore migliorerà. L'aumento della tensione può inoltre incrementare l'altezza del blocco, ma può generare anche un rumore RMS maggiore. Interrompere la riduzione dello stretch quando i blocchi osservati superano adeguatamente i livelli di fondo, come indicato dal pannello del tracciato del segnale.

In secondo luogo, osservare la velocità delle particelle. Tuttavia, questo parametro presenta un limite meno rigoroso. La velocità delle particelle dovrebbe idealmente essere di almeno 100 al minuto.

Tuttavia, se la frequenza delle particelle è superiore a 2000 al minuto, diluire il campione e ricalibrare lo strumento. Una frequenza così elevata può portare a misurazioni inaccurate per questa dimostrazione. Vengono caratterizzate vescicole extracellulari precedentemente purificate da una linea cellulare di tumore cerebrale.

Iniziare caricando le particelle di calibrazione nella cella superiore della pressa a fluido. Accendere quindi applicare pressione utilizzando il VPM e registrare almeno 500 particelle di dati qui. Viene applicata una pressione di 0,8 chilopascal.

Facoltativamente, è possibile effettuare anche una misurazione a pressione multipla per eseguire questa operazione: aumentare la pressione applicata e registrare un secondo file di calibrazione. Gli incrementi di pressione devono essere di almeno 0,2 kilopascal; a questo punto, rimuovere il campione dalla cella superiore e lavare la cella tre volte con 100 microlitri di PBS per ogni lavaggio. Dopo i lavaggi, asciugare la cella fluidica superiore con carta senza pelucchi.

Aggiungere quindi il campione sperimentale. La corrente di base deve essere entro il 3% della corrente osservata durante la misurazione delle particelle di calibrazione. In caso contrario, battere leggermente o ruotare il cappuccio di schermatura, applicare lo stantuffo oppure rimuovere completamente il nanoporo e lavarlo con acqua deionizzata.

Se la corrente osservata è buona, applicare le stesse pressioni utilizzate per le particelle di calibrazione. Registrare quindi almeno 500 particelle e salvare il file dei dati. Se si verifica un'interruzione improvvisa del rilevamento delle particelle, una diminuzione della corrente di base o un aumento improvviso del rumore RMS, interrompere la registrazione e tentare di sbloccare il nanoporo.

Come in precedenza, pipettare il campione su e giù. Picchiettare o ruotare il cappuccio schermante, applicare il pistone oppure rimuovere completamente il nanoporo e lavarlo con acqua deionizzata. Un'altra strategia consiste nell'aumentare l'allungamento del nanoporo fino a 47 millimetri e massimizzare la pressione del VPM per circa cinque minuti.

Poiché ciò può anche scollegare l'NPO nel software. Passare alla scheda analizza dati ed avviare l'elaborazione dei dati facendo clic con il tasto destro sull'opzione file non elaborati e selezionare l'opzione elabora file. Quindi, per accoppiare i file del campione e di calibrazione, fare clic sulla casella di controllo accanto al campione.

Nella colonna calibrata, selezionare i file corrispondenti e confermare. Le scelte. Il software visualizzerà diverse caratteristiche del campione come dimensione, distribuzione, durata della linea di base, larghezza totale, valori massimi a metà altezza e analisi della concentrazione.

Il seguente approccio viene utilizzato per campioni come fluidi biologici che causano un'eccessiva occlusione con il metodo standard di preparazione: centrifugare almeno 50 microlitri di coltura cellulare. Raccogliere il sopranatante contenente le vescicole extracellulari per sette minuti a 300 G. Preparare anche un controllo con il solo mezzo di coltura nello stesso modo, sia per il campione che per il controllo. Trasferire 20 microlitri del sopranatante in nuove provette e aggiungere 20 microlitri di PBS e 10 microlitri di soluzione diluita di microsfere di polistirene da 335 nanometri a una concentrazione di 10 milioni di microsfere per millilitro.

Ora configurare lo strumento come in precedenza, utilizzando un Nanoporo NP 200 e misurare il campione di controllo costituito esclusivamente da microsfere nel mezzo. Per prima cosa, al fine di garantire accuratezza, il rilevamento di fondo delle piccole particelle non legate alle microsfere deve essere ridotto al minimo, inferiore al 10% dei rilevamenti delle microsfere. Successivamente, misurare ogni campione una volta prima di registrare le repliche.

Questo distribuirà le condizioni fluttuanti dei nanopori tra i campioni. Ogni campione deve essere misurato tre volte, terminando sempre con la riacquisizione del solo campione di perle di calibrazione. In seguito, durante l'analisi dei dati, utilizzare un software per fogli di calcolo per effettuare i calcoli delle concentrazioni.

Un esempio di calcolo è incluso nel protocollo scritto. Le vescicole extracellulari sono state purificate dal mezzo di coltura cellulare U 87 M-G-E-G-F-R-V tre, dal sopranatante mediante ultracentrifugazione e successivamente misurate utilizzando il protocollo descritto con pallini di calibrazione da 115 nanometri. È stata ottenuta una distribuzione dimensionale delle vescicole extracellulari.

Le vescicole extracellulari sono state inoltre quantificate direttamente dal surnatante di colture cellulari di glioblastoma, utilizzando l'approccio alternativo che prevede l'aggiunta al campione di uno standard noto. Sono state osservate due popolazioni di nanoparticelle. Le vescicole extracellulari più piccole e lo standard noto più grande hanno permesso, grazie alla stima dimensionale delle due popolazioni basata sullo standard noto, di identificare la popolazione di vescicole come superiore a 140 nanometri.

È possibile che siano state rilevate vescicole extracellulari più piccole utilizzando un'apertura nanoporosa più ridotta, ma ciò avrebbe comportato un maggior numero di ostruzioni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno a quattro ore, a seconda del numero di campioni analizzati. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che i campioni potrebbero richiedere aggiustamenti settali del protocollo.

Ad esempio, campioni costituiti da vescicole più grandi potrebbero richiedere l'utilizzo di nanopori più grandi a un allungamento relativamente elevato, e inoltre le misurazioni possono essere facilitate filtrando i campioni o sottoponendoli a centrifugazione per rimuovere i detriti cellulari, che potrebbero ostruire l'nanoporo. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come caratterizzare le vescicole extracellulari utilizzando la TRPS. A seconda del campione di vescicole extracellulari, è possibile applicare il protocollo standard oppure utilizzare il metodo di aggiunta controllata.