Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

L'obiettivo generale di questa metodologia è creare schemi spaziali di proteine bioattive immobilizzate che possano essere utilizzati per studiare le risposte cellulari. Questo metodo consente di riprodurre segnali in vivo mediante strategie basate su biomateriali. Questa tecnica permette una riproduzione accurata di determinati motivi di segnalazione che non possono essere ottenuti con metodi standard di coltura, come fattori di crescita sequenziali, segnalazione tra cellule e segnali biochimici specifici nello spazio.

Questo protocollo riveste una notevole importanza rispetto ai metodi esistenti poiché fornisce un approccio semplificato per regolare la rigidità del substrato e il patterning delle proteine. Sebbene questo metodo possa favorire ulteriormente le tecnologie di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa, può anche essere applicato allo studio di altri sistemi, come lo sviluppo dei tessuti e il destino delle cellule staminali. Per iniziare, preparare le soluzioni madri per il componente principale dell'idrogel, il diacrilato di polietilene glicole, per l'iniziatore fotochimico, il fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato di litio, e per la proteina della matrice extracellulare, la fibronectina, in condizioni sterili come descritto nel protocollo testuale allegato.

Filtrare sterilmente ogni soluzione utilizzando un filtro da siringa da 0,22 micron prima di utilizzare o conservare le aliquote singole. Successivamente, avvolgere la soluzione di PEG-DA con della pellicola d'alluminio per proteggerla dalla luce. Avvolgere la soluzione madre di iniziatore fotochimico con della pellicola d'alluminio per proteggerla dalla luce e conservare la soluzione preparata a quattro gradi Celsius per un periodo di diversi mesi.

Se la soluzione madre di fibronectina è congelata, lasciare scongelare un'aliquote sterile sul ghiaccio per diverse ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Iniziare sterilizzando in autoclave un foglio di poliestere per ogni stampo per gel. Successivamente, immergere due vetrini in tre distanziatori di plastica per ogni stampo per gel in etanolo al 70% per almeno due ore.

Inoltre, immergere cinque fermagli a leva per ogni stampo per gel in etanolo al 70% per 10 minuti. Posizionare le lastre di vetro, gli spessori e i fermagli a leva su un piccolo foglio per autoclave all'interno della cappa a flusso laminare per consentire loro di asciugarsi all'aria per diverse ore. Successivamente, preparare gli stampi di idrogel posizionando gli spessori in plastica dello spessore di 0,5 millimetri lungo il bordo di una lastra di vetro.

Posizionare il secondo vetrino in alto, quindi fissare gli spaziatori stretti l'uno all'altro con clip da cartelletta. Infine, sterilizzare la superficie dello stampo posizionandolo nell'incubatore a flusso laminare e accendendo la luce UV per 30 minuti prima dell'uso. A metà del processo di sterilizzazione, capovolgere lo stampo per assicurarsi di esporre entrambe le superfici.

Preparare le soluzioni precursori del gel come descritto nella tabella uno del protocollo testuale allegato. Successivamente, mescolare i volumi di PEG-DA, fibronectina e iniziatore fotochimico per creare l'idrogel. Pipettare vigorosamente la soluzione per garantire un'omogeneità, evitando però di formare bolle d'aria.

Introdurre con la pipetta la soluzione precursore del gel con attenzione tra le due lamelle di vetro dello stampo per gel. Successivamente, posizionare lo stampo sotto una luce UV ed esporlo per uno o due minuti per formare l'idrogel. Una volta che il gel si è formato, rimuovere le clip di fissaggio e staccare delicatamente la lamella superiore esercitando una pressione opposta sui due distanziali laterali.

Quindi, utilizzare un punch per biopsia delle dimensioni appropriate per ritagliare i campioni di idrogel. Ritagliare più idrogel dal rettangolo di gel per ottenere replicati e campioni di controllo. Sterilizzare la maschera fotolitografica immergendola in etanolo al 70% per 10 minuti.

Quindi, lasciare asciugare all'aria la maschera fotografica in una cappa a flusso laminare per colture cellulari. Successivamente, pipettare da uno a due microlitri per centimetro quadrato di una soluzione proteica tiolettata sulla superficie di ciascun idrogel ritagliato per la creazione di un pattern superficiale. È importante distribuire uniformemente la soluzione proteica sulla superficie dell'idrogel per garantire un'immobilizzazione proteica omogenea.

Posizionare con attenzione la maschera fotografica sulla superficie dell'idrogel. Premere delicatamente sulla maschera per rimuovere eventuali bolle d'aria che si formano tra la maschera e la superficie dell'idrogel. Successivamente, posizionare l'idrogel sotto la luce UV ed esporlo a un secondo ciclo di luce UV per 30-60 secondi.

Lavare gli idrogeli con PBS per rimuovere eventuali specie non reagite e posizionare ciascun idrogel nella piastra a pozzetti in modo che la superficie con il motivo sia rivolta verso l'alto. Quindi, lavare i gel tutta la notte in PBS a quattro gradi Celsius. Rimuovere il PBS dai pozzetti, quindi aggiungere 250 microlitri di EGM2 basale in ciascun pozzetto e incubare i gel per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius.

Durante l'incubazione, digerire con tripsina una piastra di HUVEC quasi confluenti in una sospensione monocellulare utilizzando tecniche standard. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare con attenzione il soprannatante. Ri-sospendere il pellet cellulare in EGM2 basale senza fattori di crescita aggiunti e aggiungere una parte della sospensione cellulare ad un emocitometro.

Contare le cellule per determinare la concentrazione. Successivamente, centrifugare la piastra contenente gli idrogeli a 300 x G per tre minuti, per assicurarsi che gli idrogeli si trovino sul fondo della pozzetta e non galleggino. È fondamentale che gli idrogeli non galleggino all'interno delle pozzette.

I gel idrogelici galleggianti limiteranno il successo nel seeding cellulare e causeranno problemi nell'imaging degli idrogeli. Pipettare lentamente 75.000 cellule per centimetro quadrato al centro della superficie di ciascun idrogel, in modo da non disturbare i gel. Successivamente, posizionare la piastra in un'incubatrice per colture cellulari a 37 gradi Celsius.

Per diversi giorni, rimuovere periodicamente la piastra per osservare la migrazione cellulare in risposta al pattern proteico. Cambiare il 50% del mezzo ogni due o tre giorni. Nella formazione degli idrogeli, possono essere utilizzate diverse concentrazioni del precursore PEG-diacrilato per ottenere la rigidità del substrato desiderata.

Qui mostrata, una soluzione di PEG-DA al 20% corrisponde a una rigidità superiore a 100 chilopascal. È inoltre fondamentale considerare sia la concentrazione del foto iniziatore sia il tempo di esposizione ai raggi UV, poiché un aumento di uno qualsiasi di questi due parametri ridurrà la bioattività delle molecole legate, rappresentata in questo caso dalla bioattività della lisozima. Minimizzare l'esposizione ai raggi UV durante la formazione dell'idrogel è essenziale per mantenere gruppi funzionali acrilici liberi, necessari per le successive reazioni di immobilizzazione delle proteine.

I gel idratati esposti alla luce UV per più di due minuti non sono in grado di creare i modelli di proteine immobilizzate mostrati in rosso. Inoltre, all'aumentare dell'esposizione UV al modello proteico, un numero maggiore di proteine reagisce alla superficie. Quando preparati correttamente, le cellule possono essere coltivate su questi substrati di gel idratati stampati per manipolarne il comportamento.

Qui, le cellule endoteliali sono state seminate in modo uniforme sulla superficie di idrogeli in PEG con un pattern di VEGF. Due giorni dopo la semina, si è osservato che le cellule endoteliali migravano verso le regioni spaziali dell'idrogel contenenti la VEGF immobilizzata. Dopo lo sviluppo di questo protocollo, i ricercatori possono utilizzarlo per immobilizzare qualsiasi proteina o peptide al fine di esplorare nuove piattaforme bioattive per sistemi cellulari in vitro.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di minimizzare la concentrazione del foto iniziatore e il tempo di esposizione ai raggi UV per mantenere l'attività biologica delle molecole immobilizzate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare pattern di proteine e peptidi bioattivi su idrogeli in PEG, seminare le cellule in modo uniforme sugli idrogeli e osservare la risposta cellulare conseguente.