Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di creare pattern proteici spaziali bioattivi immobilizzati che possano essere utilizzati per studiare le risposte cellulari. Questo metodo consente di ricapitolare i segnali in vivo utilizzando strategie di biomateriali. Questa tecnica consente di imitare accuratamente alcuni motivi di segnalazione che non possono essere ottenuti utilizzando metodi di coltura standard come fattori di crescita sequenziali, cellule cellulari, segnalazione cellulare e segnali biochimici spaziali specifici.

Questo protocollo è importante per i metodi esistenti in quanto fornisce un metodo semplicistico per regolare la rigidità del substrato e il patterning proteico. Sebbene questo metodo possa far progredire l'ingegneria tissutale e le tecnologie di medicina rigenerativa, può anche essere applicato per studiare altri sistemi come lo sviluppo dei tessuti e il destino delle cellule staminali. Per iniziare, preparare le soluzioni madre per il principale componente dell'idrogel, il diacrilato di polietilenglicole, il fotoiniziatore, il litio fenil-2, 4, 6-trimetilbenzoilfosfinato e la proteina ECM, la fibronectina, in condizioni sterili come descritto nel protocollo di testo allegato.

Filtro Sterilizzare ogni soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,22 micron prima di utilizzare o conservare le singole aliquote. Quindi, avvolgere la soluzione PEG-DA con un foglio per proteggerla dalla luce. Avvolgere la soluzione stock del fotoiniziatore in un foglio per proteggerla dalla luce e conservare la soluzione preparata a quattro gradi Celsius per un massimo di diversi mesi.

Se la soluzione madre di fibronectina è congelata, lasciare scongelare l'aliquota sterile con ghiaccio per diverse ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Inizia con l'autoclavaggio di un foglio di poliestere per ogni stampo in gel. Quindi, immergere due vetrini in tre distanziatori di plastica per ogni stampo in gel in etanolo al 70% per almeno due ore.

Inoltre, immergere cinque clip per legante per ogni stampo in gel in etanolo al 70% per 10 minuti. Posizionare i vetrini, i distanziatori e le clip del legante su un piccolo foglio per autoclave nella cappa di coltura cellulare per consentirne l'asciugatura all'aria per diverse ore. Quindi, prepara gli stampi in idrogel posizionando i distanziatori di plastica spessi 0,5 millimetri attorno al bordo di un vetrino.

Posizionare il secondo vetrino sulla parte superiore, quindi fissare saldamente i distanziatori uno accanto all'altro con le clip per raccoglitori. Infine, sterilizzare in superficie lo stampo posizionandolo nella cappa e accendendo la luce UV per 30 minuti prima dell'uso. A metà del processo di sterilizzazione, capovolgere lo stampo per esporre entrambe le superfici.

Creare le soluzioni precursori del gel come descritto nella prima tabella del protocollo di testo allegato. Quindi, mescola insieme i volumi di PEG-DA, fibronectina e fotoiniziatore per creare l'idrogel. Pipettare energicamente la soluzione per garantire una soluzione omogenea, ma evitare di creare bolle.

Pipettare accuratamente la soluzione precursore del gel tra i due vetrini dello stampo in gel. Quindi, posizionare lo stampo sotto una luce Uv ed esporlo per uno o due minuti per formare l'idrogel. Una volta gelificato, rimuovere le clip del raccoglitore e rimuovere delicatamente il vetrino superiore applicando una pressione opposta ai due distanziatori laterali.

Quindi, utilizzando un punzone per biopsia di dimensioni adeguate per ritagliare i campioni di idrogel. Estrarre più idrogel dal rettangolo di gel per fungere da repliche e campioni di controllo. Sterilizzare la fotomaschera immergendola in etanolo al 70% per 10 minuti.

Quindi, lasciare asciugare la maschera fotografica all'aria in una cappa per coltura cellulare. Quindi, pipettare da uno a due microlitri per centimetro quadrato di una soluzione proteica tiolata sulla superficie di ciascun idrogel ritagliato per la modellazione della superficie. È importante distribuire uniformemente la soluzione proteica sulla superficie dell'idrogel per garantire un'immobilizzazione uniforme delle proteine.

Posizionare con cura la maschera fotografica sulla superficie dell'idrogel. Premere delicatamente sulla maschera per rimuovere eventuali bolle che si formano tra la maschera e la superficie dell'idrogel. Quindi, posiziona l'idrogel sotto la luce UV ed esponilo a un secondo ciclo di luce UV per 30-60 secondi.

Lavare gli idrogel con PBS per rimuovere eventuali specie non reagite e posizionare ciascun idrogel all'interno della piastra a pozzetti in modo che la superficie del modello sia rivolta verso l'alto. Quindi, lavare i gel durante la notte in PBS a quattro gradi Celsius. Rimuovere il PBS dai pozzetti, quindi aggiungere 250 microlitri di EGM2 basale in ciascun pozzetto e incubare i gel per 5-10 minuti a 37 gradi Celsius.

Durante l'incubazione, la tripsina digerisce una piastra di HUVEC quasi confluenti in una sospensione a singola cellula utilizzando tecniche standard. Quindi, far girare la sospensione cellulare e rimuovere con cura il surnatante. Risospendere il pellet cellulare e l'EGM2 basale senza l'aggiunta di fattori di crescita e aggiungere parte della sospensione cellulare a un emocitometro.

Conta le cellule per determinare la concentrazione. Quindi, centrifugare la piastra contenente gli idrogel a 300 x G per tre minuti, per assicurarsi che gli idrogel si trovino sul fondo del pozzetto e non galleggino. È fondamentale che gli idrogel non galleggino all'interno dei pozzi.

Gli idrogel galleggianti limiteranno il successo nella semina cellulare e causeranno problemi con l'imaging degli idrogel. Pipettare lentamente 75.000 cellule per centimetro quadrate al centro di ciascuna superficie di idrogel in modo da non disturbare i gel. Quindi, posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius.

Per diversi giorni, rimuovere periodicamente la capsula per osservare la migrazione cellulare in risposta al pattern proteico. Scambia il 50% dei media ogni due o tre giorni. Durante la formazione degli idrogel, è possibile utilizzare varie concentrazioni di precursori PEG-diacrilato per ottenere la rigidità del substrato desiderata.

Mostrata qui, la soluzione di PEG-DA al 20% è correlata alla rigidità di oltre 100 kilopascal. È anche importante considerare sia la concentrazione del fotoiniziatore che il tempo di esposizione ai raggi UV, poiché un aumento di entrambe le variabili diminuirà la bioattività delle molecole attaccate, qui rappresentata dalla bioattività del lisosoma. Ridurre al minimo l'esposizione ai raggi UV durante la formazione di idrogel è fondamentale per mantenere i gruppi funzionali dell'acrilato libero per le successive reazioni di immobilizzazione delle proteine.

Gli idrogel esposti alla luce UV per più di due minuti non sono in grado di creare modelli proteici immobilizzati mostrati in rosso. Inoltre, all'aumentare dell'esposizione ai raggi UV del modello proteico, più proteine reagiscono alla superficie. Se preparate correttamente, le cellule possono essere coltivate su questi substrati di idrogel modellati per manipolarne il comportamento.

Qui, le cellule endoteliali sono state seminate uniformemente sulla superficie di idrogel PEG con modello VEGF. Due giorni dopo la semina, è stato osservato che le cellule endoteliali migravano verso le regioni spaziali dell'idrogel che contenevano il VEGF immobilizzato. Dopo lo sviluppo di questo protocollo, i ricercatori possono utilizzarlo per immobilizzare qualsiasi proteina o peptide al fine di esplorare nuove piattaforme bioattive per sistemi cellulari in vitro.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo la concentrazione del fotoiniziatore e il tempo di esposizione ai raggi UV per mantenere la bioattività delle molecole immobilizzate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modellare le proteine e i peptidi bioattivi su idrogel PEG, seminare le cellule in modo uniforme su idrogel e osservare la conseguente risposta cellulare.