Name: Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri un modello murino di cancro mammario metastatico con sistema immunitario intatto usando adenovirus-Cre e tracciamento YFP. Questo metodo consente di studiare l'interazione tumore-immunità e sviluppare nuove immunoterapie.

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Questo lavoro è stato supportato dal NCI Grants RO1CA157664 e RO1CA124515, e un premio Breast Cancer Alliance. Vorremmo ringraziare Jeffrey Faust, David Ambrose, e Scott Weiss dalla struttura Wistar Citometria a Flusso nucleo, James Hayden dalla struttura Wistar Imaging, e tutto il personale della Animal Fondo Wistar Institute per il loro prezioso supporto tecnico.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso commissione Wistar Institute. 1. Generazione e manutenzione di topi transgenici <ol><li> Razza LSL-K-ras tm4Tyj 26 e Trp53 tm1Brn 27 (ottenuto da modelli murini di NCI consorzio cancro umano su uno sfondo misto) per un completo C57BL / 6 sfondo 28 backcrossing da almeno 10 generazioni con C57BL / 6 topi. Per tenere traccia di metastasi del tumore, razza B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, ottenuto da The Jackson Laboratory a tempo pieno C57BL / 6 di fondo) con doppio transgenici LSL-K-ras G12D / + topi p53 loxP / loxP. Nota: topi transgenici LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP hanno siti loxP fiancheggiano un allele transcriptionally tacere di oncogeni K-ras e p53 locus endogeno, in modo che al momento escissione Cre-mediata, la sovraespressione di un oncogene K-ras mutante e ablazione di p53 è achieved. Nota: Il mouse LSL-EYFP contiene un codone di stop fiancheggianti un gene per la proteina migliorata giallo fluorescente (YFP) che sui risultati di escissione Cre-mediate nell&#39;espressione di YFP nei tessuti in cui la cassetta di arresto YFP viene asportato. <ol><li> Razza topi transgenici per ottenere LSL-K-ras G12D / + p53 topi loxP / loxP o LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP topi LSL-EYFP per preparazioni iniettabili intraduttali. Nota: I topi sono allevati come omozigote per p53 loxP / loxP e eterozigoti per LSL-K-ras G12D / + perché i topi con delezione omozigote di K-ras muoiono in utero. Utilizzare femmine vergini ingenue almeno sei settimane per preparazioni iniettabili intraduttali. Nota: I primer per la genotipizzazione omozigote floxed p53 allele sono p53 - T010-FWD (5&#39;-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 &#39;) e p53-T011-rev (5&#39;-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3&#39;). Essi producono un tipo di allele selvaggio a 391 bp e il p53 floxed allele a 461 bp 29,30. Nota: I primer per rilevare la forma mutante di K-ras sono oIMR8273 (5&#39;-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 &#39;) e oIMR8274 (5&#39;-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3&#39;). Essi producono la band mutante rilevato a 600bp. Nota: Per i YFP giornalista triple topi transgenici, gli inneschi per rilevare la cassetta ROSA (5&#39;-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 &#39;), il tipo selvatico allele (5&#39;-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3&#39;), e un allele comune (5&#39;-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 &#39;) comporterà l&#39;amplificazione delle bande a 320 bp per l&#39;allele floxed e 600 bp per l&#39;allele selvatico. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione chirurgica <ol><li> Materiali chirurgici puliti con il 75% EtOH e autoclave prima e dopo tutte le iniezioni. </li><li> Eseguire un intervento chirurgico su un banco da laboratorio pulito ordinato in una stanza sterilizzata all&#39;interno di una struttura animale. Pulire tutte le superfici, tra cui lo stadio e quadranti del microscopio operatorio con una soluzione disinfettante ad ampio spettro seguita dal 75% EtOH. </li><li> Pesare e anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (80-100 mg / kg) e xilazina (8-10 mg / kg) in soluzione fisiologica sterile. </li><li> Posizionare delicatamente topi nelle loro gabbie indisturbato per 5 minuti, mentre vanno sotto anestesia. Durante questo tempo generare precipitati virus (vedi protocollo 3). </li><li> Verificare la mancanza di risposta al dolore da pizzicare punta. Coprire delicatamente gli occhi dei topi anestetizzati con pomata veterinaria per evitare un eccessivo essiccamento della cornea. </li><li> Per prevenire l&#39;ipotermia, posizionare i topi anestetizzati su una piastra elettrica impostata su fuoco basso durante la procedura chirurgica e fino a che non iniziano a recuperare. </li><li> Per la gestione del dolore, amministrano i topi Meloxicam per via sottocutanea a 1 mg / kg prima della chirurgia e 24 ore dopo. </li></ol> 3. Generazione di precipitati virus ATTENZIONE: vettori Adenovirus, anche se sono stati modificati e sono in grado di replicare, comportano il rischio diinfezione. Maneggiare con cautela adenovirus. Tutto il personale deve essere adeguatamente addestrati secondo le linee guida dell&#39;ente per la manipolazione di agenti BSL2 Dopo l&#39;iniezione intraduttale, disporre di adenovirus in conformità alle linee guida BSL2. <ol><li> Il negozio adenovirus concentrate le riserve di virus a -80 ° C in aliquote congelate di 4 x 10 8 pfu ciascuna, sufficiente per iniettare 16 animali con 3 ml di 2,5 x 10 7 pfu di particelle di adenovirus. </li><li> Conservare aliquote adenovirus su ghiaccio secco fino a circa 15-20 minuti prima di iniziare le iniezioni. Nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento, come titolo del virus diminuisce notevolmente tra un ciclo. Nota: precipitati Adenovirus sono formate modificando un protocollo descritto in precedenza 31. </li><li> Ricostituire 504 mg di MEM polvere con 50 ml di acqua grado molecolare sterile, supplemento con 244 mg di bicarbonato di sodio e il filtro in condizioni sterili e conservare a 4 ° C. <ol> &lt;li&gt; Preparare la soluzione di cloruro di calcio con l&#39;aggiunta di 1,5 g di cloruro di calcio a 50 ml di acqua ultrapura e filtro in condizioni sterili e conservare a 4 ° C. </li><li> Mescolare aliquote contenenti 4 x 10 8 pfu adenovirus-Cre con sufficiente 3% saccarosio in acqua sterile per un volume finale di 10 ml. Aggiungere 34 ml di MEM al virus e mescolare delicatamente. Poi aggiungere 4 ml di soluzione di CaCl 2, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 15-20 min. </li><li> Conservare adenovirus in ghiaccio secco fino al momento di formare precipitati. Evitare scongelamento del adenovirus e memorizzazione su ghiaccio oa temperatura ambiente per tempi prolungati, salvo si formano precipitati. Nota: È inoltre possibile mescolare il saccarosio, MEM e CaCl 2 prima degli interventi chirurgici se non è possibile scongelare l&#39;aliquota adenovirus e cominciare a fare precipita immediatamente dopo la rimozione da -80 ° C. Tale aliquota di saccarosio, MEM, e calcio può essere salvata in ghiaccio secco fino al momento di aggiungere l&#39;adenovirus. Nota: Le particelle virali sono stabili per circa 1 ora. </li><li> Prima di ogni iniezione, sfiora delicatamente il tubo per assicurarsi che le particelle virali sono mescolati. Elaborare 3 ml (2.5 x 10 7 PFU) di particelle virali nella siringa 10 ml e preparare il mouse per l&#39;iniezione intraduttale. </li></ol></li></ol> 4. Iniezione intraduttale di particelle virali <ol><li> Inserire delicatamente il mouse sulla sua schiena sul palco illuminato di un microscopio dissezione pulito. Illuminare la parte addominale con una fonte di luce e di individuare la partita 4 ° o 9 ° a destra della ghiandola mammaria inguinale dalle piccole macchie bianche di pelo (visibili sul C57BL / 6 femmine) che circondano ogni capezzolo. </li><li> Strofinare il capezzolo delicatamente con una sterile etanolo cotone imbevuto con punta applicatore per eliminare i capelli lontano dal capezzolo e di sterilizzare il sito di iniezione. Se sono difficili da individuare, applicare delicatamente uno spesso strato di cesoie una crema depilatoria o utilizzare per esporre i capezzoli. </li&gt; <li> Rimuovere il tappo di cheratina, uno strato di cellule morte densi, che copre il capezzolo. Una volta che il capezzolo è esposta, la spina cheratina deve essere facilmente visibili al microscopio di dissezione. </li><li> Fissare il capezzolo con ammenda pinze chirurgiche e tirare con forza la luce per staccare la spina cheratina. </li><li> Stabilizzare il capezzolo tra le pinze. </li><li> Inserire delicatamente l&#39;ago tra le pinze, cannulating il canale condotto a 90 °. Inserire il capezzolo leggermente oltre la smussatura dell&#39;ago (non più di 2 mm) per impedire la penetrazione attraverso il tessuto mammario e nelle membrane sierose della cavità corporea ventrale. <ol><li> Non inserire l&#39;ago troppo profonda. Per assicurare una corretta profondità di iniezione, estrarre delicatamente l&#39;ago dopo averlo inserito nel lume del condotto, disegnando il capezzolo lungo i bordi del dell&#39;ago come viene estratto. Nota: Visualizzazione del iniezione è difficile, quindi practice per questa fase è consigliabile usare trypan blu. </li></ol></li><li> Quando l&#39;ago è opportunamente posizionato nel condotto mammaria, rilasciare i 3 ml di precipitati virus (2,5 x 10 7 pfu di adenovirus-Cre) immergendo delicatamente la siringa con il pollice della mano che impugna la siringa. Il capezzolo deve gonfiare un po &#39;come si aggiunge il liquido. </li></ol> 5. Recupero dei topi <ol><li> Posizionare il mouse indietro sul pad di riscaldamento dopo l&#39;iniezione fino a quando non comincia a recuperare dall&#39;anestesia. </li><li> Una volta che il mouse viene recuperato, riposizionarlo in una gabbia pulita e monitor per il pieno recupero e movimento. </li><li> 24 ore dopo l&#39;iniezione intraduttale, per via sottocutanea amministrare meloxicam a 1 mg / kg. </li></ol> 6. Tumore Monitoring Progressione <ol><li> Palpare la ghiandola mammaria iniettato a 30 giorni per l&#39;allargamento e gonfiore. <ol><li> Monitorare la progressione del tumore ogni 5-7 giorni una volta al Glan mammaria gonfia e allargatad si osserva. </li></ol></li><li> Misurare volumi del tumore ogni 3-4 giorni per la cinetica di crescita del tumore una volta tumori palpabili appaiono (iniezione di circa 50-60 giorni dopo adenoviral). </li><li> Euthanize topi quando volumi del tumore superano il 10% del peso corporeo dei topi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Il successo di questa procedura dipende da tecnica corretta durante le iniezioni intraduttale, che sarà difficile per sperimentatori non addestrato. Ricercatori esperti nel nostro laboratorio in genere ottengono seno masse tumorali 79% delle volte amministrano le iniezioni adenovirali. I problemi con l&#39;iniezione può causare significativo ritardo, variabile, o lo sviluppo del tumore assente. Se l&#39;ago viene inserito troppo in profondità o in un angolo inadeguato, il canale duttale può perdere. È importante immettere il capezzolo leggermente oltre la smussatura dell&#39;ago (non più di 2 mm), per impedire la penetrazione attraverso il tessuto mammario e nelle membrane sierose della cavità corporea ventrale. Inoltre, troppo superficiale posizionamento dell&#39;ago o l&#39;iniezione di maggiore di 3 ml di precipitati virus può causare fuoriuscite di preparazione virale di fuori della ghiandola mammaria e l&#39;induzione di tumori non intenzionali. Un modo per superare questi problemi è quello di inserire l&#39;ago nel capezzolo leggermente deeper a 3 mm, e lentamente disegnare la siringa backup dal condotto fino a 2 mm dalla punta del bisello. Questo farà sì che il tessuto mammario si rivolge invece del muscolo che circonda la cavità peritoneale di topi (Figura 1A). Ciò inoltre allungare il capezzolo lungo i bordi della siringa in modo che quando il virus viene espulso nel condotto, non c&#39;è fuoriuscita e perdita di precipitati virali. Visualizzazione dell&#39;iniezione è difficile e pratica per questo passaggio è consigliato. Abbiamo osservato un aumento iniezioni successo seguente pratica, con un conseguente penetranza superiore dello sviluppo del tumore. Poiché questa tecnica utilizza seno che non femmine vergini, è fondamentale per staccare la spina cheratina che copre il capezzolo per rivelare il canale condotta sottostante. Si consiglia di praticare questo passo iniettando trypan blu o qualche altro colorante tracciabile sterile all&#39;interno del condotto e preparare interi monti mammarie per confermare il targeting del tr duttaleee. Inoltre, altri protocolli che descrivono intraduttale iniezione di reagenti sono stati pubblicati 33,34, che può essere utile per sviluppare la tecnica corretta. Problemi con la preparazione virale o infezione del lume duttale possono essere indagati utilizzando un adenovirus che esprime mCherry. Topi nontransgenic possono essere usati per ciascuna delle finalità finché la tecnica di iniezione è ottimizzata. Sebbene qualsiasi ghiandola mammaria può essere utilizzato per avviare tumori, abbiamo raggiunto i tassi di crescita più consistenti mirando ghiandola mammaria 4 o 9, che riteniamo sia perché è più facile effettuare iniezioni corrette su queste ghiandole, con conseguente più efficiente mirati gli dotto. La vicinanza della sinistra 4 ° o destro 9 th inguinali ghiandole mammarie al linfonodo inguinale drenante è anche utile esaminare antitumorali risposte immunitarie durante diversi punti temporali di progressione tumorale. Per modellare e monitorare metastasi latente siti distali, ttopi ransgenic sono stati incrociati con i topi LSL-EYFP. Come il tumore progredisce, vascolarizzazione collega il tumore al linfonodo ascellare viene leggermente gonfio a circa 5 settimane prima che il tumore comincia a crescere in modo esponenziale (Figura 3A). Alla fine, dopo 7-8 settimane, invasione linfovascolare provocherà crescita tumorale all&#39;interno linfonodi ascellari (Figure 3A e 3B). Utilizzando topi transgenici e la tecnologia Cre-loxP, incorporazione di YFP crea una piattaforma per monitorare le cellule tumorali metastatizzanti ai siti distali tutta la progressione del tumore. Questo può facilitare gli studi volti a chiarire i meccanismi cellulari e epigenetici che promuovono la metastasi latente. Nelle nostre mani, linee cellulari tumorali della mammella espressi citocheratina-8, mesothelin, recettore estrogeno-α, e Her2/neu, confermando il targeting dell&#39;epitelio duttale. Tuttavia, a seconda delle mutazioni indotte e per la difficoltà e la variabilità delle iniezioni, si consigliacaratterizzazione istologica dei tumori una volta che il modello è ben consolidata in laboratorio. Poiché il cancro al seno è una malattia mortale e penetrante 1,2, è importante utilizzare modelli animali che ricapitolano precisione la complessa interazione tra tumore ed ospite. Qui si descrive completamente reincrociata C57BL / 6 modello murino di tumore al seno. In primo luogo, inducendo tumori da cellule native, lasciamo che il tumore di evolversi naturalmente in un microambiente immune completo. Il microambiente immune nei tumori avanzati seno di topo ricapitola le popolazioni di αβ e γδ cellule T, cellule mieloidi soppressori derivate e macrofagi comunemente osservati nel carcinoma mammario umano (Figura 4). Come abbiamo pubblicato in precedenza utilizzando adenovirus-Cre di indurre tumori ovarici, abbiamo scoperto che l&#39;iniezione virale ha avuto un effetto trascurabile sui corrispondenti infiltrati del tumore e la progressione del tumore 28. In secondo luogo, endocrino indipendenteespressione di oncogeni assicura che le cellule tumorali hanno persistentemente alti livelli di espressione del gene bersaglio. Terzo, sfruttando mutazioni latenti, possiamo controllare la temporizzazione della tumorigenesi facilitare preciso tracciamento temporale dell&#39;evoluzione tumorale. Le applicazioni di questo modello comprendono la ricerca sulla biologia delle cellule tumorali, studi sui fattori del microambiente tumorale, anti-tumorali risposte immunitarie, e anche la valutazione di efficacia di nuove terapie. Attraverso la disponibilità del sistema Cre-loxP, questa tecnica può essere utilizzata come una piattaforma per indagare una gamma diversificata di ulteriori mutazioni nell&#39;iniziazione e progressione dei tumori al seno. Speriamo che l&#39;uso di questo modello migliorerà la comprensione della biologia del cancro al seno e condurre a nuove terapie volte a trattamento del cancro al seno metastatico.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.
Protocol section 3.1 was updated from:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
to:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 &#181;l of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
Protocol section 3.3.2 was updated from:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
to:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 &#181;l. Add 34 &#181;l of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 &#181;l of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
Protocol section 3.4 was updated from:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
to:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 &#181;l (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 &#181;l syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
Protocol section 4.7 was updated from:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
to:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 &#181;l of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:
10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
to:
10&#181;l syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Il carcinoma della mammella è il tumore maligno più comunemente si verificano in donne in tutto il mondo, 1,2 e la seconda causa di decessi per cancro 2. Complesso genetica 3,4, istologiche 5, e fenotipi clinici 6 sono utilizzati per caratterizzare i vari sottotipi di cancro al seno e spesso sono utilizzati come mezzo per predire la sopravvivenza. Analisi di un&#39;ampia coorte di donne con tumore al seno ha indicato che la maggior parte (circa l&#39;80%) dei pazienti che sono morti avevano recidivato entro 10 anni rimozione postale del tumore primario 7. Per la maggior parte dei carcinomi mammari invasivi, invasione linfovascolare ha dimostrato di essere fortemente correlata ad una prognosi sfavorevole e decorso clinico più aggressivo della malattia 8. A causa della complessità genetica e fenotipica di cancro al seno, non esiste un modello animale che riassume l&#39;intero corso della malattia. Linee di cellule tumorali mammarie umane sono state spessoutilizzato come xenotrapianto o ortotopici 9 modelli di carcinoma mammario invasivo e metastatico in topi immunodeficienti. Sebbene informativo, questi modelli si verificano in assenza di pressione immunitario e perché è una specie innesto croce, distorcere gli effetti dell&#39;intero microambiente tumorale. Mutazioni genetiche inducibili guidati da specifici promotori mammarie come il virus murino di tumore mammario (MMTV) e siero proteina acida (WAP) hanno contribuito con un enorme quantità di conoscenze circa la natura genetica di cancro al seno. Tuttavia, l&#39;espressione tessuto specifica di questi promotori è compromessa dalla loro reattività al sistema endocrino 10-16, causando la variabile espressione di mutazioni genetiche indotte che non rispecchiano l&#39;espressione di oncogeni tipicamente overexpressed nel cancro al seno umano. Per superare il controllo endocrino di espressione MMTV guidato di oncogeni, Moody et al. Ha generato una, doxiciclina modello inducibile condizionale sovraespressione Neu nel senoepitelio 17. Questo modello è utile per deinducing Neu dopo la formazione del tumore a studiare la regressione e la ricorrenza, ma richiede la somministrazione di doxiciclina costante per coerenza, l&#39;espressione dell&#39;oncogene-lungo termine. Una discussione completa dei tanti modelli di tumore al seno pertinenti disponibili può essere trovata nella recensione di Vargo-Gogola et al. 10 Il nostro obiettivo era di sviluppare un modello murino di cancro al seno tracciabile su un pieno C57BL / 6 di fondo che, dopo l&#39;induzione permanente degli eventi mutazionali modelli, la formazione di un tumore nascente in presenza di pressione immunitario. Abbiamo introdotto un adenovirus che esprimono Cre-ricombinasi nei dotti mammari di topi transgenici contenenti alleli floxed di TP53 e una forma oncogenica di K-ras e YFP. Espressione Cre ablates Tp53, un gene frequentemente mutato in molti cancri al seno 18 e induce un allele oncogenica di K-ras oltre alla espressione YFP specificamentenell&#39;epitelio duttale mammario. Sebbene mutazioni in K-ras sono frequenti nel cancro al seno, che si verificano solo nel 6,5% dei pazienti con carcinoma mammario 19,20, la sovraespressione della chinasi a monte come Her2/neu e EGFR risultato in attivazione costitutiva della via di segnalazione Ras nei tumori della mammella umani 21-23. L&#39;attivazione della via di segnalazione di Ras in molte linee cellulari tumorali della mammella è stata riportata anche 24,25. Descriveremo l&#39;avvio della formazione del tumore e la tecnica di iniezione intraduttale di un adenovirus che esprimono Cre-ricombinasi in sessualmente maturi, vergini topi femmina. Questo modello di cancro al seno si sviluppa lesioni evidenti che crescono in modo esponenziale dopo circa 8 settimane di progressione del tumore lento, con l&#39;invasione linfovascolare e metastasi a linfonodi ascellari da 7-8 settimane. Poiché questi topi sono su un pieno C57BL / 6 di fondo e le cellule tumorali che esprimono YFP sono rintracciabili in linfonodi distali, questo modello fornisce uno strumento rilevante per studiare la cemeccanismi llular e immunologici di metastasi latente e aiuteranno a sviluppare nuovi approcci terapeutici per il trattamento del carcinoma mammario duttale metastatico.

<table><tbody><tr><td>Trp53tm1Brn Topi transgenici K-rastm4Tyj Topi transgenici</td><td>Ottenuti da modelli murini NCI di consorzio</td><td></td> per il cancro umano <td>I topi sono stati reincrociati dieci volte fino a un fondo C57BL/6 completo</td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JTopi transgenici</td><td>Jackson Labs</td><td>006148</td><td></td></tr><tr><td>Primer p53loxP/loxP</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'Primers</td></tr> <tr><td>LSL-K-rasG12D/+</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'Primers</td></tr> <tr><td>for LSL-EYFP per rilevare il promotore di Rosa</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'Primer</td></tr> <tr><td>per il rilevamento dell'espressione della mesotelina</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'Primer per il</td></tr> <tr><td>rilevamento dell'espressione del recettore del progesterone</td><td>Integrato DNA Technologies</td><td></td><td>5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'Primer</td></tr> <tr><td>per la rilevazione dell'espressione della citocheratina 8</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'Primers</td></tr> <tr><td>per la rilevazione dell'espressione di Erbb2</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'Primer</td></tr> <tr><td>per il rilevamento dell'espressione del recettore degli estrogeni</td><td>A Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'Primers</td></tr> <tr><td>per il rilevamento dell'espressione del recettore degli estrogeni B</td><td>Tecnologie</td><td></td> <td>integrate del DNA5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'Primer</td></tr> <tr><td>per il rilevamento dell'espressione di B-actina</td><td>Tecnologie integrate del DNA 5</td><td></td><td>'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'Adenovirus-Cre</td></tr> <tr><td></td><td>Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa</td><td>Ad5CMVCre</td><td>Memorizza aliquote di virus (4 x 108 pfu/aliquota) a -80 &#176; C per evitare ripetuti cicli di gelo e disgelo.</td></tr><tr><td>Adenovirus-mCherry</td><td>Gene Transfer Vector Core dell'Università dell'Iowa</td><td>Ad5CMVmCherry</td><td>Memorizza aliquote di virus (4 x 108 pfu/aliquota) a -80 &#176; C per evitare ripetuti cicli di gelo e disgelo.</td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Hamilton company</td><td>701RN</td><td>10 &#956; l siringa, RN series. Autoclave prima e dopo ogni utilizzo. Pulire con PBS ed etanolo al 75%.</td></tr><tr><td>Ago personalizzato</td><td>Hamilton company</td><td>7803-05</td><td>33 G 0,5 in ago RN lungo, con smusso 12&#176;. Autoclave prima e dopo ogni utilizzo. Pulire con PBS ed etanolo al 75%.</td></tr><tr><td>Pinze chirurgiche</td><td>Dumont</td><td>52100-58</td><td>Dumostar n. 5 pinze. Pulire con etanolo al 75% dopo ogni utilizzo, seguito da sterilizzare in autoclave</td></tr><tr><td>la polvere MEM</td><td>Cellgro</td><td>50 012 PB</td><td>Conservare a 4 &#176; C in polvere e forma ricostituita</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Fisher</td><td>S233</td><td>Aggiungere a MEM e filtrare stearilizzare</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td>Minimo 96%, anidro</td></tr></tbody></table>

avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla targeting del duttale con adenovirus-cre: a novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Il cancro al seno è una malattia eterogenea che coinvolge interazioni cellulari complesse tra tumore e sviluppo sistema immunitario, eventualmente con conseguente crescita esponenziale tumorale e metastasi ai tessuti distali e il crollo di immunità anti-tumorale. Esistono molti modelli animali utili per studiare il cancro al seno, ma nessuno ricapitolano completamente la progressione della malattia che si verifica negli esseri umani. Al fine di ottenere una migliore comprensione delle interazioni cellulari che provocano la formazione di metastasi latente e riduzione della sopravvivenza, abbiamo generato un modello di topo transgenico inducibile di YFP esprimenti carcinoma duttale che si sviluppa dopo la maturità sessuale in topi immuno-competenti ed è guidato by coerente, espressione dell&#39;oncogene endocrino-indipendente. Attivazione di YFP, ablazione di p53, e l&#39;espressione di una forma oncogenica di K-ras è stato raggiunto con la consegna di un adenovirus che esprime Cre-ricombinasi nel condotto mammaria di sessualmente maturi, vergini topi femmina. Tumoricominciano ad apparire sei settimane dopo l&#39;inizio degli eventi oncogenici. Dopo tumori diventano evidenti, che progrediscono lentamente per circa due settimane prima di iniziare a crescere in modo esponenziale. Dopo 7-8 settimane post-iniezione di adenovirus, vascolare si osserva che collega la massa tumorale ai linfonodi distali, con eventuale invasione linfovascolare delle cellule tumorali YFP + ai linfonodi ascellari distali. Infiltranti popolazioni leucocitarie sono simili a quelli trovati nei carcinomi mammari umani, tra cui la presenza di cellule αβ e γδ T, macrofagi e MDSCs. Questo modello unico faciliterà lo studio dei meccanismi cellulari e immunologici coinvolti nella metastasi latente e dormienza oltre ad essere utile per la progettazione di nuovi interventi di immunoterapia per il trattamento di cancro mammario invasivo.

Successo il targeting dell&#39;albero duttale mammaria può essere visualizzato da preparare supporti interi della ghiandola mammaria come precedentemente descritto 32 dopo l&#39;iniezione di blu tripano (per verificare la corretta tecnica di iniezione (Figura 1A) o un adenovirus esprimere mCherry (per verificare la corretta preparazione virale e l&#39;infezione di cellule epiteliali duttali, Figura 1B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1.jpg" /> Figura 1. Intraduttale il targeting delle ghiandole mammarie per iniezione con trypan blu o adenovirus-mCherry. A) Un intero monte, come riportato in precedenza 32, della ghiandola mammaria dopo l&#39;iniezione di ghiandola mammaria # 4 con trypan blu è stato preparato 3 ore dopo l&#39;iniezione di visualizzare / conferma di mira l&#39;intero duttalealbero. Le immagini sono di zoom digitale 4X. B) L&#39;infezione dell&#39;epitelio duttale con adenovirus iniettando 2,5 x 10 7 pfu di adenovirus esprimere mCherry. I topi sono stati iniettati intraductally, e 4 giorni dopo l&#39;iniezione, un intero monte della ghiandola mammaria è stato preparato per confermare l&#39;infezione virale dell&#39;albero duttale. L&#39;immagine è 4X ingrandimento. MG è ghiandola mammaria, LD è il galattofori o condotto principale, e TD è il condotto terminale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Quando i tumori sono indotti a p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + topi transgenici, i tumori non saranno evidenti fino a circa 40 giorni quando le ghiandole mammarie diventeranno allargata e gonfie. È necessario iniziare palpations quando questo si osserva, il monitoraggio della crescita tumorale ogni 5-7 giorni. Nelle nostre mani, indurimento della ghiandola mammaria precede sempre l&#39;inizio dello sviluppo del tumore. Tumori progredirà lentamente per altre 2 settimane. Inizio intorno al giorno 56, i tumori cominceranno a crescere in modo esponenziale (Figura 2B). A questo punto, è fondamentale per misurare volumi del tumore ogni 3 giorni se studi cinetici sono desiderati perché ci sarà leggera mouse variabilità mouse nella progressione tumorale, che è normale (Figure 2A e 3A). Grandi masse addominali saranno evidenti per giorno 80 (Figura 2A, 2B e 3A), dopo di che i topi dovrebbero essere sacrificati se tumori superare il 10% del loro peso corporeo. analisi cDNA di tre cloni da un topo portatore di tumore rivelato espressione di mesotelina, citocheratina-8, Her2/neu e recettore estrogeno-α (Figura 2C). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2.jpg" /> &gt; Figura 2. Sviluppo del tumore p53 in loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + topi iniettati intraductally con adenovirus-Cre. A) Due esempi di tumori 80 giorni dopo l&#39;iniezione con adenovirus che esprimono Cre. I topi sono stati dati 2,5 x 10 7 PFU di adenovirus esprimere Cre e 80 giorni dopo tumore-iniziazione, grandi masse palpabili possono essere visualizzati sporgente dal lato addominale dell&#39;animale. B) cinetica tumorali Tipica e periodicità palpazione per tumori indotti in p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D + / topi. C) Caratterizzazione di tre cloni cellulari tumorali derivate dallo stesso tumore omogeneizzato di un loxP p53 / loxP LSL-K-ras G12D / + mouse. RNA è stato estratto e cDNA sintetizzati per l&#39;analisi RT-PCR utilizzando primer specifici per β-actina, mesotelina, citocheratina-8, Her2/neu, recettore del progesterone, estrogeno-recettore α e β-recettore estrogeno.tps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. Simile al microambiente cellulare nel cancro al seno umano, abbiamo osservato infiltrazione di cellule T αβ e γδ nonché mieloidi derivate cellule soppressori e macrofagi nel tumore (Figura 4). Vascolare gocciolatoio a linfonodi ascellari inizierà a engorge prima tumori sono cresciuti fino a comprendere l&#39;intero tessuto mammario in cui è stata eseguita l&#39;iniezione (Figura 3A). Linfovascolare invasione e metastasi delle cellule tumorali possono essere rintracciati incrociando topi LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP con i topi LSL-EYFP. Dopo l&#39;escissione Cre-mediata, le cellule tumorali che esprimono YFP (alta e bassa), vengono rilevati nel tumore e possono essere ricondotte metastasi al drenaggio linfonodi ascellari (Figura 3B). Metastasi linfonodi ascellari distale è stata confermatada successo coltura di una linea di cellule tumorali da questo sito in un tumore-cuscinetto LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP mouse (dati non mostrati). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3.jpg" /> Figura 3. Formazione di tumori e metastasi latente al linfonodo ascellare. A) Esempio di tre tumori avanzati della mammella con differenti velocità di progressione tumorale. Una massa solida, indicata dalla freccia, forme e cresce alla fine alla dimensione dell&#39;intero tessuto mammario addominale. Il tumore resta confinato al tessuto mammario e non si osserva per invadere e attaccare al muscolo che copre la cavità peritoneale. C&#39;è ingorgo evidente della vena epigastrica superficiale tra i linfonodi inguinali e ascellari, indicati con frecce bianche. Dopo 7-8 settimane, the linfonodo ascellare comincia a diventare allargata causa linfovascolare invasione delle cellule tumorali, indicato dalla freccia. B) metastasi delle cellule tumorali positive YFP può essere visualizzato nella linfonodi ascellari mediante citometria a flusso. Topi LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP sono stati usati per indurre tumori e l&#39;attivazione di YFP mediante consegna intraduttale di adenovirus-Cre. Per verificare l&#39;invasione linfovascolare delle cellule tumorali nel linfonodo ascellare, 80 giorni dopo l&#39;iniezione adenoviral, i linfonodi e degli organi indicati sono stati raccolti e colorate per i marcatori di linfociti ed esaminati per l&#39;espressione YFP. CL rappresenta non tumorali controlaterale drenante linfonodo. I risultati rappresentano gating sulle cellule tumorali negativi CD45, indicando le cellule tumorali stanno invadendo il linfonodi ascellari distale. Numeri rappresentano per cento YFP cellule positive dalla popolazione totale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere larg</a>Immagine er. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4.jpg" /> Figura 4. Immune infiltra nei tumori della mammella di topi transgenici. Tumori al seno mouse sono stati omogeneizzati e colorate per CD45, CD3, γδTCR, CD11b e GR1. Numeri rappresentano per cento dei leucociti positivi intero tumore (63,5), totale CD3 + (46,7), totale CD3 negative (40.1), totale CD3 + γδ + (γδ cellule T, 13), CD3 + γδnegative (24), GR1 totale alta CD11b (MDSC, 28.6) e totali CD11b GR1 basse (macrofagi, 18.5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> A causa della anatomia del mouse e tecnica di iniezioni intraduttale, troviamo il targeting of ghiandole mammarie 4 e 9 (Figura 5) produce i risultati più coerenti e iniezioni affidabili. Tuttavia, ogni ghiandola può essere mirata a seconda della preferenza del tecnico esegue l&#39;intervento chirurgico. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5.jpg" /> Figura 5. Numerazione dei dotti mammari. Dotti mammari 4 e 9 sono evidenziati in rosso sul diagramma e indicato con le frecce sul mouse. Nelle nostre mani, abbiamo scoperto che le iniezioni sono più facili da eseguire su questi dotti mammari, però tutti gli altri tessuti mammari che abbiamo mirato i tumori sviluppate con cinetiche simili. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

Attivazione di mutazioni latenti con adenovirus-Cre nei risultati mammarie sistema duttale in un carcinoma mammario metastatico clinicamente rilevante. Incorporazione di un promotore YFP consente di tenere traccia di cellule tumorali metastatiche distali. Questo modello è utile per studiare metastasi latente, immunità anti-tumorale, e per la progettazione di nuove immunoterapie per trattare il cancro al seno.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sviluppare un modello murino di cancro al seno che alla fine metastatizza in presenza di un sistema immunitario sano. Ciò si ottiene in primo luogo somministrando un adenovirus che esprime Cree nel canale duttale mammario degli animali da esperimento. La ghiandola mammaria viene quindi palpata regolarmente per monitorare la progressione del tumore.In definitiva, le metastasi tumorali e l'infiltrazione leucocitaria nel linfonodo ascellare possono essere valutate mediante analisi citofluorimetrica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai modelli esistenti di tumore al seno è che consente l'inizio preciso di tumori che possono svilupparsi in presenza di un sistema immunitario maturo e che possono essere tracciati dall'espressione di YFP. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi introduttive dell'iniezione sono difficili da imparare.Il corretto posizionamento dell'ago richiede precisione e pratica. Il giorno dell'esperimento, conservare Eloqua di quattro volte 10 delle ottave unità formanti la placca di adenovirus Cree su ghiaccio secco, scongelare il virus a temperatura ambiente impostata e mescolarlo con una quantità sufficiente del 3% di saccarosio in acqua sterile per portare il volume finale fino a 10 microlitri. Successivamente, mescolare delicatamente 34 microlitri di mem e quattro microlitri di cloruro di calcio appena preparato nel virus e incubare la soluzione a temperatura ambiente.Dopo 15-20 minuti, il terreno apparirà torbido indicando la formazione dei precipitati dell'adenovirus. Muovi delicatamente il tubo per assicurarti che le particelle virali siano distribuite uniformemente in tutta la sospensione, quindi per iniettare le particelle virali aspira tre microlitri di virus in una siringa da 10 microlitri. Quindi posizionare un topo anestetizzato sulla schiena sul tavolino illuminato di un microscopio da dissezione pulito.Illumina l'addome con una fonte di luce extra e individua la quarta ghiandola mammaria inguinale sinistra o la nona destra in base alle piccole macchie bianche di pelo che circondano ciascun capezzolo. Ora strofina delicatamente il capezzolo con un applicatore sterile imbevuto di etanolo con punta in cotone. Quindi fissare il capezzolo con una pinza chirurgica fine e tirare su con una forza leggera.Per rimuovere il tappo di cheratina, stabilizzare il capezzolo tra le pinze e inserire delicatamente l'ago tra le punte. Incannulando il canale del dotto con un angolo di 90 gradi per garantire la corretta profondità di iniezione, tirare delicatamente l'ago verso l'alto dopo averlo inserito nel lume del condotto, tirando il capezzolo verso l'alto lungo i bordi dell'ago mentre viene tirato verso l'alto. Quando l'ago è posizionato correttamente, immergere delicatamente l'intero contenuto della siringa.Il capezzolo dovrebbe gonfiarsi leggermente man mano che viene aggiunto il liquido. Dopo l'iniezione, riposizionare il mouse sul termoforo fino a quando non inizia a riprendersi dall'anestesia. Quindi rimetti l'animale in una gabbia pulita e monitoralo fino a quando non si osserva il pieno recupero.Palpare la ghiandola della memoria iniettata al giorno 30 per valutare l'ingrossamento e il gonfiore della ghiandola. Monitorare la progressione del tumore ogni cinque-sette giorni. Una volta osservata una ghiandola mammaria gonfia e ingrossata, misurare i volumi del tumore ogni tre o quattro giorni per la cinetica di crescita del tumore.Una volta che i tumori palpabili appaiono, il targeting efficace dell'albero duttale mammario può essere visualizzato preparando intere montature della ghiandola mammaria dopo l'iniezione di trip e blu per verificare la corretta iniezione o dopo l'iniezione di un adenovirus che esprime la ciliegia M per verificare la corretta preparazione virale e l'infezione delle cellule epiteliali duttili. Quando i tumori vengono indotti in topi transgenici F Fluxed P 53 LSLK RAs, i tumori iniziali non diventeranno evidenti fino al giorno 40 circa, quando le ghiandole mammarie si ingrandiscono e si gonfiano. A partire dal giorno 56 circa, i tumori inizieranno a crescere in modo esponenziale.A questo punto, è fondamentale misurare i volumi del tumore ogni tre giorni. Se si desiderano studi cinetici, poiché ci sarà una normale variabilità da topo a topo nella progressione del tumore, grandi masse addominali saranno evidenti entro il giorno 80, dopodiché i topi dovrebbero essere soppressi se i tumori superano più del 10% del peso corporeo dell'animale. L'analisi del CDNA di tre linee cellulari derivate da tumori al seno in topi transgenici con flusso P 53 LSL KRAS ha rivelato che i tumori esprimono mesotelina citocheratina otto, HER due nuovi e il recettore alfa degli estrogeni, simile al microambiente cellulare nel carcinoma mammario umano si osserva l'infiltrazione di cellule T alfa, beta e gamma delta, nonché cellule soppressori di derivazione mieloide e macrofagi nei tumori.Il sistema vascolare che drena verso il linfonodo ascellare inizierà a ingozzarsi prima che i tumori siano cresciuti e alla fine comprenderà l'intero tessuto della memoria in cui è stata eseguita l'iniezione. Ci sarà anche un evidente ingorgo della vena epigastrica superficiale tra i linfonodi inguinali e ascellari. Dopo sette-otto settimane, il linfonodo ascellare si ingrossarà a causa dell'invasione linfovascolare delle cellule tumorali.L'invasione linfovascolare e le metastasi delle cellule tumorali possono essere monitorate incrociando topi transgenici Flocked P 53 LSLK RA con topi L-S-L-E-Y-F-P. Dopo l'escissione pre-mediata, le cellule che esprimono livelli sia alti che bassi di YFP vengono rilevate nel tumore e le loro metastasi possono essere ricondotte al linfonodo ascellare drenante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su una coorte sperimentale di 20 topi in due o tre ore se eseguita correttamente.Seguendo questa procedura, altri modelli tumorali possono essere sviluppati allevando topi con blocchi aggiuntivi, transgeni p, per rispondere a domande come, in che modo i diversi oncogeni influenzano la patologia, il microambiente immunitario e l'invasione metastatica del cancro al seno.

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