Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sviluppare un modello murino di cancro al seno che alla fine metastatizza in presenza di un sistema immunitario sano. Ciò si ottiene in primo luogo somministrando un adenovirus che esprime Cree nel canale duttale mammario degli animali da esperimento. La ghiandola mammaria viene quindi palpata regolarmente per monitorare la progressione del tumore.

In definitiva, le metastasi tumorali e l'infiltrazione leucocitaria nel linfonodo ascellare possono essere valutate mediante analisi citofluorimetrica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai modelli esistenti di tumore al seno è che consente l'inizio preciso di tumori che possono svilupparsi in presenza di un sistema immunitario maturo e che possono essere tracciati dall'espressione di YFP. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi introduttive dell'iniezione sono difficili da imparare.

Il corretto posizionamento dell'ago richiede precisione e pratica. Il giorno dell'esperimento, conservare Eloqua di quattro volte 10 delle ottave unità formanti la placca di adenovirus Cree su ghiaccio secco, scongelare il virus a temperatura ambiente impostata e mescolarlo con una quantità sufficiente del 3% di saccarosio in acqua sterile per portare il volume finale fino a 10 microlitri. Successivamente, mescolare delicatamente 34 microlitri di mem e quattro microlitri di cloruro di calcio appena preparato nel virus e incubare la soluzione a temperatura ambiente.

Dopo 15-20 minuti, il terreno apparirà torbido indicando la formazione dei precipitati dell'adenovirus. Muovi delicatamente il tubo per assicurarti che le particelle virali siano distribuite uniformemente in tutta la sospensione, quindi per iniettare le particelle virali aspira tre microlitri di virus in una siringa da 10 microlitri. Quindi posizionare un topo anestetizzato sulla schiena sul tavolino illuminato di un microscopio da dissezione pulito.

Illumina l'addome con una fonte di luce extra e individua la quarta ghiandola mammaria inguinale sinistra o la nona destra in base alle piccole macchie bianche di pelo che circondano ciascun capezzolo. Ora strofina delicatamente il capezzolo con un applicatore sterile imbevuto di etanolo con punta in cotone. Quindi fissare il capezzolo con una pinza chirurgica fine e tirare su con una forza leggera.

Per rimuovere il tappo di cheratina, stabilizzare il capezzolo tra le pinze e inserire delicatamente l'ago tra le punte. Incannulando il canale del dotto con un angolo di 90 gradi per garantire la corretta profondità di iniezione, tirare delicatamente l'ago verso l'alto dopo averlo inserito nel lume del condotto, tirando il capezzolo verso l'alto lungo i bordi dell'ago mentre viene tirato verso l'alto. Quando l'ago è posizionato correttamente, immergere delicatamente l'intero contenuto della siringa.

Il capezzolo dovrebbe gonfiarsi leggermente man mano che viene aggiunto il liquido. Dopo l'iniezione, riposizionare il mouse sul termoforo fino a quando non inizia a riprendersi dall'anestesia. Quindi rimetti l'animale in una gabbia pulita e monitoralo fino a quando non si osserva il pieno recupero.

Palpare la ghiandola della memoria iniettata al giorno 30 per valutare l'ingrossamento e il gonfiore della ghiandola. Monitorare la progressione del tumore ogni cinque-sette giorni. Una volta osservata una ghiandola mammaria gonfia e ingrossata, misurare i volumi del tumore ogni tre o quattro giorni per la cinetica di crescita del tumore.

Una volta che i tumori palpabili appaiono, il targeting efficace dell'albero duttale mammario può essere visualizzato preparando intere montature della ghiandola mammaria dopo l'iniezione di trip e blu per verificare la corretta iniezione o dopo l'iniezione di un adenovirus che esprime la ciliegia M per verificare la corretta preparazione virale e l'infezione delle cellule epiteliali duttili. Quando i tumori vengono indotti in topi transgenici F Fluxed P 53 LSLK RAs, i tumori iniziali non diventeranno evidenti fino al giorno 40 circa, quando le ghiandole mammarie si ingrandiscono e si gonfiano. A partire dal giorno 56 circa, i tumori inizieranno a crescere in modo esponenziale.

A questo punto, è fondamentale misurare i volumi del tumore ogni tre giorni. Se si desiderano studi cinetici, poiché ci sarà una normale variabilità da topo a topo nella progressione del tumore, grandi masse addominali saranno evidenti entro il giorno 80, dopodiché i topi dovrebbero essere soppressi se i tumori superano più del 10% del peso corporeo dell'animale. L'analisi del CDNA di tre linee cellulari derivate da tumori al seno in topi transgenici con flusso P 53 LSL KRAS ha rivelato che i tumori esprimono mesotelina citocheratina otto, HER due nuovi e il recettore alfa degli estrogeni, simile al microambiente cellulare nel carcinoma mammario umano si osserva l'infiltrazione di cellule T alfa, beta e gamma delta, nonché cellule soppressori di derivazione mieloide e macrofagi nei tumori.

Il sistema vascolare che drena verso il linfonodo ascellare inizierà a ingozzarsi prima che i tumori siano cresciuti e alla fine comprenderà l'intero tessuto della memoria in cui è stata eseguita l'iniezione. Ci sarà anche un evidente ingorgo della vena epigastrica superficiale tra i linfonodi inguinali e ascellari. Dopo sette-otto settimane, il linfonodo ascellare si ingrossarà a causa dell'invasione linfovascolare delle cellule tumorali.

L'invasione linfovascolare e le metastasi delle cellule tumorali possono essere monitorate incrociando topi transgenici Flocked P 53 LSLK RA con topi L-S-L-E-Y-F-P. Dopo l'escissione pre-mediata, le cellule che esprimono livelli sia alti che bassi di YFP vengono rilevate nel tumore e le loro metastasi possono essere ricondotte al linfonodo ascellare drenante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su una coorte sperimentale di 20 topi in due o tre ore se eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, altri modelli tumorali possono essere sviluppati allevando topi con blocchi aggiuntivi, transgeni p, per rispondere a domande come, in che modo i diversi oncogeni influenzano la patologia, il microambiente immunitario e l'invasione metastatica del cancro al seno.