Name: Ottimizzazione e utilizzo di Agrobacterium-Mediata transitoria produzione di proteine in Nicotiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Impara la produzione transitoria di proteine ricombinanti in piante di Nicotiana mediante infiltrazione con Agrobacterium sotto vuoto. Questo metodo scalabile ottimizza le condizioni di coltivazione idroponica per ottenere elevate rese di antigeni vaccinali e proteine terapeutiche.

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Questo lavoro è stato supportato dal Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. e la Defense Advanced Research Projects Agency (sovvenzione # HDTRA1-07-C-0054). Gli autori riconoscono i doni generosi di Drs. Stanton Gelvin di Biological Science Dept., Purdue University (Agrobacterium tumefaciens ceppi) e Wayne Fitzmaurice di Large Scale Biology Corp. (N. semi excelsiana), così come Jennifer Nicholson di US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. semi Excelsior ). Gli autori ringraziano Margaret Shillingford e Christopher Hull per la fornitura di impianti e un&#39;eccellente assistenza tecnica. Gli autori ringraziano anche Drs. Stephen Streatfield e Natasha Kushnir per l&#39;assistenza editoriale.

1. Pianta che cresce Per la successiva agroinfiltration abbiamo valutato due wild-type Nicotiana specie (N. benthamiana e N. Excelsior) e un ibrido (N. excelsiana) coltivate idroponicamente in lana di roccia in strutture al coperto. <ol><li> Immergere lastre di lana di roccia in una soluzione fertilizzante per le piante. </li><li> Seminare semi di wild-type N. benthamiana, N. excelsior e N. excelsiana (ibrido di N. benthamiana × N. excelsior) sui nutrienti bagnato superficie di lana di roccia. </li><li> Crescere le piante dai semi in condizioni controllate (24 ° C e 40-65% di umidità relativa) e un fotoperiodo lungo giorno (14 ore di luce e 10 ore scuro, con illuminazione di 130-150 μE m -2 s -1) per 4-5 settimane per N. e N. benthamiana excelsiana, e 5-6 settimane per N. excelsior. </li></ol> 2. Costruzione di vettori per Agroinfiltratione <ol><li> Inserire un gene reporter sintetico (la proteina fluorescente verde [GFP]), full-length emoagglutinina (HA) del ceppo A/California/04/2009 del virus dell&#39;influenza (HAC1), e re-ingegnerizzato lichenasi enzima (LicKM) 18 separatamente in il lancio vettore pBID4 18 (vector-based TMV) per ottenere pBID4-GFP, pBID4-HAC1 e pBID4-LicKM, rispettivamente, 18,32,41,47. </li><li> Introdurre 10-50 ng di pBID4 trasportare GFP o HAC1 in cellule elettrocompetenti di A. tumefaciens ceppo GV3101 e LicKM in cellule elettrocompetenti di A. tumefaciens ceppi GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 e A4 con il elettroporatore gene MicroPulser. </li><li> Utilizzare il Agrobacteria trasformata per esperimenti di infiltrazione, se non diversamente indicato. </li></ol> 3. Aspirare Infiltrazione di Agrobacterium in Nicotiana Piante <ol><li> Crescere A. tumefaciens ceppi overnight (O / N) in mezzo LB, med YEBium o AB medie completato con 50 mg / L di kanamicina a 28 ° C in agitazione a 200-250 rpm. </li><li> Diluire Agrobacteria in acqua Milli-Q di densità ottica a 600 nm (A 600) di 0,5 o centrifuga tumefaciens cellule coltivate in LB o YEB o AB a 4.000 × g per 10 min a 4 ° C, risospendere in mezzo ad induzione (sale 1x MS, MES 10 mM, 200 mM acetosyringone, 2% di saccarosio [MMA]) A 600 di 0,5, e agitare a temperatura ambiente per 1-3 hr, se non diversamente specificato. </li><li> Infiltrarsi piante in una camera a vuoto immergendo tessuti aeree della pianta Nicotiana in sospensione Agrobacterium e applicando un vuoto 50-400 mbar per 30 o 60 secondi. L&#39;infiltrazione ottimale viene normalmente applicato a 50-100 mbar per 60 sec. </li><li> Una volta eliminato il sottovuoto, togliere piante dalla camera sotto vuoto, lavare in acqua, e crescere per 5-7 giorni nelle stesse condizioni di crescita utilizzate per la crescita di pre-infiltrazione. </li><li> Per testare l&#39;efficaciadi sostanze chimiche che inducono Agrobacterium gene vir, diverse concentrazioni di acetosyringone (0, 100, 200 o 400 mM) sono stati aggiunti al Agrobacteria sospesa in tampone infiltrazione (1x MS, MES 10 mM, 2% di glucosio). Per l&#39;effetto di monosaccaride sull&#39;induzione di geni vir, diverse percentuali di glucosio (0, 1, 2 o 4%) sono stati aggiunti a Agrobacteria sospesa nel buffer infiltrazione (1x MS, MES 10 mM, 200 mM acetosyringone). N. piante benthamiana sono stati infiltrati come già detto in fasi 3.3 e 3.4). </li><li> Laboratorio Agrobacterium ceppi GV3101, C58C1 e LBA4404 e wild-type ceppi A4, AT06, AT10, e At77 ospitare il vettore pBID4-LicKM sono stati diluiti in acqua Milli-Q A 600 del 0.5. N. piante benthamiana sono stati infiltrati con ogni sforzo particolare per quanto detto sopra in passi 3.3 e 3.4. </li></ol> 4. Procedura Co-agroinfiltration per il silenziamento soppressore Viral <ol><li> Mix i Milli-Q-diluita di acqua Agrobacterium GV3101 culture che trasportano il gene GFP e virale silenziamento soppressore p19 di pomodoro virus del rachitismo cespuglioso (TBSV) a 1:1, 2:1, 3:01 e 4:01 rapporti. Infiltrati N. benthamiana piante come descritto sopra. </li><li> Infiltrati N. piante benthamiana con una miscela di due Milli-Q-diluita di acqua Agrobacterium GV3101 culture: il primo porta il plasmide pBID4-HAC1 e la seconda trasporta uno dei soppressori di silenziamento - p19 di TBSV o p23 di Citrus tristeza virus, in plasmide pCassp ( pCassp19) e nel PGR plasmide binario sotto il promotore 35S (PGR-P23), rispettivamente, in rapporto 4:1. </li></ol> 5. Western Blot analisi <ol><li> Raccogliere campioni di foglie casuali da N. benthamiana, N. excelsior o N. piante excelsiana a 4-7 dpi e polverizzare in azoto liquido a una polvere finissima. </li><li> Aggiungere tre volumi di tampone PBS 1x contenente 0,5% TritonX-100 per ciascun campione. </li><li> Agitare delicatamente i campioni estratti per 15 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugare l&#39;estratto per 5 minuti e raccogliere proteine ​​totali solubile in una provetta pulita Eppendorf. </li><li> Diluire gli estratti di una diluizione appropriata (1:50 1:100) in tampone di estrazione 1x PBS, e aggiungere 5 × tampone campione (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], il 10% SDS, 0.5% blu di bromofenolo, 50% glicerolo v / v, e DTT 500 mm) per una finale 1 × concentrazione. </li><li> Campioni bollire per 5 min. </li><li> Proteine ​​separate del 10% SDS-PAGE, trasferiscono sulla membrana di trasferimento Immobilon-P, e bloccano con 0,5% I-block. </li><li> Controllo GFP usando policlonale di coniglio anti-GFP antisiero a 1/5.000 e HAC1 mediante anticorpo monoclonale anti-poli-istidina mouse 1:1000 in soluzione bloccante per 1 ora. </li><li> Dopo marcatura anticorpo primario, lavare le membrane tre volte per 10 minuti ciascuno con 1 × PBST-20 e incubare con perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpo anti-coniglio a 1/5.000 o un HRP-coniugatod anticorpo anti-topo a 1:10.000 per 1 ora, per la GFP e la rilevazione HAC1, rispettivamente. </li><li> Elaborare Western blot utilizzando il substrato SuperSignal Ovest Pico Chemiluminescent. </li><li> Utilizzare il Software GeneTools analizzare intensità della banda della proteina e avere la quantità calibrata band. </li></ol> Produzione di proteine: (calibrato quantità x diluizione del campione) / quantità di campione caricato) x 4 = mg / kg. Equazione: Produzione di proteine ​​(P), quantità calibrata (C), diluizione del campione (D) e la quantità di campione caricato (S). 6. Zymogram Assay <ol><li> N. Raccogliere pBID4-LicKM-infiltrati benthamiana campioni di tessuto casuale. </li><li> Estrarre proteine ​​usando gli stessi metodi descritti sopra per analisi Western blot e quindi analizzare del 10% SDS-PAGE con 0.1% lichenan incluso nel gel. </li><li> Dopo l&#39;elettroforesi, lavare i gel due volte per 10 minuti ciascuno in tampone di lavaggio (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] e 0,1% Triton X-100) E poi incubare in tampone di lavaggio a 65 ° C per 1 ora. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, scartare il tampone di lavaggio e macchiare i gel con 0,5% Congo Red per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare i gel in acqua Milli-Q per tre volte per 10 minuti ciascuno, e aggiungere 1 M NaCl per visualizzare l&#39;attività lichenasi. La proteina lichenasi batterico purificato è stato utilizzato come controllo positivo per l&#39;attività enzimatica. </li></ol> 7. GFP Imaging <ol><li> Eseguire il rilevamento visivo di fluorescenza GFP in piante intere transitoriamente trasformate usando una lampada UV di lunghezza d&#39;onda a mano. </li><li> Fotografia transitoriamente trasformato piante con una macchina fotografica digitale attraverso un giallo 8, ES 52 filtro (tempo di esposizione, 15 sec). </li><li> Ottenere immagini da analisi Western blot utilizzando il software GeneSnap su un GeneGnome e quantificare i risultati utilizzando il software GeneTools, con una curva di calibrazione basato sullo standard GFP purificata. </li><li> Quantificare proteina HAC1 utilizzando una curva di calibrazione basato sulla depurazioneed HAC standard di proteine ​​dal ceppo A/Indonesia/05/05 del virus dell&#39;influenza. </li><li> Calcolare i valori medi di 3-4 replicati per tutti gli esperimenti. </li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo studio, abbiamo sviluppato un semplice protocollo agroinfiltration per la produzione di proteine ​​transitoria di routine in specie di Nicotiana selezionati utilizzando ceppi tumefaciens che portano il lancio vettore. Inoltre, abbiamo identificato le condizioni ottimali per raggiungere il massimo livello di produzione della proteina ricombinante nel nostro sistema di espressione transiente pianta. Vacuum infiltrazione della A. tumefaciens ceppo diluito GV3101 ospitare i pBID4 vettore di lancio in N. benthamiana, N. excelsiana e N. excelsior portato a livelli più elevati di produzione di proteine ​​bersaglio entro 7 dpi rispetto ad altre specie vegetali, come Pisum sativum infiltrata con GV3101 ospitare Alfalfa mosaic virus - o Cucumber mosaic virus-vettori basati esprimono il gene reporter GFP sotto il promotore 35S 41, o Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum e Arabidopsis thaliana infiltrati con il ceppo C58C1 di A. tumefaciens che portano la beta-glucuronidasi giornalista gene 57. N. e N. benthamiana excelsiana erano facili da aspirare infiltrarsi a 50 mbar per 30-60 secondi, con il 90-95% di efficienza infiltrazione. Il restante 5-10% della superficie del foglio non è stato infiltrato causa di qualche fluttuazione di foglie sulla superficie della sospensione Agrobacterium durante l&#39;applicazione del vuoto. Dal lancio vettore ha la capacità di movimento 18 cellula-cellula, accumulo di proteine ​​transitorio si verifica in foglie intere nonché piccioli a 7 dpi. A 10 dpi, la produzione stimata GFP era leggermente inferiore in quanto il vettore di espressione pBID4 è in grado di muoversi da una cella all&#39;altra, ma non per spostare sistemica 18; Pertanto, le foglie di nuova produzione non contengono il vettore e non contribuiscono alla produzione di destinazione. Inoltre, la degradazione della proteina ricombinante nel tempo may contribuire a ridurre il livello di proteine ​​a 10 dpi. I nostri risultati hanno mostrato che l&#39;infiltrazione del A. alti livelli tumefaciens ceppo GV3101 mediate di produzione di proteine ​​transitoria in N. benthamiana. Inoltre, proteina bersaglio può essere progettato come fusioni N-terminale, C-terminale o interne alla lichenasi (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanasi, che è un enzima termostabile da Clostridium thermocellum e conferisce stabilità termica a molti di destinazione proteina di fusione 18. Infiltrazione di N. benthamiana con A. tumefaciens ceppi wild-type (AT6, AT10 e at77) ospitano il gene di interesse suscitato sintomi lievi o gravi: foglia di curling, picciolo allungamento, e curling. Senza sintomi patologici sono stati osservati in N. benthamiana infiltrato con la GV3101 ceppo di laboratorio ospitare vuoto pBID4 vettore, mentre alcuni geni inseriti in pBID4 e trasformate in laboratorio ceppi GV3101, C58C1 o LBA4404 suscitato reazioni necrotiche miti e fogliaclorosi / ingiallimento sintomi nelle regioni infiltrati di foglie. I sintomi necrotici causati da wild-type Agrobacterium o ceppi disarmati in solanacee sono stati segnalati in precedenza 56,57. La risposta necrotico potrebbe derivare da fattori di virulenza del sistema di secrezione di tipo III, proteine ​​batteriche trasferite alla cellula vegetale dal sistema di secrezione di tipo IV, e / o sensibilità alla flagellin 58-60. Abbiamo trovato che la produzione di proteine ​​eterologhe transitorio può anche suscitare patogenicità e una risposta ipersensibile in pianta infiltrato foglie. Molti ricercatori hanno riferito che agroinfiltration di diverse specie di piante con piante vettori binari prodotti fino a 5-20 volte più alti livelli di produzione di proteine ​​transitoria rispetto agli impianti stabilmente trasformate 28,57. I nostri dati mostrano che N. benthamiana infiltrato con GV3101 ospitare pBID4-GFP transitoriamente espressi alti livelli di GFP, che è simile al rendimento GFP riportato perN. benthamiana infiltrato con Agrobacteria portando il vettore virale Pich-GFPSYS (fino al 80% delle proteine ​​totali solubili) 44. Agroinfiltration utilizzando il nostro lancio vettore provocato alta produzione della proteina LicKM termostabile, 50 volte superiore a quella osservata utilizzando un plasmide standard binario 18. Per testare l&#39;infettività A. tumefaciens e la stabilità del lancio vettore, abbiamo infiltrate per piano di N. benthamiana ogni ora per un massimo di 8 ore utilizzando la stessa Milli-Q cultura diluito con acqua del GV3101 ospitare plasmide pBID4-GFP. I nostri dati hanno mostrato che il ceppo GV3101 è efficacemente infettivo per almeno 8 ore e pBID4 (il lancio vettore) è molto stabile durante la 8 ore di lungo infiltrazione. Stock di glicerolo di tensione GV3101 ospitare il vettore di lancio pBID4-HAC1 (banca di cellule), conservato a -80 ° C ha dimostrato di essere molto stabile per tre anni senza variazioni di prote transitoriain produzione negli impianti di infiltrati. N. benthamiana piante coltivate in condizioni ottimali e tra 35 e 42 giorni dopo la semina erano ottimali per il vuoto espressione genica transiente infiltrazione mediata 40. Piante giovani (3-4 settimane) non possono essere infiltrati completamente a causa delle foglie che galleggiano sulla superficie sospensione cellulare e danni ai tessuti dagli effetti meccanici di applicazione di un vuoto. Negli impianti più vecchi di 45 giorni, N. benthamiana bullonatura palco, sotto le condizioni di luce ottimali utilizzati, il livello di espressione transiente è basso. Composti a basso peso molecolare fenolici (acetosyringone) e monosaccharaides (glucosio) sono noti per indurre i geni vir in A. tumefaciens 55,61. Inoltre, infiltrazione di N. benthamiana con il vettore pCAMBIA binario (GFP) in presenza di acetosyringone alle concentrazioni di 50-600 mM hanno mostrato di aumentare leggermente transitoriaespressione genica 40. Abbiamo studiato l&#39;effetto di diverse concentrazioni di acetosyringone e glucosio nel nostro sistema con l&#39;aggiunta di questi composti a culture GV3101 ospitano pBID4-GFP in MMA per 3 ore, e abbiamo trovato nessuna differenza di espressione GFP. È interessante notare che, culture GV3101 ospitano pBID4-GFP e diluito in acqua Milli-Q per un A 600 di 0,5 e infiltrati senza l&#39;induzione gene vir espresso le stesse quantità di GFP come quelli infiltrati con le culture indotte. Il A. Agrobacterium gene vir (s) potrebbe potenzialmente essere indotta da composti vegetali fenolici (acetosyringone e acido sinapinic) e monosaccharaides vegetali (glucosio e fruttosio) presenti nel tessuto fogliare. Pertanto, ipotizziamo che i livelli simili di espressione GFP in presenza o assenza di induttori esogeni gene vir possono essere il risultato dell&#39;effetto di citoplasmatici vir induttori gene presente durante la replicazione del lancio vettore GFP che esprimono in cellule vegetali. N. benthamiana è stato usato come modello host per la produzione di proteine ​​transitorio 49. Tuttavia, relativamente bassa resa in biomassa s &#39;N. benthamiana ostacola la sua applicazione per la produzione su larga scala di proteine ​​ricombinanti. L&#39;host ottimale dovrebbe combinare un alto livello di espressione transiente, facile crescita in una serra, e sia suscettibile di Agrobacterium infiltrazione 2. Per selezionare un host alternativo, abbiamo infiltrati due diverse specie di Nicotiana (N. benthamiana e N. excelsior) wild-type e un ibrido N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) con la A. tumefaciens ceppo GV3101 ospitare il plasmide pBID4-GFP. Tra queste tre specie, il livello di espressione GFP era leggermente superiore in N. benthamiana. N. piante Excelsior hanno mostrato difficoltà a agroinfiltration vuoto a causa delle loro foglie coriacee, e N. excelsianaprodotto circa due volte più biomassa nelle stesse condizioni di crescita. La produzione transitoria di GFP a 7 dpi è relativamente simile in N. e N. benthamiana excelsiana. Pertanto, N. excelsiana può essere una serie più adatto per la produzione di proteine ​​ricombinanti. Produzione di proteine ​​transiente mediata da Agrobacterium è limitato dal PTGS 26, che può essere superata mediante co-espressione di silenziamento genico soppressori di origine virus vegetale 62. Produzione di proteine ​​Transient è stato precedentemente dimostrato essere migliorata 50 volte in presenza della proteina p19 di TBSV, che inibisce PTGS nei tessuti infiltrati 34. Nel nostro studio, abbiamo valutato l&#39;effetto di due soppressori di silenziamento virali (p19 e p23) separatamente co-infiltrati con il vettore di lancio pBID4-HAC1. Il co-infiltrazione di questi soppressori di silenziamento sembrava avere poca influenza sulla espressione transiente di HAC1, con solo un leggero aumento HAC1accumulo di proteine ​​(15-25%) in presenza di co-p23 o p19 infiltrato. Per influenzare positivamente la produzione di proteine, soppressori di silenziamento può essere necessario appositamente selezionati per essere efficace per le specie vegetali bersaglio e vettore virale 63. TMV elicasi ha un soppressore dell&#39;attività del silenziamento dell&#39;RNA 64,65. I nostri dati confermano questa osservazione come co-infiltrazione di p23 o p19 con pBID4-HAC1 comportato alcun aumento di GFP o un leggero aumento della produzione di proteine ​​HAC1 transitoria. In conclusione, abbiamo modificato e ottimizzato pianta e condizioni di crescita tumefaciens e migliorato l&#39;efficienza di infiltrazione sotto vuoto. Questa tecnologia ci ha permesso di crescere e infiltrarsi centinaia di chilogrammi di materiale vegetale in poche ore. Abbiamo automatizzato con successo la pianta tecnica espressione transitoria per la produzione di vaccini high-throughput a bilance industriali sotto current Good Manufacturing Practices (cGMP) condizioni. Per ulteriori informazioni about automazione ed utilizzazione transitoria sistema di produzione di proteine ​​per la produzione di proteine ​​ricombinanti, inclusa candidati vaccini subunità, in condizioni di cGMP, si rimanda al sito <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Le piante sono ormai riconosciuto come una piattaforma sicura, affidabile, scalabile ed economica per la produzione di biofarmaci ricombinanti eterologhi e proteine ​​industriali 1-3 e avere importanti vantaggi rispetto ai sistemi di espressione delle cellule microbiche e animali 4. Le piante sono in grado di esprimere le proteine ​​ripiegate correttamente con modificazioni post-traslazionali, tra cui gli anticorpi multimerici assemblati 5-7. Diverse proteine ​​farmaceutiche ricombinanti derivati ​​da piante sono in fase di valutazione clinica 8. Questi includono i vaccini paziente-specifici ricombinanti idiotipo (scFv) per il trattamento del linfoma non-Hodgkin 9, pandemia a base di emoagglutinina e stagionali candidati vaccino influenzale 10,11 (Cummings et al., Presentato al vaccino), anti-antigene di superficie Streptococcus I / anticorpo II per il trattamento della carie dentale 12, e l&#39;insulina umana per il trattamento del diabete 13. Inoltre, reco umanaglucocerebrosidasi mbinant per la terapia enzimatica sostitutiva nei pazienti con malattia di Gaucher è stato approvato in Israele e negli Stati Uniti ed è previsto nell&#39;ambito del programma di accesso allargato al di fuori degli Stati Uniti 14,15. Proteine ​​eterologhe possono essere prodotti in modo stabile trasformato (transgenici o transplastomic) o transitoriamente piante trasformate. Produzione di proteine ​​Transient offre diversi vantaggi rispetto alla produzione in piante transgeniche, incluse breve periodo di tempo per ottenere espressione e di accumulo 16, e può essere realizzata introducendo vettori binari batteriche o vettori virali vegetali ricombinante nei tessuti vegetali 4. Il sistema più avanzato espressione transiente è basato sull&#39;uso di «vettori di lancio &#39;che combinano componenti di virus vegetali e plasmidi binari, e sono forniti da agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration di un vettore lancio basato su virus del mosaico del tabacco (TMV) è stata applicata con successo al laboratorioscala per la produzione di antigeni vaccinali contro gli agenti patogeni come il virus del papilloma umano 19, Yersinia pestis 20, influenza virus A 21,22, Bacillus anthracis 23, e il virus del vaiolo 24 in N. benthamiana lascia. mediata da Agrobacterium espressione transiente è anche un metodo promettente per la produzione simultanea di più proteine ​​2,25-27. Ad esempio, i sistemi di espressione transiente vegetali sono stati utilizzati per produrre anticorpi ricombinanti tumore-specifici 28,29, un anticorpo ricombinante glicosilata contro il fattore di crescita epidermico 30, e un anticorpo monoclonale specifico per antrace antigene protettivo 31,32. Co-infiltrazione di Nicotiana benthamiana piante con un gene target e un soppressore dei risultati silenziamento genico in una maggiore espressione della proteina bersaglio 33,34. Agroinfiltration è un metodo comune per introdu uniformementebatteri cendo che ospitano un gene di interesse in pianta tessuti 35-37. Vacuum infiltrazione di Agrobacterium per l&#39;espressione genica transiente in pianta intatta foglie è un metodo rapido, scalabile, e utile per la produzione di proteine ​​estranee, senza la necessità di generare piante transgeniche 38-41. Durante agroinfiltration vuoto, le piante sono capovolte a testa in giù e parti aeree immersi in sospensione Agrobacterium. Poi viene applicato il vuoto causando gas da evacuare dagli spazi intercellulari foglia attraverso gli stomi. Rapid ri-pressurizzazione seguente rilascio dei risultati vuoto nell&#39;infusione della sospensione Agrobacterium nella foglia. A seguito di vuoto infiltrazione di Agrobacteria, le piante vengono ulteriormente coltivate e di espressione obiettivo è monitorato. I più alti livelli di espressione di destinazione vengono tipicamente osservati 2-3 giorni dopo l&#39;infiltrazione (dpi) con un vettore binario e 4-7 dpi con un vettore di lancio, dopo che il livello di espressione tipicamente diminuises 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens è il veicolo più utilizzato per la consegna di un gene di interesse in un impianto per la produzione di proteine. Agroinfiltration funziona particolarmente bene in N. benthamiana ma relativamente poco nella maggior parte delle altre piante, tra cui Arabidopsis thaliana 46. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo semplice, efficiente ed economico per la produzione di proteine ​​transitoria in 5-6 settimane di età N. benthamiana utilizzando A. tumefaciens infiltrazione. Il principale inconveniente di scala industriale della tecnica agroinfiltration è centrifugazione di batteri raccolti e risospensione del pellet batterico in terreno contenente 4&#39;-idrossi-3 &#39;, 5&#39;-dimethoxyacetophenone (acetosyringone), monosaccaridi, e 2 - (N-morfolino) -etansolfonico acido (MES) tampone per l&#39;induzione dei geni Vir. Siamo stati in grado di superare questi problemi, ottimizzando l&#39;Agrobacterium </em&gt; crescita AB medio (minimo) seguita da direttamente diluendo in acqua Milli-Q e controllando la durata e condizioni di infiltrazione. Abbiamo anche confrontato obiettivo di produzione di proteine ​​nella wild-type specie ospite tabacco N. e N. benthamiana excelsior, nonché in ibrido N. excelsiana.

<table><tbody><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Collezione di germoplasma di tabacco, Dipartimento di Scienze delle Colture della North Carolina, North Carolina State University</td><td>PI 555478 TW16</td><td>Infiltration</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsior</td><td>Collezione di germoplasma di tabacco, Dipartimento di Scienze delle Colture della North Carolina, North Carolina State University</td><td>PI 555685 TW47</td><td>Infiltration</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiana</td><td>Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td><td>LSBC EBA 042304.02</td><td>Infiltrazione</td></tr><tr><td>Vacuum skid</td><td>Abbas, Ashland, MA</td> Custom <td>made</td><td>Infiltrazione vegetale</td></tr><tr><td>Rockwool</td><td>Grodan Inc., Ontario, Canada</td><td>AO 50/40</td><td>Mezzi idroponici per la coltivazione di</td></tr><tr><td>piante 2-(N-Morpholino) acido etansolfonico</td><td>Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ</td><td>172595000</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Murashige & Sale di Skoog (sale MS)</td><td>Phyto Technology Lab</td><td>M524</td><td>Terreni di coltura tissutale</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406-5G</td><td>Induzione di agrobatterio</td></tr><tr><td>Membrana di trasferimento Immobilon-P</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>IPVH00010</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>I-block</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA</td><td>T2015</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Antisiero policlonale anti-GFP di coniglio</td><td>Washington Biotechnology, Baltimora, MD</td><td></td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Mouse anti&ndash; anticorpo monoclonale poliistidina</td><td>Qiagen GmbH, Hilden</td><td>34670</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>111-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-topo coniugato con perossidasi di rafano</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal&reg; Substrato chemiluminescente West Pico</td><td>Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td><td>34078</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucano)</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlanda</td><td>P-LICHN</td><td>Lichenase Attività</td></tr> Congo <tr><td>Red&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6277</td><td>Colorazione in gel</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale&nbsp;</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>C-8080</td><td>Imaging a chemiluminescenza</td></tr><tr><td>GeneGnome</td><td>Syngene, Frederick, MD</td><td></td><td>Imaging a chemiluminescenza&nbsp;</td></tr><tr><td>Standard GFP&nbsp;</td><td>Imaging a chemiluminescenza</td> <td>realizzato in casa</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Soluzione fertilizzante per piante</td><td>Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE</td><td>67-23-20</td><td>Piante che crescono</td></tr><tr><td>Lichenase Standard</td><td>Purificato in casa</td><td></td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>BioRad, Hercules, CA</td><td>165-2100</td><td>Trasformazione dell'agrobatterio&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; agrobacterium</em&gt;-mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; nicotiana</em

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Produzione di proteine ​​transiente mediata da Agrobacterium in piante è un metodo promettente per produrre antigeni e proteine ​​terapeutiche entro un breve periodo di tempo. Tuttavia, questa tecnologia è solo cominciando ad essere applicate alla produzione come molti ostacoli tecnologici su larga scala per scalare vengono ora superati. Qui, dimostriamo un metodo semplice e riproducibile per la produzione su scala industriale di proteine ​​transitorio basato su vuoto infiltrazione di piante di Nicotiana con Agrobacteria trasportano vettori di lancio. Ottimizzazione della coltivazione Agrobacterium in AB mezzo permette diluizione diretta della coltura batterica in acqua Milli-Q, semplificando il processo di infiltrazione. Tra le tre specie testate di Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) è stato selezionato come host più promettente a causa della facilità di infiltrazione, elevato livello di giornalista produzione di proteine, e circa due-fvecchio maggiore produzione di biomassa in condizioni ambientali controllate. Induzione di Agrobacterium ospitare pBID4-GFP (virus del mosaico del tabacco-based) con prodotti chimici quali acetosyringone e monosaccharide ha avuto alcun effetto sul livello di produzione di proteine. Pianta infiltrandosi sotto 50 a 100 mbar per 30 o 60 secondi provocato circa il 95% infiltrazione dei tessuti foglia della pianta. Infiltrazione con ceppo di laboratorio Agrobacterium GV3101 ha mostrato la più alta produzione di proteine ​​rispetto al Agrobacteria ceppi di laboratorio LBA4404 e C58C1 e wild-type Agrobacteria ceppi at6, AT10, at77 e A4. Co-espressione di un silenziamento dell&#39;RNA virale soppressore p23 e p19, in N. benthamiana portato ad un accumulo precedente e un aumento della produzione (15-25%) di proteine ​​bersaglio (emoagglutinina virus dell&#39;influenza).

Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l&#39;accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-introduzione di silenziamento dell&#39;RNA soppressori.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un metodo semplice, efficiente e scalabile per la produzione transitoria di proteine ricombinanti in un sistema a base vegetale, utilizzando la tecnica di agroinfiltrazione. Questo risultato viene ottenuto innanzitutto ottimizzando le condizioni di crescita delle piante. Il secondo passaggio consiste nel trasformare l'agrobatterio con vettori di lancio che combinano componenti di virus vegetali e plasmidi binari, seguito dalla coltivazione dell'agrobatterio trasformato per l'utilizzo negli esperimenti di agroinfiltrazione.Durante l'infiltrazione con agrobatterio, le piante vengono capovolte e le parti aeree vengono immerse in una sospensione di agrobatterio. Successivamente viene applicato un vuoto, che provoca l'espulsione dell'aria dagli spazi intercellulari dei tessuti fogliari. Il rapido ripristino della pressione atmosferica dopo il rilascio del vuoto determina l'infusione della sospensione di agrobatterio nelle foglie.Infine, i saggi di immuno blotting e di fluorescenza vengono utilizzati per dimostrare la produzione di proteine ricombinanti nelle piante infiltrate. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'infiltrazione manuale, è che il metodo di infiltrazione sotto vuoto può essere ampliato per la produzione industriale di proteine ricombinanti, inclusi vaccini e proteine terapeutiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biotecnologia vegetale e facilitare ulteriormente l'uso delle piante come piattaforma alternativa per la produzione commerciale di proteine ricombinanti.L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo scoperto che ingrandire la filtrazione agro in piante coltivate in terreno è una sfida. Per diversi motivi, il terreno contiene agenti patogeni come virus, batteri e nematodi; inoltre, la composizione del terreno e l'acqua di irrigazione variano da lotto a lotto e da stagione a stagione, e il terreno deteriora nel tempo durante lo stoccaggio. Inoltre, capovolgere piante coltivate in terreno causerebbe la fuoriuscita indesiderata di terra nella coltura di agrobatterio durante l'infiltrazione.La procedura sarà dimostrata da Rebecca Snow, assistente di ricerca senior del laboratorio di biologia vegetale e ingegneria, e da Emma Gut Robin Lobe. Lei, insieme a Adam Trevor, sono assistenti di ricerca del mio laboratorio. Questo studio utilizza un mezzo di crescita vegetale idroponico e una soluzione nutritiva per garantire l'uniformità della crescita delle piante ed eliminare le complessità associate all'uso del suolo nella coltivazione delle piante.Per iniziare questa procedura, immergere lastre di lana di roccia in una soluzione di fertilizzante per piante per cinque minuti, quindi seminare manualmente i semi sulla superficie della lana di roccia impregnata di nutrienti. In questo studio verranno valutate tre specie Cedar Nico Oceana: due specie di tipo selvatico, Nico Oceana Benham Ana e Nico Oceana Excelsior, e un'ibrida derivata da Benham, Ana ed Excelsior denominata Nico Oceana. Far crescere le piante dai semi in condizioni controllate e con un fotoperiodo lungo, utilizzando un sistema idroponico a cascata.Nico Oceana, Bentham Miana e Nico Oceana Excela per quattro o cinque settimane, e Nico Oceana Excelsior per cinque o sei settimane. I ceppi di Agrobacterium tumefaciens utilizzati in questo esperimento sono stati trasformati con i vettori di lancio appropriati, come descritto nel manoscritto allegato. Ai fini di questa dimostrazione, vengono utilizzati cinque ceppi di agrobatteri trasformati.GV3101, contenente un gene che codifica per la proteina verde fluorescente, o GFP, GV3101, contenente il gene virale del soppressore dell'interferenza virale della tombusvirus del bushy stunt del pomodoro, P19, e un quarto GV3101, e un T10, contenente il gene di una liasi modificata o proteina trasportatrice lick KM. Coltivare ceppi di agrobatterio per tutta la notte in mezzo LB, integrato con 50 milligrammi per litro di canamicina a 28 gradi Celsius con agitazione a 200-250 giri al minuto. Il giorno seguente, preparare sospensioni di agrobatterio per gli esperimenti desiderati al fine di esaminare la fattibilità dell'uso di più ceppi di agrobatterio per la produzione transitoria di proteine, diluendo un ceppo di laboratorio e due ceppi selvatici, contenenti il vettore PBI4 lick KM, in acqua milliQ fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di 0,5.Per verificare la necessità di indurre i geni di virulenza di agrobacterium prima dell'infiltrazione, centrifugare innanzitutto le colture di agrobacterium contenenti il vettore P bid 4G FP, coltivate nel mezzo LB, a 4.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, risospendere nel mezzo di induzione MMA fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di 0,5 ed agitare a temperatura ambiente per due ore. Per verificare se l'acetil coenzima A migliora la produzione transitoria di proteine, centrifugare la coltura di agrobacterium contenente il vettore PBI 4G FP coltivata tutta la notte nel mezzo LB e risospendere nel buffer di infiltrazione contenente 1× sali MS, 10 millimoli, MES e 2% di glucosio.Dividere la sospensione cellulare in quattro contenitori. Aggiungere una concentrazione diversa di aceto ciascuna delle sospensioni di agrobacterium e incubare a temperatura ambiente per tre ore. Per testare l'effetto della co-infiltrazione di un soppressore virale dell'interferenza genica sulla produzione transiente della proteina GFP, eseguire la miscelazione.Un'acqua milli Q diluisce una coltura di agrobatterio portatrice del gene GFP e una coltura portatrice del soppressore della silenziamento virale P19 in un rapporto di quattro a uno durante l'infiltrazione a vuoto delle piante, che verrà dimostrata. Successivamente, è fondamentale controllare la pressione del vuoto e la durata dell'infiltrazione per infiltrare correttamente le piante a vuoto. Per prima cosa, trasferire la sospensione di agrobatterio preparata in un contenitore all'interno della camera a vuoto.Quindi capovolgere la pianta nel sospensione diluita di agrobatterio ed applicare un vuoto di 50-400 millibar per 30 o 60 secondi. L'infiltrazione ottimale viene di routine effettuata a 50-100 millibar per 60 secondi. Una volta interrotto il vuoto, rimuovere le piante dalla camera a vuoto, risciacquarle in acqua e coltivarle per cinque-sette giorni nelle stesse condizioni di crescita utilizzate per la crescita pre-filtrazione.Per preparare i campioni per l'analisi Western, raccogliere innanzitutto campioni casuali di foglie da piante di Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior o Nico Oceana Excela a quattro-sette giorni post infiltrazione o DPI, quindi macinare i campioni fogliari in azoto liquido fino a ottenere una polvere fine. Aggiungere tre volumi di buffer 1X PBS contenente lo 0,5% di Triton X-100 a ciascun campione e trasferire il campione in una provetta einor. Agitare delicatamente o ruotare i campioni estratti per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Centrifugare l'estratto per cinque minuti e raccogliere le proteine solubili totali in una provetta eppendorf pulita. Diluire gli estratti a un'adeguata diluizione in un tampone di estrazione XPBS 1X e aggiungere il buffer campione 5X fino a raggiungere una concentrazione finale 1X. Far bollire i campioni per cinque minuti prima della separazione delle proteine mediante elettroforesi SDS-PAGE.Dopo il trasferimento delle proteine su una membrana di trasferimento P immobile, rilevare la GFP utilizzando un antiserum policlonale anti-GFP da coniglio in un rapporto di diluizione di uno a 5.000 nella soluzione di blocco. Incubare a temperatura ambiente per un'ora con agitazione delicata dopo aver lavato le membrane tre volte con 1X-P-B-S-T 20. Incubare con l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano piccante anti-coniglio in un rapporto di diluizione di uno a 5.000 per un'ora al fine di rilevare la GFP.Successivamente, i blotting western vengono processati e le intensità delle bande corrispondenti alle proteine vengono analizzate come descritto nel manoscritto allegato. La rilevazione visiva della fluorescenza GFP in piante transitoriamente trasformate intere è effettuata utilizzando una lampada portatile a UV a lunga lunghezza d'onda; utilizzare una fotocamera digitale e un tempo di esposizione di 15 secondi per fotografare le piante transitoriamente trasformate attraverso un filtro giallo eight ES 52. Ottenere le immagini provenienti dalle analisi dei blotting western utilizzando il software gene snapped su un genome.Quantificare i risultati utilizzando il software gene tool con una curva di calibrazione basata su un standard purificato di GFP, Nick Oceana Bentham Miana è stato coltivato su lastre di Rockwell inzuppate in fertilizzanti commercialmente disponibili per determinare le condizioni ottimali per la crescita delle piante e l'accumulo di biomassa. La presenza di fosforo è fondamentale per ottenere la germinazione e la crescita di NICO Oceana. Semi di Bentham come mostrato da queste piante di sei settimane cresciute in una soluzione fertilizzante contenente il 4,8% di fosforo o in una soluzione fertilizzante contenente lo 0% di fosforo.Gli effetti della crescita dell'agrobatterio e dei mezzi di infiltrazione sulla salute delle piante e sulla produzione proteica sono stati esaminati confrontando la produzione di GFP in nicotiana. Piante Hamana sono state infiltrate a vuoto con PBI 4G FP contenente colture di agrobatterio coltivate in tre mezzi diversi. Colture YEB, AB e LB cresciute in YEB o LB durante la notte sono state centrifugate a bassa velocità e risospese in mezzo di induzione MMA oppure cresciute durante la notte in YEB, LB o AB e direttamente diluite uno a cinque o uno a dieci con acqua Milli Q. Come illustrato in questo risultato di western blot, le piante infiltrate con colture di agrobatterio cresciute in YEB, LB o AB e diluite con acqua Milli Q non hanno mostrato differenze significative nella produzione media di GFP rispetto alle colture centrifugate e risospese in MMA.Pertanto, si raccomanda l'uso di acqua milli Q per diluire le colture di agrobatterio destinate all'infiltrazione vegetale, e questo tipo di acqua è stato regolarmente impiegato nei successivi esperimenti per raggiungere una densità ottica a 600 nanometri pari a 0,5. Successivamente, sono stati esaminati gli effetti della densità della sospensione cellulare di agrobatterio e del decorso temporale sull'espressione del bersaglio. Sono state valutate quattro diverse densità di sospensione cellulare di agrobatterio contenente PBI 4G FP e campioni fogliari sono stati raccolti a quattro, sette e dieci giorni dopo l'infiltrazione (DPI). Per l'analisi tramite western blot a quattro DPI, si sono osservate differenze evidenti nella fluorescenza di GFP tra piante infiltrate con diverse densità di sospensione cellulare di agrobatterio; nessuna espressione di GFP è stata rilevata a un valore di OD600 pari a 0,05 a sette DPI-GFP.La fluorescenza era simile nelle piante infiltrate a sospensione cellulare. Densità di a 601,0 0,5 e 0,1, ma era inferiore negli impianti infiltrati a un A 600 di 0,05 in confronto a 10 DPI. Nessuna differenza nella produzione di GFP è stata osservata tra le piante infiltrate con una qualsiasi delle quattro densità di sospensione cellulare per aumentare la diversità di ceppi di agrobatterio disponibili per la produzione transitoria di proteine.Le piante di Nicotiana Benham miana sono state infiltrate a vuoto con sette ceppi diversi di batteri agro che contenevano il vettore KBI four lick km. Le foglie infiltrate sono state raccolte a 7 DPI e il livello di espressione della chinasi è stato stimato mediante Western blot. Come mostrato in questo grafico, il livello più alto di produzione della liasi è stato ottenuto con i ceppi GV 3 1 10, 1 A four e LBA 4 4 0 4, con lievi differenze.Sebbene il livello più basso di espressione fosse stato osservato con C cinque otto C uno, una produzione intermedia di lisasi è stata ottenuta con i ceppi a T 77 A T zero sei e a T 10. L'attività enzimatica della lisasi è stata dimostrata mediante un saggio XMO Graham. La proteina lisasi batterica purificata è stata utilizzata come controllo positivo per l'attività enzimatica. È interessante notare che piante di nicotiana Benham miana infiltrate con i ceppi selvatici di agrobatterio A quattro e a T sette sette hanno mostrato sintomi patologici come nanismo, allungamento e incurvamento del picciolo e incurvamento delle foglie a sette giorni post-infezione (DPI).I sintomi erano lievi nelle piante di nicotiana benham infiltrate con il ceppo di tipo selvatico T 10. Nessun sintomo è stato osservato nelle piante di Nico Oceana Benham infiltrate con il ceppo di laboratorio GV 3 1 0 1. Un confronto della produzione di biomassa vegetale nelle specie di tipo selvatico ha rivelato che, nelle stesse condizioni di crescita, la biomassa fogliare massima ottenibile da Nico Oceana Excela è approssimativamente doppia rispetto a quella di Nico Oceana.La produzione proteica di Benham è stata esaminata in Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior e Nico Oceana Excela infiltrate con ceppi di agrobatterio. L'accumulo di PBI 4G F-P-G-F-P nel ceppo GV 3 1 0 1 è stato valutato a sette giorni post-infiltrazione (DPI) in foglie intere infiltrate. L'osservazione visiva dell'espressione di GFP sotto luce UV ha mostrato una distribuzione uniforme della GFP in Nico Oceana Hamana e in Nico Oceana Excela, e una distribuzione irregolare in Nico Oceana Excelsior, dovuta alla difficoltà di infiltrare completamente l'intera superficie fogliare di Nico Oceana Excelsior. L'analisi mediante Western blot dell'accumulo di GFP in queste foglie infiltrate a sette DPI ha mostrato che il livello di GFP era più elevato in Nico Oceana Hamana rispetto a Nico Oceana Excela e Nico Oceana Excelsior, con un basso livello di produzione proteica in Nico Oceana.Excelsior è dovuto a un'infiltrazione non uniforme e a una distribuzione irregolare della GFP accumulata nella foglia raccolta. Per testare l'effetto della pressione a vuoto sulle foglie, le piante di Nico Oceana Benham sono state infiltrate con il ceppo di agrobatterio GV3101 contenente PBI4GFP, applicando pressioni a vuoto di 400, 200, 100 o 50 millibar per un tempo di mantenimento a vuoto di 30 o 60 secondi. Non sono state osservate differenze nella produzione di GFP né effetti dannosi, lievi o nulli, sulla salute della pianta quando sono state applicate pressioni a vuoto di 5, 100 e 200 millibar per 30 o 60 secondi.L'effetto della durata del vuoto sull'espressione dell'obiettivo è stato valutato infiltrando un contenitore di piante Nico Oceana Benham ogni ora con un A 600 di 0,5 di GV 3 1 0 1 contenente PBI 4G FP per otto ore. Nella stessa coltura di agrobatterio mostrata in questo risultato rappresentativo, il livello di produzione di GFP è risultato simile in tutti i tempi fino a otto ore, suggerendo che durante questo periodo l'agrobatterio mantiene la sua capacità di trasferire un DNA a singolo filamento. Poiché è stato riportato che molti composti chimici e monosaccaridi aumentano la produzione transitoria di proteine in diverse specie vegetali.Questo studio ha inoltre valutato l'effetto di diverse concentrazioni di acetofenone, crinone e glucosio sulla produzione transitoria della proteina GFP in Nicotiana benthamiana, infiltrata con il ceppo di agrobatterio GV3101 contenente il vettore PBI4GFP. L'agrobatterio è stato coltivato per tutta la notte in mezzo YEB, centrifugato e sospeso nuovamente a un valore di a600 pari a 0,5, in MMA contenente glucosio al 2% con acetofenone alle concentrazioni indicate oppure in MMA contenente acetofenone a 200 micromolari con glucosio alle concentrazioni indicate. Come mostrato qui, nessuna delle concentrazioni testate di questi composti ha indotto un aumento significativo nella produzione della proteina GFP rispetto al controllo, in cui il mezzo di induzione non conteneva né acetofenone né glucosio.In seguito, è stato esaminato l'effetto della co-infiltrazione di un soppressore della silenziamento sull'espressione transiente dei geni GFP e HAC in foglie di Nico Oceana. Benham prima dell'infiltrazione. Colture di agrobatteri GV3101 contenenti PBI 4G FP e il soppressore virale del silenziamento P19 del tomato bushy stunt virus sono state rispettivamente miscelate in rapporti di 1:1, 2:1, 3:1 e 4:1. Come indicato dai risultati dell'analisi Western blot a 7 DPI, la presenza di P19 non ha aumentato né ridotto la produzione di GFP in Nicotiana Benhamiana a nessun rapporto tra le sospensioni di agrobatteri.Inoltre, è stato studiato l'effetto dei due soppressori virali del silenziamento genico P 23 e P 19 sulla prevenzione del silenziamento genico post-trascrizionale per HAC uno. POS di agrobatterio contenente il vettore launch PBI quattro HAC uno e uno dei due plasmidi del soppressore virale del silenziamento sono stati mescolati in un rapporto di quattro a uno, rispettivamente, e co-infiltrati in Nicotiana Benthamiana. I campioni di foglie infiltrate sono stati raccolti da tre a otto giorni post-infiltrazione (DPI).Questo grafico mostra i livelli medi di espressione di HAC one ottenuti da tre esperimenti, determinati mediante analisi di Western blot. La co-infiltrazione di Nico Oceana Benham con P 23 o P 19 ha determinato un aumento della produzione di HAC one rispetto all'uso senza soppressore di silenziamento a 60 pi. Ciò suggerisce che P 23 e P 19 sono efficienti in questo sistema.È stato inoltre osservato che sia in presenza che in assenza di un soppressore della silenziamento, il livello di produzione della proteina HAC one ha iniziato a diminuire a sette DPI. Ciò indica che il momento del calo nella produzione transiente di proteine in Nicotiana benthamiana infiltrata con il vettore iniziale è specifico per l'obiettivo. Infine, la stabilità della banca cellulare di Agrobacterium viene valutata ogni anno infiltrando piante di Nicotiana benthamiana con lo stesso lotto della banca cellulare di Agrobacterium per valutare l'accumulo proteico.Questi risultati rappresentativi indicano che la produzione della proteina HA one è stata molto stabile per oltre tre anni. La produzione media di HAC one nelle piante di Nicotiana benam è di 651 più o meno 49,4 milligrammi per chilogrammo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come applicare la tecnica di agroinfiltrazione per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti, che possono essere utilizzate per la produzione di vaccini a subunità, anticorpi terapeutici e antigeni diagnostici.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di controllare l'incrocio vegetale in coltura idroponica, utilizzare batteri agro compatibili, regolare la pressione del vuoto e l'agitazione, e monitorare il vettore di espressione proteica. Una volta padroneggiata, la tecnica di filtrazione agro può essere completata in 24 ore se eseguita correttamente in condizioni controllate.

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