Ottimizzazione e utilizzo di Agrobacterium-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in Nicotiana

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare un metodo semplice, efficiente e scalabile per la produzione di proteine ricombinanti transitorie in un sistema a base vegetale utilizzando la tecnica dell'agroinfiltrazione. Ciò si ottiene ottimizzando prima le condizioni di crescita delle piante. Il secondo passo consiste nel trasformare l'agrobatterio con vettori di lancio che combinano componenti di virus vegetali e plasmidi binari, seguito dalla coltura dell'agrobatterio trasformato per l'uso negli esperimenti agricoli.

Durante l'infiltrazione dell'agrobatterio, le piante vengono capovolte e le parti aeree vengono immerse in una sospensione di agrobatterio. Viene quindi applicato un vuoto che provoca l'evacuazione dell'aria dagli spazi intercellulari nei tessuti fogliari. Attraverso la ripressurizzazione St Rapid dopo il rilascio del vuoto si ottiene l'infusione della sospensione di agrobatterio nelle foglie.

Infine, vengono utilizzati saggi di immunoblotting e fluorescenza per mostrare la produzione di proteine ricombinanti nelle piante infiltrate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'infiltrazione manuale, è che il metodo di infiltrazione sottovuoto può essere scalato per la produzione industriale di proteine ricombinanti, inclusi vaccini e proteine terapeutiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biotecnologia vegetale e facilitare ulteriormente l'uso delle piante come piattaforma alternativa per la produzione commerciale di proteine ricombinanti.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo scoperto che aumentare l'agrofiltrazione nelle piante che crescono in terra è impegnativo. Per diversi motivi, il terreno contiene uchin come virus, batteri, nematodi, e inoltre, il contenuto del suolo e l'acqua di irrigazione variano da lotto a lotto e da stagione a stagione, e il terreno uova nel tempo in stoccaggio. Inoltre, il capovolgimento delle piante che crescono nel terreno comporterebbe un gocciolamento indesiderato del terreno nella coltura dell'agrobatterio durante l'infiltrazione.

A dimostrare questa procedura saranno Rebecca Snow, assistente di ricerca senior presso il laboratorio di biologia vegetale e ingegneria, ed Emma Gut Robin Lobe. Lei, lei e Adam Trevor, che sono assistenti di ricerca del mio laboratorio. Questo studio utilizza un terreno di coltura idroponico e una soluzione nutritiva per garantire l'uniformità della crescita delle piante e per eliminare le complessità associate all'utilizzo del suolo per la coltivazione delle piante.

Per iniziare questa procedura, immergere le lastre di lana di roccia in una soluzione di fertilizzante per piante per cinque minuti, seminare manualmente i semi sulla superficie di lana di roccia imbevuta di sostanze nutritive. Utilizzando il cedro, in questo studio verranno valutate tre specie di Nico Oceana, due specie di tipo selvatico, Nico Oceana, Benham Ana e Nico Oceana Excelsior, e un ibrido di Benham, Ana ed Excelsior chiamato Nico Oceana. Excela coltiva le piante dai semi in condizioni controllate e un lungo periodo fotografico diurno in un sistema idroponico a cascata.

Nico Oceana, Bentham Miana e Nico Oceana Excela per quattro o cinque settimane e Nico Oceana Excelsior per cinque o sei settimane. I ceppi di Agrobacterium tumor Fasion utilizzati in questo esperimento sono stati trasformati con i vettori di lancio appropriati, come descritto nel manoscritto allegato. Ai fini di questa dimostrazione, vengono utilizzati cinque ceppi di agrobacterium trasformati.

GV 3 1 0 1, che trasporta una proteina fluorescente verde reporter, o gene GFP GV 3 1 0 1, che trasporta il gene virale del silenziatore del virus acrobatico cespuglioso del pomodoro P 19 e A quattro GV 3 1 0 1 e un T 10. Trasportando il gene di una proteina trasportatrice modificata liasi o leccare KM coltiva ceppi di agrobatterio durante la notte in terreno LB, integrato con 50 milligrammi per litro di micina lattina a 28 gradi Celsius con agitazione da 200 a 250 giri/min il giorno successivo. Preparare sospensioni di agrobacterium per gli esperimenti desiderati per esaminare la fattibilità dell'utilizzo di più ceppi di agrobacterium per la produzione di proteine transitorie, diluire un ceppo di laboratorio e due ceppi wild type, ospitando il vettore PBI a quattro km di leccamento in acqua milli Q a una densità ottica a 600 nanometri di 0,5.

Per studiare la necessità di indurre geni di virulenza dell'agrobatterio prima dell'infiltrazione, centrifugare in primo luogo colture di agrobatteri che trasportano il vettore P bid 4G FP coltivato in terreno LB a 4.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi risospendere in mezzo di induzione MMA a una densità ottica a 600 nanometri di 0,5 e agitare a temperatura ambiente per due ore per verificare se il cono di acetile migliora la produzione di proteine transitorie e la coltura di agrobatteri. Trasporta il vettore PBI 4G FP coltivato durante la notte in terreno LB e risospeso in tampone di infiltrazione contenente un sale X ms, 10 millimolare, MES e 2% di glucosio.

Dividere la sospensione cellulare in quattro contenitori. Aggiungere una diversa concentrazione di cono di aceto a ciascuna delle sospensioni di agrobacterium e incubare a temperatura ambiente per tre ore. Testare l'effetto della co-infiltrazione di un soppressore del silenziamento virale sulla miscela di produzione transitoria della proteina GFP.

Una coltura di agrobatterio diluita in acqua milli Q che trasporta il gene GFP e una coltura che trasporta il soppressore del silenziamento virale P 19 con un rapporto di quattro a uno Durante l'infiltrazione sottovuoto delle piante, che sarà dimostrata. Il prossimo è fondamentale per controllare la pressione del vuoto e la durata dell'infiltrazione per infiltrarsi sotto vuoto negli impianti. Per prima cosa, trasferire la sospensione di agrobatterio preparata in un contenitore all'interno della camera a vuoto.

Quindi capovolgere la pianta nell'agrobatterio diluito e applicare un vuoto da 50 a 400 millibar per 30 o 60 secondi. L'infiltrazione ottimale viene applicata di routine a una velocità compresa tra 50 e 100 millibar per 60 secondi. Una volta rotto il vuoto, rimuovi le piante dalla camera a vuoto, sciacquale in acqua e coltiva per cinque-sette giorni nelle stesse condizioni di crescita utilizzate per la crescita pre-filtrazione.

Per preparare i campioni per l'analisi occidentale, in primo luogo, raccogliere campioni casuali di foglie dalle piante di Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior o Nico Oceana Excela da quattro a sette giorni dopo l'infiltrazione o polverizzare i campioni di foglie in azoto liquido in una polvere fine. Aggiungere tre volumi di un tampone XPBS contenente lo 0,5% di Triton X 100 a ciascun campione e trasferire il campione in una provetta einor. Agitare o ruotare delicatamente i campioni estratti per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Centrifugare l'estratto per cinque minuti e raccogliere le proteine solubili totali in una provetta pulita. Diluire gli estratti a una diluizione appropriata in un tampone di estrazione XPBS e aggiungere cinque volte il tampone campione a una concentrazione finale di una X. Far bollire i campioni per cinque minuti prima di separare le proteine mediante la pagina SDS.

Dopo che le proteine sono state trasferite su una membrana di trasferimento P immobile e rilevare la GFP utilizzando l'antisiero policlonale anti GFP di coniglio a una diluizione da uno a 5.000 in soluzione bloccante. Incubare a temperatura ambiente per un'ora con un leggero dondolio dopo aver lavato le membrane tre volte con un X-P-B-S-T 20. Incubare con l'anticorpo anti-rabbioso coniugato perossidasi di rafano, aggiungere una diluizione da uno a 5.000 per un'ora per il rilevamento della GFP.

Successivamente, i western blot vengono processati e le intensità di banda corrispondenti alle proteine vengono analizzate come descritto nel manoscritto allegato. Il rilevamento visivo della fluorescenza GFP in intere piante trasformate transitoriamente viene effettuato utilizzando una lampada UV portatile a lunga lunghezza d'onda, utilizzando una fotocamera digitale e un tempo di esposizione di 15 secondi per fotografare piante trasformate transitoriamente attraverso un filtro giallo a otto ES 52. Ottieni immagini dalle analisi western blot utilizzando il software di acquisizione del gene su un genoma.

Quantificare i risultati utilizzando il software Gene Tool con una curva di calibrazione basata su uno standard GFP purificato, Nick Oceana Bentham Miana è stato coltivato su lastre Rockwell imbevute di fertilizzanti disponibili in commercio per determinare le condizioni ottimali per la crescita delle piante e l'accumulo di biomassa. La presenza di fosforo è fondamentale per ottenere la germinazione e la crescita di NICO Oceana. I semi di Bentham sono mostrati da queste piante di sei settimane che crescono in una soluzione fertilizzante contenente il 4,8% di fosforo o in una soluzione fertilizzante contenente lo 0% di fosforo.

Gli effetti della crescita di agrobatteri e dei mezzi di infiltrazione sulla salute delle piante e sulla produzione di proteine sono stati esaminati confrontando la produzione di GFP nella nicotiana. Piante di Hamana infiltrate sottovuoto con PBI 4G FP che ospitano colture di agrobatteri coltivate in tre diversi terreni. Le colture YEB AB e LB coltivate durante la notte in terreni YEB o LB sono state centrifugate a bassa velocità e risospese in terreno di induzione MMA o coltivate durante la notte in terreni YEB LB o AB e diluite direttamente da uno a cinque o da uno a 10 con acqua Milli Q come illustrato in questo risultato western blot, piante infiltrate con colture di agrobatteri coltivate in terreni YEB LB o AB e diluite con Milli Q.L'acqua non ha mostrato differenze significative nella produzione media di GFP da colture centrifugate e risospese in MMA.

Pertanto, l'acqua milli Q è raccomandata per diluire le colture di agrobatteri per l'infiltrazione delle piante ed è stata utilizzata di routine in esperimenti successivi per ottenere una densità ottica a 600 nanometri di 0,5. Successivamente, sono stati esaminati gli effetti della densità e dell'andamento temporale delle sospensioni cellulari di agrobacterium sull'espressione del bersaglio. Sono state valutate quattro diverse densità di sospensione cellulare di agrobacterium che trasportano PBI 4G FP e sono stati raccolti campioni di foglie a quattro, sette e 10 giorni dopo l'infiltrazione o DPI per l'analisi western blot a quattro DPI, ci sono state notevoli differenze nella fluorescenza GFP tra le piante infiltrate con diverse densità di sospensione cellulare di agrobacterium non è stata osservata alcuna espressione di GFP a un 600 di 0,05 a sette D-P-I-G-F-P.

La fluorescenza era simile nelle piante infiltrate in sospensione cellulare. Densità di un 601,0 0,5 e 0,1, ma è stato inferiore impianti infiltrati a un A 600 di 0,05 in contrasto a 10 DPI. Non sono state osservate differenze nella produzione di GFP tra le piante infiltrate con una delle quattro densità di sospensione cellulare per aumentare la diversità dei ceppi di agrobatteri disponibili per la produzione di proteine transitorie.

Le piante di Nicotiana Benham miana sono state infiltrate sottovuoto con sette diversi ceppi di agrobatteri che ospitano il vettore KBI a quattro km di distanza. Le foglie infiltrate sono state raccolte a sette DPI e il livello di espressione della chinasi è stato stimato mediante Western blot. Come mostrato in questo grafico, il livello più alto di produzione di liasi è stato raggiunto con i ceppi GV 3 1 10, 1 A four e LBA 4 4 0 4 con lievi differenze.

Mentre il livello più basso di espressione è stato con C cinque otto C, una produzione intermedia di liasi è stata raggiunta con ceppi a T 77, A T zero sei e T 10 l'attività enzimatica della liasi è stata dimostrata utilizzando un saggio XMO Graham. La proteina batterica liasi purificata è stata utilizzata come controllo positivo per l'attività enzimatica. È interessante notare che le piante di nicotiana Benham miana infiltrate con i ceppi di agrobatterio di tipo selvatico A quattro e T sette sette hanno mostrato sintomi patologici come arresto della crescita, allungamento e arricciamento degli animali domestici e arricciamento delle foglie a sette DPI.

I sintomi erano lievi nelle piante di nicotiana benham infiltrate con il tipo selvatico al ceppo T 10. Non sono stati osservati sintomi nelle piante di Nico Oceana Benham infiltrate con il ceppo di laboratorio GV 3 1 0 1. Un confronto della produzione di biomassa vegetale nelle specie selvatiche ha rivelato che, a parità di condizioni di crescita, la più alta biomassa fogliare che può essere generata da Nico Oceana Excela è circa il doppio rispetto a Nico Oceana.

La produzione di proteine Benham è stata esaminata in Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior e Nico Oceana Excela infiltrati con il ceppo agrobatterico. GV 3 1 0 1 che ospita l'accumulo di PBI 4G F-P-G-F-P è stato valutato a sette DPI in foglie intere infiltrate. L'esame visivo dell'espressione di GFP alla luce UV ha mostrato una distribuzione uniforme della GFP in Nico Oceana Hamana e Nico Oceana Excela e una distribuzione irregolare in Nico Oceana Excelsior a causa della difficoltà di infiltrarsi in un'intera area fogliare di Nico Oceana Excelsior L'analisi Western blot dell'accumulo di GFP in queste foglie infiltrate a sette DPI ha mostrato che il livello di GFP era più alto in Nico Oceana Hamana che in Nico Oceana Excela e Nico Oceana Excelsior il basso livello di produzione proteica in Nico Oceana.

Excelsior è dovuto a un'infiltrazione irregolare e a una distribuzione irregolare della GFP accumulata nella foglia raccolta. Per testare l'effetto della pressione del vuoto sulle foglie, le piante di Nico Oceana Benham sono state infiltrate con il ceppo di agrobatterio, GV 3 1 0 1 che ospita PBI 4G FP a pressioni di vuoto di 400, 200, 100 o 50 millibar con un tempo di mantenimento del vuoto di 30 o 60 secondi. Non sono state osservate differenze nella produzione di GFP e un impatto lieve o nullo sulla salute delle piante quando sono state applicate pressioni di vuoto di 5, 100 e 200 millibar per 30 o 60 secondi.

L'effetto della durata del vuoto sull'espressione del bersaglio è stato valutato infiltrando un appartamento di piante di Nico Oceana Benham ogni ora con un A 600 di 0,5 di GV 3 1 0 1 che ospita PBI 4G FP per otto ore. Nella stessa coltura di agrobatterio, come mostrato in questo risultato rappresentativo, il livello di produzione di GFP è stato sempre simile, puntando fino a otto ore, suggerendo che in questo periodo di tempo l'agrobatterio mantiene la sua capacità di rilasciare un singolo filamento di DNA. Poiché è stato riportato che molte sostanze chimiche e monosaccaridi migliorano la produzione di proteine transitorie in varie specie vegetali.

Questo studio ha anche valutato l'effetto di diverse concentrazioni di aceto, crinone e glucosio. Sulla produzione transitoria della proteina GFP in Nico Oceana Benham, Ana si è infiltrata con il ceppo di agrobatterio, GV 3 1 0 1 che ospita PBI 4G FP. L'agrobatterio è stato coltivato per una notte in terreno YEB, centrifugato e risospeso a un a 600 di 0,5 sia in MMA contenente il 2% di glucosio con acetil serone alle concentrazioni indicate che in MMA contenente 200 micromolari di acetofenone con glucosio alle concentrazioni indicate. Come mostrato qui, nessuna delle concentrazioni testate di questi composti ha indotto un aumento significativo della produzione di proteina GFP rispetto al controllo in cui i mezzi di induzione non contenevano acetofenone o glucosio.

Successivamente, l'effetto della co-infiltrazione di un soppressore di silenziamento sull'espressione transitoria dei geni GFP e HAC one in Nico Oceana. Le foglie di Benham sono state esaminate prima dell'infiltrazione dell'agrobatterio GV tre uno dieci uno colture contenenti PBI 4G FP e il soppressore di silenziamento virale P 19 del virus dell'acrobazia cespugliosa del pomodoro sono stati rispettivamente miscelati in rapporti di uno a uno, due a uno, tre a uno e quattro a uno. Come indicato dai risultati dell'analisi Western blot a sette DPI, la presenza di P 19 non ha aumentato o diminuito la produzione di GFP nella nicotiana Benham Miana a qualsiasi rapporto di due delle sospensioni di agrobatterio.

Inoltre, è stato studiato l'effetto di due soppressori del silenziamento genico virale P 23 e P 19 sulla prevenzione del silenziamento genico post-trascrizionale per HAC 1. POS di agrobacterium che trasporta il vettore di lancio PBI, quattro HAC, uno e uno dei due plasmidi soppressori a silenziamento virale sono stati miscelati rispettivamente in un rapporto di quattro a uno e co-infiltrati in Nicotiana Bentham Miana. I campioni di foglie infiltrate sono stati raccolti da tre a otto DPI.

Questo grafico mostra i livelli medi di HAC un'espressione da tre esperimenti, come determinato dall'analisi Western blot. L'infiltrazione di Nico Oceana Benham con P 23 o P 19 ha comportato un aumento della produzione di HAC 1 rispetto all'utilizzo di nessun silenziatore a 60 pi. Ciò suggerisce che P 23 e P 19 sono efficienti in questo sistema.

È stato anche osservato che sia in presenza che in assenza di un soppressore di silenziamento, il livello di produzione della proteina HAC one ha iniziato a diminuire a sette DPI. Ciò indica che la tempistica del declino della produzione di proteine transitorie in Nico Oceana Benham Miana infiltrata con il vettore di lancio è specifica per il bersaglio. Infine, la stabilità della banca cellulare di Agrobacterium viene valutata ogni anno infiltrando piante di nicotiana benham con lo stesso lotto della banca di cellule Agrobacterium per valutare l'accumulo di proteine.

Questi risultati rappresentativi indicano che la produzione di proteina HA one è rimasta molto stabile per più di tre anni. La produzione media di HAC 1 nelle piante di Nicotiana benam è di 651 più o meno 49,4 milligrammi per chilogrammo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare la tecnica di agroinfiltrazione per la produzione di proteine ricombinanti su larga scala, che possono essere utilizzate per la produzione di vaccini a subunità, anticorpi proteici teorici e antigeni diagnostici.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di controllare l'incrocio della pianta in modo idroponico, utilizzare agrobatteri vitali, controllare la pressione e l'azione del vuoto e monitorare il veicolo di espressione proteica. Una volta padroneggiata, la tecnica di agrofiltrazione può essere eseguita in 24 ore se eseguita correttamente in condizioni controllate.