Name: Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ricombinanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Impara l'agroinfiltrazione per l'espressione transitoria di proteine ricombinanti in piante di tabacco. Questo metodo scalabile utilizza Agrobacterium tumefaciens per ottenere livelli elevati di produzione proteica farmaceutica.

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Ringraziamo R. Sun e altri studenti del Laboratorio di Chen per il loro contributo alla centrale di generazione di materiale. Ringraziamo anche il Dott. D. Green per il suo sostegno alla ricerca di laurea presso la Facolta &#39;di tecnologia e l&#39;innovazione (CTI). Questa ricerca è stata sostenuta in parte da sovvenzioni NIH U01 AI075549 e 1R21AI101329 al D. Chen, e una borsa di SSE da CTI della Arizona State University di Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, e J. Stahnke sono studenti universitari finanziati dalla sovvenzione SSE.

1. Crescita delle piante <ol><li> Luogo 60 torba pellet in un vassoio di propagazione. Aggiungere 4 L di acqua di rubinetto e lasciare che la torba pellet assorbire l&#39;acqua per 2 ore. </li><li> Aggiungere 2 N. benthamiana semi in ogni torba pellet utilizzando una seminatrice, coprire il vassoio con una cupola di plastica trasparente, e permettere loro di germinare in ° C, umidità ambiente 25 84% con un hr ciclo giorno / notte 16/8 (Figura 1A). </li><li> Rimuovere la cupola due settimane dopo la semina, drenare l&#39;acqua dal vassoio, e aggiungere 2 litri di fertilizzante di Jack ad una concentrazione di 1,48 g / L (Figura 1B). Continuare a crescere piante in ° C, umidità ambiente 25 50% con un hr giorno / ciclo notte 16/8. Fornitura 2 L di concime di Jack ogni 2 giorni per ogni vassoio. </li><li> Alla settimana 4, trasferire le piante con palline di torba a un nuovo vassoio che ospita sei impianti di fornire uno spazio adeguato per l&#39;ulteriore crescita (Figura 1C) fino a quando non sono pronti per essere infiltrato a 6 settimane di età (Figura1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Cultura Preparazione 2.1 Preparazione per Siringa Infiltration <ol><li> Streak A. tumefaciens GV3101 ceppi contenenti i vettori geminiviral p19, pREP110, pBYGFP e pBYDsRed su piastre di LB agar contenenti kanamicina (100 pg / ml). Striatura un ceppo per piastra e crescere a 30 ° C per 48 ore. </li><li> Allo stesso modo, striscia e crescere GV3101 ceppi ospitano i vettori MagnICON del 5 &#39;modulo (pICH15879), al 3&#39; del modulo contenente il gene bersaglio di GFP o DsRed (Pich-GFP o Pich-DsRed) e dell&#39;integrasi (pCH14011) su LB Agar piastre contenenti carbenicillina (100 pg / ml). </li><li> Da una singola colonia sulla piastra di agar LB, inoculare GV3101 albergano ceppi vettori geminiviral in 3 ml di YENB supporti (0,75% estratto di lievito Bacto, 0,8% Nutrient Broth, aggiustare il pH a 7,5 con NaOH) + kanamicina (100 pg / ml) in una provetta di coltura ml a fondo rotondo 15, crescere la coltura liquida a 30 ° C inun agitatore notte con una velocità di rotazione 300 rpm. </li><li> Allo stesso modo, inoculare e crescere GV3101 ceppi ospitano vettori MagnICON in YENB supporti + carbenicillina (100 mcg / ml) in un agitatore notte a 30 ° C. </li><li> Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida con uno spettrofotometro e utilizzare la formula seguente per calcolare il volume necessario (V sub) possibile replicare per una nuova cultura con un diametro esterno di partenza 600 di 0.025 in 10 ml di mezzi YENB con antibiotici appropriati . V inf (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Trasferimento V inf (ml) della coltura overnight a (10 - V sub) ml di mezzo YENB con antibiotici appropriati per ogni ceppo. Crescere la nuova cultura notte a 30 ° C in un agitatore con un tasso di rotazione 250 rpm finché il valore di OD 600 è nell&#39;intervallo 1.7-2.0. </li><li> Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida e utilizzare la formula seguente per calcUlate il volume necessario (V inf) diluiti in 50 ml di tampone di infiltrazione che invia un diametro finale 600 di 0,12 per ogni ceppo. V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Trasferimento V inf (ml) di ogni cultura in una provetta e centrifugare le cellule per centrifugazione a 12.000 xg per 2 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di tampone di infiltrazione (10 mM MES, pH 5.5, 10 mM MgSO 4) nel vortex brevemente. </li><li> Mescolare risospeso cellule pBYGFP + pREP110 + p19, girare le celle in basso a 12.000 xg per 2 minuti, e risospendere in totale di 50 ml di tampone di infiltrazione. Questa combinazione Agrobacteria è per geminiviral espressione di GFP. </li><li> Allo stesso modo, mescolare le seguenti combinazioni di cellule Agrobacteria, centrifugare e risospendere in 50 ml di tampone di infiltrazione. Essi includono (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 per l&#39;espressione geminiviral di DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110+ P19 per geminiviral co-espressione di GFP e DsRed, (3) pREp110 + p19 come controllo negativo di espressione geminiviral, (4) Pich-GFP + pICH15879 + pCH14011 per MagnICON espressione di GFP, (5) Pich-DsRed pICH15879 + + pCH14011 per l&#39;espressione di MagnICON DsRed, e (6) pICH15879 + pCH14011 come controllo negativo per l&#39;espressione MagnICON. </li></ol> 2.2 Preparazione per l&#39;infiltrazione di vuoto <ol><li> Seminare e cultura ogni ceppo GV3101 contenente vettori geminiviral o vettori MagnICON in 15 ml di mezzi YENB con antibiotici appropriati in un pallone autoclavato 50 ml e crescere durante la notte come descritto per la siringa infiltrazione sopra. </li><li> Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida con uno spettrofotometro e utilizzare la formula seguente per calcolare il volume necessario (V sub) possibile replicare per una nuova cultura con un diametro esterno di partenza 600 di 0.025 in 250 ml di mezzi YENB con antibiotici appropriati . V sub </sub&gt; (Ml) = (250 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Trasferimento V inf (ml) della coltura overnight a (250 - V sub) ml di mezzo YENB in un pallone da 1 L autoclavato con antibiotici appropriati per ogni ceppo e crescere la nuova coltura durante la notte come descritto sopra per siringa infiltrazione. </li><li> Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida e utilizzare la formula seguente per calcolare il volume necessario (V inf) da diluire in 3 L di tampone infiltrazione di dare un OD finale 600 di 0,12 per ogni ceppo. V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Pellet e risospendere V inf (ml) di ciascuna cultura in tampone infiltrazione come descritto per siringa infiltrazione e mescolare le culture risospeso secondo le combinazioni descritte per siringa infiltrazione. Repellet le cellule Agrobacteria misti e li Risospendere in 3 L di tampone infiltrazione. </li></ol> 3.1 Siringa Infiltrazione <ol><li> Scegliere quattro di 6 settimane vecchio N. piante benthamiana con 5 foglie ciascuno. Le prime tre foglie contando dall&#39;alto di ogni pianta saranno infiltrate interamente con una delle combinazioni di A. tumefaciens tensioni nei buffer di infiltrazione. La quarta foglia sarà posto-infiltrati con tutte le combinazioni di deformazione quattro per l&#39;espressione geminiviral o tutte e tre le combinazioni per l&#39;espressione MagnICON. L&#39;ultima foglia su ogni impianto verrà infiltrata con combinazioni di controlli negativi. </li><li> Creare un piccolo nick con un ago nell&#39;epidermide sul lato posteriore del foglio (Figura 2A). Attenzione: assicurarsi di non graffiare così difficile da perforare il foglio attraverso entrambi i lati, come le cellule agrobatteri nella miscela infiltrazione passeranno attraverso la puntura per l&#39;altro lato della foglia. </li><li> Prendere una stretta costante del lato anteriore della foglia e durante l&#39;applicazione delicatacontropressione al nick con il pollice di una mano, iniettare miscele Agrobacterium in tampone infiltrazione nel nick con una siringa senza ago (Figura 2B). Nota: Poiché la miscela Agrobacterium entra nello spazio intercellulare della foglia, la zona infiltrata diventa verde visibilmente più scuro (Figura 2C). </li><li> Continuare a iniettare miscele Agrobacterium nel nick fino a quando il cerchio verde scuro smette di espandersi. Creare un altro nick e ripetere i punti 3.1.2-3.1.4 finché l&#39;intera foglia è infiltrata e tutta la foglia diventa verde scuro per le prime tre foglie e l&#39;ultima foglia. </li><li> Per la quarta foglia di ogni pianta, ogni quattro (vettore geminiviral) o tre (MagnICON vettore) combinazioni saranno infiltrati in esso. Fai un nick per ogni combinazione di ceppi di Agrobacterium, e infiltrarsi ogni nick con una combinazione. </li><li> Dopo l&#39;infiltrazione, muovere le piante di nuovo alla stanza crescita e Moniespressione della proteina tor tra 2-15 giorni dopo l&#39;infiltrazione (dpi). </li></ol> 3.2 Vacuum Infiltrazione <ol><li> Mettere una vasca in un essiccatore a vuoto e il trasferimento 3 L tampone infiltrazione contenente i ceppi di Agrobacterium alla vasca. Collegare l&#39;essiccatore ad una pompa a vuoto a membrana Vacuubrand (Figura 3A). </li><li> Posizionare una pianta capovolta sulla piastra essiccatore (Figura 3B) e abbassare la piastra con la pianta finché l&#39;intera foglia e sistema di gambo è sommersa nel buffer infiltrazione con la piastra di riposo in cima della vasca. Posizionare l&#39;anello O essiccatore lungo il bordo e mettere il coperchio sulla camera di essiccatore (Figura 3C). </li><li> Accendere la pompa del vuoto e avviare il cronometro quando il vuoto raggiunge 100 mbar. Aprire lentamente la valvola di rilascio sul essiccatore dopo 1 min a 100 mbar per consentire l&#39;ingresso di Agrobacteria negli spazi interstiziali del tessuto vegetale sommersa. Ripetere questo passo si additionale tempo per assicurare una buona infiltrazione. </li><li> Dopo l&#39;infiltrazione, prendere la pianta di un essiccatore e rimetterlo in posizione verticale. Spostare le piante di nuovo alla stanza crescita e l&#39;espressione della proteina del monitor tra 2-15 dpi. </li></ol> 4. Fluorescent Protein Detection e Fotografia <ol><li> Partendo da 2 dpi, piante spostare nella stanza buia e brillare luce UV sul lato posteriore delle foglie infiltrate con una lampada UV portatile. </li><li> Osservare la fluorescenza verde della GFP o la fluorescenza rossa di DsRed. GFP emette un segnale forte con luce UV a onda lunga, mentre DsRed è più forte sotto raggi UV a onde corte. </li><li> Scattare fotografie di foglie fluorescenti con una normale fotocamera digitale, senza il flash. </li><li> Spostare le piante di nuovo alla stanza crescita dopo l&#39;osservazione o la fotografia. </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione.

La crescente domanda di prodotti farmaceutici a base di proteine ​​a livello mondiale richiedono nuove piattaforme di produzione che sono robusti, scalabili, a basso costo e sicuro. Piante hanno dimostrato di essere uno dei sistemi di produzione alternativi più promettenti per la produzione di proteine ​​farmaceutiche. Negli ultimi anni, lo sviluppo di vettori basati sul virus destrutturati ha consentito espressione transiente di proteine ​​nelle piante, che migliora notevolmente la velocità e la resa dei sistemi di esp...

Dal 1970, le piante sono state esplorate come alternative alle colture cellulari di mammifero, insetto, e batteriche per la produzione commerciale di proteine ​​ricombinanti e proteine ​​terapeutiche 1. Sistemi a base vegetale per l&#39;espressione di biofarmaci hanno mostrato risultati promettenti negli ultimi anni come molti nuovi trattamenti per le malattie, come il morbo di Gaucher 2, e l&#39;influenza aviaria H5N1 3, hanno dimostrato il successo negli studi clinici. Lo sviluppo di meccanismi competenti per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti nelle piante nei decenni successivi gli esperimenti iniziali ha creato il potenziale per i sistemi a base di piante per alterare l&#39;attuale paradigma di produzione di proteine ​​per tre motivi principali. In primo luogo, vi è una notevole diminuzione dei costi come bioreattori mammiferi, insetti e batteri richiedono notevoli costi di avvio, i media di crescita costosi e complicati processi di depurazione a valle 4. La creazione di pianta transgenica stabilelinee permette loro anche di surclassare la scalabilità di altri sistemi di espressione di proteine ​​come le piante che esprimono possono essere coltivate e raccolte su scala agricola 5. In secondo luogo, sistemi di espressione a base vegetale riducono significativamente il rischio di trasmissione di un patogeno umano o animale dall&#39;host proteina-esprimendo agli esseri umani, dimostrando superiorità nella pubblica sicurezza 6. Infine, impianti utilizza un sistema eucariotico endomembrane che è simile alle cellule di mammifero, permettendo una corretta modificazione post-traduzionale di proteine ​​compreso glicosilazione e l&#39;assemblaggio delle proteine ​​multiple-subunità 7. Questa capacità pone sistemi a base vegetale avanti di quelli basati su sistemi procariotici, come batteri, poiché un numero più ampio di proteine ​​ricombinanti farmaceutiche, inclusi anticorpi monoclonali (mAb), hanno una struttura più complessa e richiedono ampie modifiche post-traduzionali o da montaggio 8. Ci sono due principali approdolori ad esprimere proteine ​​ricombinanti nelle piante. Il primo è lo sviluppo di una linea transgenica stabilmente, in cui il DNA codificante per la proteina bersaglio viene clonato in una cassetta di espressione e introdotto sia ad genomi nucleari o cloroplasto. Così facendo, il DNA estraneo diventa ereditabile attraverso successive generazioni e consente enormemente migliorata scalabilità, ben oltre quella di altri sistemi di espressione 1. Introduzione di DNA esogeno al genoma nucleare è di solito realizzato da Agrobacterium tumefaciens infezione del tessuto vegetale o, meno spesso, da microproiettili bombardamento del tessuto 9. Ormoni vegetali sono poi utilizzati per indurre il differenziamento e la crescita di tessuto vegetale transgenica come radici e foglie. Trasformazione del genoma del cloroplasto non può essere raggiunto con A. tumefaciens, ma si basa interamente su particelle di oro o di tungsteno rivestite di DNA sparato balisticamente nelle cellule vegetali. Il secondo metodo di esprimere ricombinazionent proteina nelle piante è attraverso l&#39;espressione transiente 10. In questo scenario, vettori derivati ​​da virus ospitano il gene di interesse sono consegnati via A. tumefaciens di piante completamente sviluppate attraverso un processo chiamato agroinfiltration. Invece di integrare nel genoma della pianta, il costrutto genico espresso inizierà a dirigere la produzione transiente della proteina desiderata, che può essere raccolto e isolato dopo un breve periodo di incubazione. Espressione genica transiente offre il vantaggio di una maggiore accumulo di proteine ​​generale così come un tempo maggiore di produzione di proteine, come piante saranno pronte raccogliere circa 1-2 settimane dopo agroinfiltration 11. Questo è significativamente più veloce rispetto ai processi di generazione, la selezione e la conferma delle linee di piante transgeniche stabili, che può richiedere diversi mesi a un anno. Questo però, è anche la limitazione del sistema di espressione transiente, in quanto non produrrà geneticamente stabile pianta lines che possono essere utilizzati per generare una banca di seme per la produzione commerciale su larga scala. Nonostante questo, sono stati sviluppati approcci per migliorare larga scala espressione transiente. Qui mostriamo un metodo di generazione di proteine ​​che esprimono piante di Nicotiana benthamiana transitori utilizzando vettori virali decostruiti consegnati da A. tumefaciens. Due metodi principali sono in sviluppo per la fornitura di A. tumefaciens in tessuto vegetale: panchina scala infiltrazione tramite siringa e infiltrazione larga scala tramite camera a vuoto. Entrambi i protocolli sono descritti usando N. benthamiana, che è strettamente legato alla pianta del tabacco comune, come la pianta ospite per l&#39;espressione transiente di due proteine ​​fluorescenti: la proteina fluorescente verde (GFP) dalle meduse Aequorea victoria e la proteina fluorescente rossa da Discosoma corallo (DsRed) 12,13. N. benthamiana è la pianta ospite più comune per laproteina ricombinante perché è suscettibile di trasformazione genetica, può produrre elevate quantità di biomassa rapidamente, ed è un produttore di seme prolifico per la produzione su scala industriale 14. Un altro vantaggio di usare N. benthamiana come ospiti per l&#39;espressione proteica è la disponibilità di una varietà di vettori di espressione 2,5. In questo studio, i due vettori virali decostruiti, uno basato su un virus del mosaico del tabacco (TMV) RNA sistema replicone (vettori MagnICON) e l&#39;altro derivato dal virus del nanismo giallo fagiolo (BeYDV) sistema replicone DNA (vettori geminiviral) 4,11, 15-18, sono utilizzati per trasportare il gene GFP e DsRed e consegnarli in N. cellule benthamiana via A. tumefaciens. tre costrutti di DNA saranno utilizzati per la GFP o espressione DsRed con vettori MagnICON. Essi comprendono &#39;modulo (pICH15879) contenente il promotore ed altri elementi genetici per guidare l&#39;espressione del gene bersaglio, il 3&#39; del modulo 5 contenente il gene di interesse (Pich-GFP o PICH-DsRed), e il modulo integrasi (pICH14011) codifica per un enzima che integra il 5 &#39;e 3&#39; insieme moduli sull&#39;espressione 8,15. Sono necessari anche tre costrutti di DNA per l&#39;espressione con vettori geminiviral. Oltre a vettori contenenti il replicone del gene target (pBYGFP o pBYDsRed), è richiesto un vettore codificante per la proteina di replica (pREP110) per l&#39;amplificazione del target replicone 11,14,16. Inoltre, l&#39;inserimento di un vettore codificante il tacere soppressore p19 del virus del rachitismo cespuglioso pomodoro è desiderato per il livello di espressione del gene target alto 11,16. Ci sono generalmente tre fasi principali per l&#39;introduzione di geni di proteine ​​ricombinanti in cellule vegetali per agroinfiltration compresi crescita delle piante, A. tumefaciens cultura preparazione, e infiltrazione. Come ogni passaggio è fondamentale per il successo finale di questa procedura, quindi, una descrizione dettagliata per ognuno è fornitosia per infiltrazione siringa e vuoto infiltrazione sotto.

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>GFP </td><td>Invitrogen</td><td>V353-20</td><td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> Vedi riferimento: Lico and Chen, et al 2008</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Clontech</td><td>632152</td><td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> Vedi riferimento: Baird and Zacharias, et al 2000</td></tr><tr><td>MagnICON Vector</td><td>Icon Genetics</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> Vedi riferimento: giritch and Marillonnet, et al 2006</td></tr><tr><td>Geminiviral</td><td>Vector Author' s Lab</td><td>n/a</td><td>Vedi riferimento: Chen and He, et al 2011</td></tr><tr><td>N. benthamiana</td><td>Author' s Lab</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens ceppo gv3101</td><td>Autore' s Lab</td><td>n/a</td><td>Vedi riferimento: Lai e Chen 2012</td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin-100, piastre</td><td>Sigma</td><td>L0418</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>LB Agar Kanamycin-50, piastre</td><td>Sigma</td><td>L0543</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio epa idrato</td><td>Sigma</td><td>M2773-500 g</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Bacto-Tryptone</td><td>Fisher</td><td>73049-73-7</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 212750</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>Difco Brodo nutriente</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 234000</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>MES idrato Tampone</td><td>Sigma</td><td>M8250-1kg</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Sigma</td><td>C1613-1ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>70560-51-9</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Jack' s Fertilizzante</td><td>Hummert International</td><td>Jul-25</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vacuubrand MD4 Vacuum Pump</td><td>Fisher</td><td>13-878-113</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Vacuum Air Valvola di regolazione</td><td>Fisher</td><td>NC9386590</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Essiccatore 12 1/8" con O-ring</td><td>Fisher</td><td>08-594-15C</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr>3 <tr><td>L Vasca</td><td>Rubber-Maid</td><td>n/a</td><td>Rubbermaid Servn' Ciotola salvatore, 10 tazze funzioneranno</td></tr><tr><td>piatto/ripiano 230ML</td><td>Fisher</td><td>NC9489269</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Peat Pellet</td><td>Hummert International</td><td>14-2370-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>Vassoio di propagazione</td><td>Dome hydrofarm</td><td>132052</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Propagaiton Tray</td><td>hydrofarm</td><td>138758</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Virbo Hand Seeder</td><td>Gro-Mor INC</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank" >www.gro-morent.com</a></td></tr><tr><td>Flora Cart 4 ripiani</td><td>Hummert International</td><td>65-6924-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>15 ml Provette per Coltura a Fondo Tondo</td><td>Sigma</td><td>CLS430172-500EA</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9950</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0602EDU</td><<td>a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Incubatore/Agitatore</td><td>Eppendorf</td><td>Excella E25</td><td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank"> www.eppendorf.com</a></td></tr><tr><td>Modello di luce ultravioletta#: UVGL-25</td><td>UVP</td><td>95-0021-12</td><td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td></tr></tbody></table>

agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Colture cellulari di mammifero è la più importante piattaforma per la produzione commerciale di vaccini umani e delle proteine ​​terapeutiche. Tuttavia, non può soddisfare la crescente domanda mondiale di prodotti farmaceutici grazie alla sua scalabilità limitata e costo elevato. Le piante hanno dimostrato di essere una delle più promettenti alternative piattaforme di produzione farmaceutica che sono robuste, scalabili, a basso costo e sicuro. Il recente sviluppo di vettori basati sul virus ha permesso rapida e di alto livello di espressione transiente di proteine ​​ricombinanti in piante. Per ottimizzare ulteriormente l&#39;utilità del sistema di espressione transiente, dimostriamo una metodologia semplice, efficiente e scalabile per introdurre target-gene contenente Agrobacterium in tessuto vegetale in questo studio. I nostri risultati indicano che agroinfiltration sia con siringa e vuoto metodi hanno portato alla introduzione efficiente di Agrobacterium in foglie e produzione robusta di due proteine ​​fluorescenti, GFP e DsRed. Inoltre,dimostriamo i vantaggi unici offerti da entrambi i metodi. Siringa infiltrazione è semplice e non richiede attrezzature costose. Esso permette anche la flessibilità di entrambi infiltrare l&#39;intero congedo con un gene bersaglio, o per introdurre geni di bersagli multipli su un unico foglio. Quindi, può essere utilizzato per l&#39;espressione scala di laboratorio di proteine ​​ricombinanti e per confrontare diverse proteine ​​o vettori di espressione yield o cinetica. La semplicità della siringa infiltrazione suggerisce anche la sua utilità nella scuola superiore e l&#39;istruzione universitaria per il soggetto delle biotecnologie. Al contrario, l&#39;infiltrazione di vuoto è più robusto e può essere scalata-up per la produzione commerciale di proteine ​​farmaceutiche. Esso offre anche il vantaggio di poter agroinfiltrate specie vegetali che non sono suscettibili di infiltrazione siringa come lattuga e Arabidopsis. Nel complesso, la combinazione di siringa e agroinfiltration vuoto fornisce ai ricercatori ed educatori un semplice, efficiente e robustometodologia per l&#39;espressione proteica transiente. Esso agevolerà notevolmente lo sviluppo di proteine ​​farmaceutiche e promuovere l&#39;educazione scientifica.

1. Espressione di proteine ​​fluorescenti con Siringa Infiltration Per dimostrare l&#39;efficacia della siringa infiltrazione di Agrobacterium in tessuto vegetale, abbiamo testato l&#39;espressione di due proteine ​​fluorescenti - GFP e DsRed - da due diverse piante vettori virali decostruiti - geminiviral e MagnICON - in N. benthamiana. Per N. foglie benthamiana che sono stati interamente infiltrato con Agrobacteria vettori geminiviral contenenti, l...

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene contenente<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; In impianti per la proteina espressione transitoria.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Questo sistema sperimentale utilizza l'infiltrazione agro per consegnare efficacemente costrutti genici alle foglie al fine di produrre elevate quantità di proteine ricombinanti. Innanzitutto, coltivare piante di Hamana end in un ambiente controllato per sei settimane, tre giorni prima dell'infiltrazione. Preparare le colture di agrobatteri contenenti il gene bersaglio da esprimere nelle piante il giorno dell'infiltrazione.Introdurre le colture di agrobatterio nel tessuto vegetale mediante infiltrazione con siringa o sotto vuoto. Risultati come l'intensità della fluorescenza verde della GFP in foglie di tabacco sotto luce UV dimostrano un'espressione robusta di proteine ricombinanti nelle piante, paragonabile a quella dei sistemi di espressione attuali basati su mammiferi, batteri e insetti. L'infiltrazione agro è un metodo efficace per introdurre geni trasgenici nelle cellule vegetali, che porta a un'espressione elevata di proteine ricombinanti.È possibile utilizzarlo per un'ampia gamma di specie vegetali. È particolarmente importante il fatto che possa essere ampliato per la produzione commerciale di proteine farmaceutiche. Questo metodo può quindi fornire informazioni sui parametri cinetici e sull'espressione della GFP ed essere applicato ad altre proteine, come vaccini a subunità, anticorpi monoclonali ricombinanti, e può essere impiegato nei trattamenti contro il cancro e le malattie infettive.Un esperimento di successo richiede condizioni ottimali sia per la coltura batterica che per il materiale vegetale. Questo processo di infiltrazione è più facile da replicare dopo una dimostrazione visiva. Iniziare posizionando fino a 60 tavolette di torba in un vassoio di propagazione.Aggiungere quattro litri di acqua di rubinetto e lasciare che i dischetti di torba assorbano l'acqua per due ore. Ora, aggiungere due semi hamana in ogni disco di torba e coprire il vassoio con una cupola di plastica trasparente per la germinazione. Posizionare i semi in un ambiente a 25 gradi Celsius e umidità al 84%.Dopo due settimane dal trapianto, rimuovere la cupola e trasferire le piante in un nuovo vassoio. Quindi aggiungere due litri di fertilizzante Jack's a 1,48 grammi per litro. Continuare la coltivazione delle piante a 25 gradi Celsius.Ambiente con umidità al 50%, cambiato ogni due giorni. Fornire due litri di fertilizzante Jack's per ogni vassoio. Alla quarta settimana, trasferire le piante con pellet di torba in un nuovo vassoio che ospita sei piante per una crescita ulteriore fino all'età di sei settimane.Scegliere quattro piante di hamama di sei settimane con cinque-sei foglie ciascuna: tre foglie per l'infiltrazione completa con i ceppi agrobatterici contenenti i geni di interesse, una foglia per il controllo negativo e una foglia per l'infiltrazione a macchia. Creare una piccola incisione con un ago nell'epidermide della parte inferiore della foglia, avendo cura di non perforare la foglia su entrambi i lati.Afferrare saldamente il lato anteriore della prima foglia esercitando una leggera pressione contraria sul collo. Con il pollice di una mano, iniettare le miscele di agrobatteri in tampone di infiltrazione nel collo mediante siringa e ago.Continuare a iniettare le miscele di agrobatteri nella fessura finché il cerchio verde scuro non smette di espandersi. Creare quindi un'altra fessura e ripetere le iniezioni fino a quando l'intera foglia non è stata infiltrata e l'intera foglia diventa verde scuro. Completare l'infiltrazione delle prime tre foglie e dell'ultima foglia, utilizzata come quarta foglia di ogni pianta, con combinazioni di vettori costituite da tutti e quattro i vettori virali Gemini oppure da tre vettori magcon.Inoltre, effettuare un'incisione per ogni combinazione di ceppi di agrobatterio e infiltrare ciascuna incisione con una singola combinazione. Dopo l'infiltrazione, riportare le piante nella stanza di crescita e monitorare l'espressione della proteina tra due e quindici giorni. Dopo l'infiltrazione, posizionare un contenitore in un essiccatore sotto vuoto e trasferirvi tre litri di buffer di infiltrazione contenente i ceppi di agrobatterio.Quindi collegare il desiccante a una pompa a vuoto con diaframma. Posizionare ora una pianta capovolta sulla piastra del desiccante e abbassare la piastra con la pianta fino a quando l'intero sistema fogliare e caulicolare sia immerso nel buffer di infiltrazione, con la piastra appoggiata sulla sommità del contenitore. Successivamente, posizionare l'anello O del desiccante lungo il bordo.Dopo aver posizionato il coperchio del desiccante sulla camera, accendere la pompa a vuoto e iniziare a cronometrare quando il vuoto raggiunge 100 millibar. Dopo aver spento la pompa a vuoto, aprire lentamente la valvola di sfiato del desiccante dopo un minuto a 100 millibar per permettere l'ingresso dei batteri agro negli spazi interstiziali del tessuto vegetale immerso. Ripetere questa infiltrazione.Passaggi preliminari per garantire una buona infiltrazione. Rimuovere quindi la pianta dal desiccatore e rimetterla nella sua posizione eretta. Riportare le piante nella stanza di crescita e monitorare l'espressione proteica tra due e quindici giorni dopo l'infiltrazione.Per dimostrare l'efficacia dell'infiltrazione con siringa di agrobatteri nei tessuti vegetali, abbiamo analizzato l'espressione di due proteine fluorescenti, GFP e DsRed, mediante due diversi vettori virali vegetali destrutturati, Gemini viral e magcon per end. Foglie di Hamana completamente infiltrate con agrobatteri contenenti vettori virali Gemini hanno mostrato espressione di GFP in tutta l'area fogliare osservata in luce UV, già a partire da 2 DPI, raggiungendo l'accumulo massimo a 4 DPI.Al contrario, le foglie infiltrate con il vettore magcon contenente combinazioni di agrobatteri hanno mostrato fluorescenza GFP solo dopo cinque giorni post-infiltrazione (DPI) e hanno raggiunto l'accumulo massimo a sette DPI. Nessuna fluorescenza verde è stata osservata nelle foglie infiltrate con miscele di agrobatteri di controllo negativo EP1 10 più P19, indicando che la fluorescenza era specifica per il gene GFP e non era il risultato di fluorescenza di fondo delle foglie. Al suo picco di accumulo, la fluorescenza espressa dal vettore magcon per GFP è più intensa rispetto a quella del vettore virale Gemini.Non è stata osservata necrosi significativa sulle foglie infiltrate con costrutti GFP quando entrambe le proteine fluorescenti venivano espresse sulla stessa foglia mediante vettori virali Gemini con infiltrazione a goccia tramite siringa; esse sono state rilevate con il previsto colore fluorescente nella zona in cui erano state infiltrate. In modo interessante, l'infiltrazione concomitante di GFP e DS RED ha prodotto una fluorescenza giallognola. È stata inoltre esaminata l'infiltrazione a vuoto, al fine di sviluppare un metodo di agroinfiltrazione scalabile utilizzabile per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti mediante sistemi di espressione transitoria in piante.Come previsto, la fluorescenza GFP è stata osservata in tutte le foglie della pianta infiltrata rispetto all'infiltrazione con siringa. Questo metodo è più efficace e consente l'infiltrazione di ciascuna pianta in un tempo notevolmente più breve. Una volta padroneggiato, questa tecnica può essere eseguita in 48 ore.La maggior parte delle volte si tratta di una coltura batterica agro, poiché il tempo effettivo di infiltrazione è di soli pochi minuti. Per ottenere un'efficienza ottimale dell'infiltrazione agro e un'espressione proteica mirata, seguire il protocollo. Ricordare di controllare i parametri critici, tra cui le condizioni di crescita delle piante, la concentrazione batterica agro, la pressione e la durata del vuoto nel campo della biotecnologia vegetale.Questo approccio sperimentale può essere utilizzato per studiare lo sviluppo e la bioproduzione di nuove proteine farmaceutiche in un'ampia gamma di specie vegetali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come utilizzare l'agroinfiltrazione per trasferire costrutti genici target nella pianta e permettere ai sistemi di espressione transitoria vegetale di produrre proteine ricombinanti, paragonabili a quelle ottenute con colture cellulari di batteri, insetti e mammiferi.

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Biologia

L'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono test funzionali di routine per l'espressione ectopica transitoria dei geni nelle piante. Questi metodi sono test efficienti nelle strategie di effettioromica (rapida resistenza e scoperta del gene dell'avirulenza) e cruciali per la moderna ricerca nella patologia vegetale molecolare. Soddisfano la domanda di solide analisi funzionali ad alta produttività negli impianti.

Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l'accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-introduzione di silenziamento dell'RNA soppressori.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L'espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l'attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione.

Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In piante di tabacco

In questo studio è stata confrontata l'espressione di una proteina ricombinante umana bersaglio in diverse piattaforme di produzione. Ci siamo concentrati sulle colture tradizionali basate su fermentatori e sugli impianti, descrivendo il set-up di ciascun sistema ed evidenziando, sulla base dei risultati riportati, i limiti e i vantaggi intrinseci per ogni piattaforma.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Nonlytic sistemi di espressione di cellule di insetto sono sottoutilizzate per la produzione, il traffico cellulare / localizzazione, e analisi funzionale proteina ricombinante. Qui, descriviamo metodi per generare vettori di espressione e successiva espressione proteica transiente in cellule lepidotteri disponibili in commercio. La co-localizzazione di Bemisia tabaci acquaporine con proteine marker fluorescenti subcellulare è anche presentato.

Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in foglie di Nicotiana benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Qui è descritto un protocollo dettagliato per produzione preparativo-scala rapidamente (5 giorni) di triterpeni e analoghi utilizzando questa potente piattaforma di origine vegetale.

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

Descritto qui è un metodo di etichettatura di prossimità per l'identificazione dei partner di interazione del dominio TIR del recettore immunitario NLR nel tessuto fogliare di Nicotiana benthamiana. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'identificazione delle interazioni tra altre proteine di interesse utilizzando questa tecnica nella Nicotiana e in altre specie vegetali.

Etichettatura di prossimità basata su turboid per in Planta identificazione di reti di interazione proteina-proteina

Descriviamo qui un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione dell'IgG umano ricombinante fuso a GFP a Nicotiana benthamiana. Questo protocollo può essere esteso alla purificazione e visualizzazione di numerose proteine che utilizzano la cromatografia delle colonne. Inoltre, il protocollo è adattabile al laboratorio di insegnamento universitario di persona e virtuale, fornendo esplorazione basata su progetti.

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

Qui, presentiamo un protocollo passo-passo per eseguire l'esperimento di marcatura di prossimità (PL) nel cetriolo (Cucumis sativus L.) utilizzando AT4G18020 proteina (APRR2)-AirID come modello. Il metodo descrive la costruzione di un vettore, la trasformazione di un costrutto attraverso l'agroinfiltrazione, l'infiltrazione di biotina, l'estrazione di proteine e la purificazione di proteine marcate con biotina attraverso la tecnica di purificazione per affinità.

Etichettatura di prossimità basata su AirID per l'interazione proteina-proteina nelle piante

Qui presentiamo il primo protocollo per l'infiltrazione sottovuoto localizzata per studi in vivo della trasformazione genetica di piante di grandi dimensioni. Utilizzando questa metodologia, abbiamo ottenuto per la prima volta la trasformazione transitoria del cacao mediata da Agrobacterium in planta .

Agroinfiltrazione forzata sottovuoto per la trasformazione in planta di piante recalcitranti: il cacao come caso di studio

Impara l'agroinfiltrazione per l'espressione transitoria di proteine ricombinanti in piante di tabacco. Questo metodo scalabile utilizza Agrobacterium tumefaciens per ottenere livelli elevati di produzione proteica farmaceutica.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

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