Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Questo sistema sperimentale utilizza l'agroinfiltrazione per fornire efficacemente costrutti genici alle foglie per la produzione di alti livelli di proteina ricombinante. Per prima cosa, coltivate le piante di hamana in un ambiente controllato per sei settimane, tre giorni prima dell'infiltrazione. Preparare le colture di agrobatteri che contengono il gene bersaglio da esprimere nelle piante il giorno dell'infiltrazione.

Introdurre le colture di agrobatteri nel tessuto vegetale mediante siringa o infiltrazione sottovuoto. Risultati come l'intensità della fluorescenza verde della GFP nelle foglie di tabacco sotto la luce UV dimostrano una robusta espressione di proteine ricombinanti nelle piante che compete con quella degli attuali sistemi di espressione batterici e insetti dei mammiferi. L'agroinfiltrazione è un modo efficace per introdurre geni trans nelle cellule vegetali, che portano ad un alto livello di espressione di proteine ricombinanti.

Può essere utilizzato per un'ampia gamma di specie vegetali. Soprattutto, può essere scalato per la produzione commerciale di proteine farmaceutiche. Quindi questo metodo può fornire informazioni sulla cinetica e l'espressione della GFP e può essere applicato ad altre proteine come vaccini a subunità, anticorpi monoclonali ricombinanti e può essere utilizzato nei trattamenti per il cancro e le malattie infettive.

Un esperimento di successo richiede condizioni ottimali sia per la coltura batterica che per il materiale vegetale. Questo processo di infiltrazione è più facile da replicare dopo la dimostrazione visiva. Inizia mettendo fino a 60 pellet di torba in un vassoio di propagazione.

Aggiungere quattro litri di acqua del rubinetto e lasciare che i pellet di piselli assorbano l'acqua per due ore. Ora, aggiungi due semi di hamana in ogni pellet di torba e copri il vassoio con una cupola di plastica trasparente per la germinazione. Metti i semi in un ambiente a 25 gradi Celsius, 84% di umidità.

Due settimane dopo la semina, rimuovi la cupola e trasferisci le piante in un nuovo vassoio. Quindi aggiungere due litri da 1,48 grammi per litro. Il fertilizzante di Jack Continua a far crescere le piante a 25 gradi Celsius.

50% di umidità ambiente ogni due giorni. Fornire due litri di fertilizzante per vassoio. Alla quarta settimana, trasferisci le piante con i pellet di torba in un nuovo vassoio che ospita sei piante per un'ulteriore crescita fino a sei settimane di età.

Scegli piante di quattro, sei settimane e hamama con cinque o sei foglie ciascuna per un'infiltrazione completa con i ceppi agrobatterici che ospitano i geni di interesse. Una foglia per il controllo negativo e una foglia per l'infiltrazione spot. Crea una piccola scalfittura con un ago nell'epidermide sul retro della foglia, assicurandoti di non perforare la foglia da entrambi i lati.

Afferra saldamente il lato anteriore della prima foglia applicando una leggera contropressione sul collo. Con il pollice di una mano. Iniettare le miscele di agrobatterio nel tampone di infiltrazione nel collo con una siringa, un ago.

Continuare a iniettare le miscele di agrobatteri nella tacca fino a quando il cerchio verde più scuro smette di espandersi. Quindi crea un'altra tacca e ripeti le iniezioni fino a quando l'intera foglia non viene infiltrata e l'intera foglia diventa verde più scuro. Infiltrazioni complete delle prime tre foglie e dell'ultima foglia per la quarta foglia di ogni infiltrato vegetale con combinazioni di vettori di tutti e quattro i vettori virali Gemini o di tre vettori magcon.

Inoltre, fai una tacca per ogni combinazione di ceppi di agrobatteri e infiltrati in ogni tacca con una combinazione. Dopo l'infiltrazione, riportare le piante nella stanza di crescita e monitorare l'espressione proteica tra i due e i 15 giorni. Dopo l'infiltrazione, posizionare una vasca in un essiccante sottovuoto e trasferire in tre litri di tampone di infiltrazione contenente i ceppi di agrobatterio.

Quindi collegare l'essiccante a una pompa per vuoto a membrana di marca del vuoto. Ora posiziona una pianta a testa in giù sulla piastra essiccata e abbassa la piastra con la pianta fino a quando l'intero sistema foglia e stelo è immerso nel tampone di infiltrazione con la piastra appoggiata sopra la vasca. Quindi posizionare l'O-ring essiccato lungo il bordo.

Dopo aver messo il coperchio dell'essiccante sulla camera, accendere la pompa del vuoto e iniziare a cronometrare quando il vuoto raggiunge i 100 millibar. Dopo aver spento la pompa del vuoto, aprire lentamente la valvola di rilascio sull'essiccato dopo un minuto a 100 millibar per consentire l'ingresso degli agrobatteri negli spazi interstiziali del tessuto vegetale sommerso. Ripeti questa infiltrazione.

Passi uno per garantire una buona infiltrazione. Quindi rimuovere la pianta dall'essiccato e rimetterla in posizione verticale. Riporta le piante nella stanza di crescita e monitora l'espressione proteica tra due e 15 giorni dopo l'infiltrazione.

Per dimostrare l'efficacia dell'infiltrazione di agrobatterio nel tessuto vegetale, abbiamo testato l'espressione di due proteine fluorescenti, GFP e Ds red da due diversi vettori virali vegetali delocalizzati, Gemini, viral e magcon for end. Foglie di Hamana che sono state interamente infiltrate con agrobatteri contenenti vettori virali Gemini. L'espressione di GFP è stata osservata su tutta l'area fogliare sotto luce UV, a partire dal PI 2D e ha raggiunto il picco di accumulo a quattro DPI.

Al contrario, le foglie infiltrate con vettore magcon contenente combinazioni di agrobatteri hanno mostrato fluorescenza GFP solo dopo cinque DPI e hanno raggiunto il suo massimo accumulo a sette DPI. Non è stata osservata alcuna fluorescenza verde dalle foglie infiltrate con miscele di agrobatteri a controllo negativo di EP 10 più P 19, indicando che la fluorescenza era specifica per il gene GFP e non era il risultato della fluorescenza di fondo delle foglie. Al suo picco di accumulo, la fluorescenza del vettore magcon espressa in GFP è più intensa di quella del vettore virale Gemini.

Non è stata osservata necrosi importante sulle foglie infiltrate con costrutti GFP quando entrambe le proteine fluorescenti sono state espresse sulla stessa foglia tramite vettori virali Gemini con infiltrazione spot siringa, sono state rilevate con il loro colore fluorescente previsto nel punto in cui sono state infiltrate. È interessante notare che la co-infiltrazione di GFP e DS RED ha provocato una fluorescenza giallastra. L'infiltrazione sotto vuoto è stata anche esaminata per sviluppare un metodo di agroinfiltrazione scalabile che può essere utilizzato per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti da parte di sistemi di espressione transitoria delle piante.

Come previsto, la fluorescenza GFP è stata osservata per tutte le foglie della pianta infiltrata rispetto all'infiltrazione a siringa. È più robusto e può ottenere l'infiltrazione di ogni pianta con un lasso di tempo molto più breve. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 48 ore.

La maggior parte delle volte si tratta di colture agrobatteriche poiché il tempo effettivo di infiltrazione dura solo pochi minuti per un'efficienza ottimale dell'agroinfiltrazione e un'espressione proteica mirata. Segui il protocollo. Ricordarsi di controllare i parametri critici, tra cui le condizioni di crescita delle piante, la concentrazione agrobatterica, la pressione del vuoto e la durata nel campo della biotecnologia vegetale.

Questo approccio sperimentale può essere utilizzato per esplorare lo sviluppo e la bioproduzione di nuove proteine farmaceutiche in un'ampia gamma di specie vegetali. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona idea di come utilizzare l'agroinfiltrazione per fornire costrutti genici bersaglio nella pianta e per consentire ai sistemi di espressione transitoria della pianta di produrre proteine ricombinanti, rivaleggiando con quelle delle colture di cellule batteriche e insetti di mammiferi.