Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Questo sistema sperimentale utilizza l'infiltrazione agro per consegnare efficacemente costrutti genici alle foglie al fine di produrre elevate quantità di proteine ricombinanti. Innanzitutto, coltivare piante di Hamana end in un ambiente controllato per sei settimane, tre giorni prima dell'infiltrazione. Preparare le colture di agrobatteri contenenti il gene bersaglio da esprimere nelle piante il giorno dell'infiltrazione.

Introdurre le colture di agrobatterio nel tessuto vegetale mediante infiltrazione con siringa o sotto vuoto. Risultati come l'intensità della fluorescenza verde della GFP in foglie di tabacco sotto luce UV dimostrano un'espressione robusta di proteine ricombinanti nelle piante, paragonabile a quella dei sistemi di espressione attuali basati su mammiferi, batteri e insetti. L'infiltrazione agro è un metodo efficace per introdurre geni trasgenici nelle cellule vegetali, che porta a un'espressione elevata di proteine ricombinanti.

È possibile utilizzarlo per un'ampia gamma di specie vegetali. È particolarmente importante il fatto che possa essere ampliato per la produzione commerciale di proteine farmaceutiche. Questo metodo può quindi fornire informazioni sui parametri cinetici e sull'espressione della GFP ed essere applicato ad altre proteine, come vaccini a subunità, anticorpi monoclonali ricombinanti, e può essere impiegato nei trattamenti contro il cancro e le malattie infettive.

Un esperimento di successo richiede condizioni ottimali sia per la coltura batterica che per il materiale vegetale. Questo processo di infiltrazione è più facile da replicare dopo una dimostrazione visiva. Iniziare posizionando fino a 60 tavolette di torba in un vassoio di propagazione.

Aggiungere quattro litri di acqua di rubinetto e lasciare che i dischetti di torba assorbano l'acqua per due ore. Ora, aggiungere due semi hamana in ogni disco di torba e coprire il vassoio con una cupola di plastica trasparente per la germinazione. Posizionare i semi in un ambiente a 25 gradi Celsius e umidità al 84%.

Dopo due settimane dal trapianto, rimuovere la cupola e trasferire le piante in un nuovo vassoio. Quindi aggiungere due litri di fertilizzante Jack's a 1,48 grammi per litro. Continuare la coltivazione delle piante a 25 gradi Celsius.

Ambiente con umidità al 50%, cambiato ogni due giorni. Fornire due litri di fertilizzante Jack's per ogni vassoio. Alla quarta settimana, trasferire le piante con pellet di torba in un nuovo vassoio che ospita sei piante per una crescita ulteriore fino all'età di sei settimane.

Scegliere quattro piante di hamama di sei settimane con cinque-sei foglie ciascuna: tre foglie per l'infiltrazione completa con i ceppi agrobatterici contenenti i geni di interesse, una foglia per il controllo negativo e una foglia per l'infiltrazione a macchia. Creare una piccola incisione con un ago nell'epidermide della parte inferiore della foglia, avendo cura di non perforare la foglia su entrambi i lati.

Afferrare saldamente il lato anteriore della prima foglia esercitando una leggera pressione contraria sul collo. Con il pollice di una mano, iniettare le miscele di agrobatteri in tampone di infiltrazione nel collo mediante siringa e ago.

Continuare a iniettare le miscele di agrobatteri nella fessura finché il cerchio verde scuro non smette di espandersi. Creare quindi un'altra fessura e ripetere le iniezioni fino a quando l'intera foglia non è stata infiltrata e l'intera foglia diventa verde scuro. Completare l'infiltrazione delle prime tre foglie e dell'ultima foglia, utilizzata come quarta foglia di ogni pianta, con combinazioni di vettori costituite da tutti e quattro i vettori virali Gemini oppure da tre vettori magcon.

Inoltre, effettuare un'incisione per ogni combinazione di ceppi di agrobatterio e infiltrare ciascuna incisione con una singola combinazione. Dopo l'infiltrazione, riportare le piante nella stanza di crescita e monitorare l'espressione della proteina tra due e quindici giorni. Dopo l'infiltrazione, posizionare un contenitore in un essiccatore sotto vuoto e trasferirvi tre litri di buffer di infiltrazione contenente i ceppi di agrobatterio.

Quindi collegare il desiccante a una pompa a vuoto con diaframma. Posizionare ora una pianta capovolta sulla piastra del desiccante e abbassare la piastra con la pianta fino a quando l'intero sistema fogliare e caulicolare sia immerso nel buffer di infiltrazione, con la piastra appoggiata sulla sommità del contenitore. Successivamente, posizionare l'anello O del desiccante lungo il bordo.

Dopo aver posizionato il coperchio del desiccante sulla camera, accendere la pompa a vuoto e iniziare a cronometrare quando il vuoto raggiunge 100 millibar. Dopo aver spento la pompa a vuoto, aprire lentamente la valvola di sfiato del desiccante dopo un minuto a 100 millibar per permettere l'ingresso dei batteri agro negli spazi interstiziali del tessuto vegetale immerso. Ripetere questa infiltrazione.

Passaggi preliminari per garantire una buona infiltrazione. Rimuovere quindi la pianta dal desiccatore e rimetterla nella sua posizione eretta. Riportare le piante nella stanza di crescita e monitorare l'espressione proteica tra due e quindici giorni dopo l'infiltrazione.

Per dimostrare l'efficacia dell'infiltrazione con siringa di agrobatteri nei tessuti vegetali, abbiamo analizzato l'espressione di due proteine fluorescenti, GFP e DsRed, mediante due diversi vettori virali vegetali destrutturati, Gemini viral e magcon per end. Foglie di Hamana completamente infiltrate con agrobatteri contenenti vettori virali Gemini hanno mostrato espressione di GFP in tutta l'area fogliare osservata in luce UV, già a partire da 2 DPI, raggiungendo l'accumulo massimo a 4 DPI.

Al contrario, le foglie infiltrate con il vettore magcon contenente combinazioni di agrobatteri hanno mostrato fluorescenza GFP solo dopo cinque giorni post-infiltrazione (DPI) e hanno raggiunto l'accumulo massimo a sette DPI. Nessuna fluorescenza verde è stata osservata nelle foglie infiltrate con miscele di agrobatteri di controllo negativo EP1 10 più P19, indicando che la fluorescenza era specifica per il gene GFP e non era il risultato di fluorescenza di fondo delle foglie. Al suo picco di accumulo, la fluorescenza espressa dal vettore magcon per GFP è più intensa rispetto a quella del vettore virale Gemini.

Non è stata osservata necrosi significativa sulle foglie infiltrate con costrutti GFP quando entrambe le proteine fluorescenti venivano espresse sulla stessa foglia mediante vettori virali Gemini con infiltrazione a goccia tramite siringa; esse sono state rilevate con il previsto colore fluorescente nella zona in cui erano state infiltrate. In modo interessante, l'infiltrazione concomitante di GFP e DS RED ha prodotto una fluorescenza giallognola. È stata inoltre esaminata l'infiltrazione a vuoto, al fine di sviluppare un metodo di agroinfiltrazione scalabile utilizzabile per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti mediante sistemi di espressione transitoria in piante.

Come previsto, la fluorescenza GFP è stata osservata in tutte le foglie della pianta infiltrata rispetto all'infiltrazione con siringa. Questo metodo è più efficace e consente l'infiltrazione di ciascuna pianta in un tempo notevolmente più breve. Una volta padroneggiato, questa tecnica può essere eseguita in 48 ore.

La maggior parte delle volte si tratta di una coltura batterica agro, poiché il tempo effettivo di infiltrazione è di soli pochi minuti. Per ottenere un'efficienza ottimale dell'infiltrazione agro e un'espressione proteica mirata, seguire il protocollo. Ricordare di controllare i parametri critici, tra cui le condizioni di crescita delle piante, la concentrazione batterica agro, la pressione e la durata del vuoto nel campo della biotecnologia vegetale.

Questo approccio sperimentale può essere utilizzato per studiare lo sviluppo e la bioproduzione di nuove proteine farmaceutiche in un'ampia gamma di specie vegetali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come utilizzare l'agroinfiltrazione per trasferire costrutti genici target nella pianta e permettere ai sistemi di espressione transitoria vegetale di produrre proteine ricombinanti, paragonabili a quelle ottenute con colture cellulari di batteri, insetti e mammiferi.