Imaging attraverso il caso pupa di Drosophila melanogaster

In questo video, dimostreremo nuove tecniche che ci permettono di visualizzare il pube di Drosophila Melanogaster senza compromettere l'integrità strutturale del puer. Mantenendo intatto il caso della pupilla, riduciamo al minimo l'impatto dell'imaging sullo sviluppo e sulla vitalità della pupa. Per l'imaging utilizziamo un microscopio confocale a scansione risonante da 8.000 hertz.

È importante sottolineare che l'elevata velocità di scansione e l'elevata sensibilità di questo microscopio riducono notevolmente lo sbiancamento, consentendo lunghi periodi di osservazione. Con questo metodo, siamo stati in grado di visualizzare una varietà di processi biologici cellulari, tra cui il comportamento, la fop, la podia, la morfogenesi, la fagocitosi e la mitosi. Con questa tecnica, possiamo osservare eventi in situ per lunghi periodi di tempo senza danneggiare l'organismo.

Le osservazioni ottenute da questi metodi possono essere utilizzate per comprendere una varietà di fenomeni biologici in questa fase relativamente inaccessibile dello sviluppo della drosophila, il popolo del formaggio, lo stadio appropriato, li esaminiamo mentre siamo ancora nella fiala alla ricerca di indicatori chiave nella fase di sviluppo per studiare le divisioni cellulari, cerchiamo pipa che hanno distolto la testa, ma ancora non mostrano pacchetti verdi e meconio e l'addome dorsale. Gli individui vengono allentati toccando la custodia con un pennello umido che trasferisce l'acqua per sciogliere la colla salivare. I pipa vengono quindi delicatamente liberati, raccolti con il pennello e trasferiti in una capsula di Petri contenente acqua.

Le persone vengono accuratamente lavate in acqua per pulire la custodia da cibo o detriti. Quindi li allineiamo, con il lato dorsale rivolto verso l'alto per assicurarci che siano dello stadio corretto. Maneggiali con cura.

Possono facilmente morire se viene praticato anche un piccolo foro nel tubo. Gli individui selezionati vengono posizionati con cura e la piastra di Petri con fondo di vetro e la orientano in modo che l'elemento di interesse sia il più vicino possibile al vetrino coprioggetti e il più parallelo possibile alla superficie. Per osservare l'ala pupillare, appoggiamo la pupa contro il supporto, come una lunghezza sottile, l'argilla da modellare o la cera dentale, assicurandoci che non si muovano dopo l'orientamento.

Invitiamo quindi il piatto per assicurarci che la caratteristica di interesse sia visibile e ben orientata. In genere, montare più pipa contemporaneamente per evitare la possibilità che uno non stia esprimendo la proteina fluorescente o non sia allo stadio desiderato. Una volta che le pipa sono tutte montate e orientate correttamente, tocchiamo la base di ogni pipa con un pennello inumidito con diod dilin glycol, una montagna atossica che abbina l'indice di rifrazione dell'olio di puro o un'acqua di diluita con acqua.

Questo ha un duplice scopo di ridurre la diffrazione dal corpo pupillare e ridurre la rifrazione delle lenti di immersione vengono utilizzate una volta che abbiamo montato e sistemato correttamente i pupi. Passiamo al microscopio confocale a scansione laser. Usiamo un invertito come un SP five dotato di uno scanner di risonanza.

Il piatto viene montato sul microscopio e localizziamo il puput utilizzando l'ottica del microscopio. Una volta trovata la pupa, regolare la messa a fuoco in modo che la caratteristica di interesse in questo caso, l'ala, sia visibile. Identifichiamo l'ala dalla presenza di un grande elemento tracheale che attraversa il centro dell'ala.

Quando la regione di interesse viene identificata e il microscopio viene messo a fuoco, si passa all'obiettivo a secco 20x. Dopo aver riconfermato la messa a fuoco, passiamo il microscopio alla modalità confocale. Regoliamo i parametri del confocale per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.

L'intensità della luce è mantenuta al di sotto del 10% di trasmissione. Per massimizzare la luminosità, apriamo il foro stenopeico a 130 micron per l'obiettivo 20 x con azuma four e impostiamo il guadagno a 900 volt. Con queste impostazioni, possiamo visualizzare per ore senza influire sulla durata dell'intervallo mitotico o sulla salute dell'animale.

Successivamente, impostiamo il numero di sezioni Z e la frequenza di acquisizione dell'immagine in modo che corrispondano alle caratteristiche del fenomeno biologico che stiamo cercando di osservare, ad esempio, intervalli di imaging di un minuto catturano sufficientemente tutte le caratteristiche importanti della divisione cellulare. Ma intervalli di tre secondi sono importanti per osservare la dinamica dei filopodi. Concentrati su e giù attraverso l'epitelio fino a trovare la funzione desiderata.

Se necessario, utilizzare il microscopio e la modalità XYZT per raccogliere le pile Z nel tempo. Anche la durata dei film è un parametro importante. Abbiamo realizzato video della durata di 10 ore.

Quando si esegue l'imaging di più molecole fluorescenti contemporaneamente, si cerca di ridurre la durata totale dell'imaging. In linea di principio, ogni etichetta fluorescente provoca una maggiore produzione di specie reattive dell'ossigeno. In pratica, non abbiamo osservato alcuna letalità associata all'imaging di linee triplicamente marcate per un'ora o meno.

Se il tessuto target o il processo è più piccolo di circa cinque micron, probabilmente dovrai utilizzare una lente a immersione. Tieni presente che queste lenti focalizzano il laser su un punto più fine, aumentando così l'intensità della luce, ed è necessario regolare i parametri di imaging di conseguenza, i film vengono trasferiti dal microscopio confocale a un computer che esegue il programma di analisi delle immagini autostradali, Fiji. Con Fiji, possiamo aprire, misurare e manipolare le caratteristiche nelle immagini multidimensionali generate dal confocale.

Questo metodo di imaging ci ha permesso di studiare la posizione dei nuclei rispetto al ciclo cellulare. Nell'ala pupillare, abbiamo raccolto una pila Z dalla parte superiore dell'epitelio ai nuclei più osservabili inferiori a intervalli di un minuto. In questi filmati, abbiamo osservato solo le divisioni che si verificano nelle sezioni confocali apicali mostrate qui a sinistra, le sezioni più basali mostrate a destra rivelano il ritorno di nuclei appena divisi dallo strato superficiale, ma non contengono altre caratteristiche della mitosi.

Questi dati mostrano che l'epitelio dell'ala pupillare che si divide rapidamente è simile al disco alare larvale e ad altri MedOne. Epiteliale in quanto i nuclei si spostano sulla superficie apicale dell'epitelio durante la mitosi. Nonostante questa comunanza, l'epitelio dell'ala pupillare è relativamente poco stratificato con la maggior parte dei nuclei molto vicini allo strato superiore.

I precedenti metodi di imaging della drosofila durante le prime fasi dello sviluppo della pupilla sono stati ostacolati, in gran parte a causa dei tentativi di rimuovere o penetrare il case della pupilla. Descriviamo qui un nuovo approccio che ci permette di visualizzare le cellule adulte durante lo sviluppo senza compromettere la vitalità dell'organismo. Il nostro metodo è qualitativamente diverso dagli altri in quanto mantiene completamente intatto il caso pupillare.

La combinazione della microscopia confocale con la scansione risonante ci consente di visualizzare i tessuti in via di sviluppo entro 20 micron dal caso pupillare. I principali limiti nella risoluzione della profondità sono la distanza di lavoro della lente e la dispersione dal bossolo nel tessuto. Tuttavia, il nostro metodo ci permette di risolvere le caratteristiche delle cellule epiteliali dall'apice alla base.

Abbiamo utilizzato questa tecnica per osservare la mitosi, il filo, la podia, la morfogenesi e la fagocitosi. Oltre a questo, abbiamo studiato fino a tre distinti tag fluorescenti in un campione. Riteniamo che gli approcci qui descritti abbiano aperto il primo periodo di sviluppo della pupilla allo studio degli strati epiteliali più esterni.

Se combinata con il potere della genetica geale, questa accessibilità può migliorare ulteriormente la nostra comprensione dello sviluppo adulto.