Name: Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: Scopri l'internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri mediante citometria a flusso imaging multi-spettrale. Questo metodo utilizza cellule RAW 264.7 per analizzare i meccanismi di fagocitosi dipendenti dall'actina.

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Gli autori desiderano ringraziare il ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) e l&#39;US Army Medical Research e Materiel Command (numeri di sovvenzione W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) per finanziarie sostenere.

<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
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<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
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<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree amico L. è impiegato da Amnis Corporation, che produce il sistema X ImageStream.

Studi hanno dimostrato che le nanoparticelle biodegradabili a base di poli (lattico-co-glicolico (PLGA) o polianidridi possono essere usati per fornire antigeni incapsulati o farmaci alle cellule bersaglio. Assorbimento di tali nanoparticelle di cellule fagocitiche è importante per la loro efficacia, rendendo quantitativa . analisi di interiorizzazione critica nella progettazione di nuovi sistemi di consegna delle nanoparticelle Utilizzando questo metodo, assorbimento differenziale di nanoparticelle di vari tipi di cell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> RAW 264,7 linea cellulare </td><td> Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S 11150 </td><td> Premium Grade </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Piastra da 24 pozzetti</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Coltura cellulare Boccette </td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Cella scraper </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica sierotipo Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Manipolatore cella Electro </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione salina tamponata (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ultrasuoni processore liquido </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina D- </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeide </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone di lavaggio </td><td> 2% di FBS inattivato, sodio azide allo 0,1% in PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / tampone di lavaggio </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-visualizzare microprovette tappo a scatto </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 660 phalloidin </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis Corporazione </td><td> 100200 </td><td> Opzioni: 658nm laser, autocampionatore </td></tr><tr><td> Sodio azide </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da multi-spettrale citometria a flusso imaging

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Sistemi di nanoparticelle sono emersi come strumenti preziosi nella consegna vaccino attraverso la loro capacità di fornire in modo efficiente merci, ivi compresi le proteine, le cellule presentanti l&#39;antigene 1-5. Internalizzazione di nanoparticelle (NP) da cellule presentanti l&#39;antigene è un punto critico nel generare una risposta immunitaria all&#39;antigene incapsulato. Per determinare come le alterazioni della funzionalità impatto formulazione di nanoparticelle, abbiamo cercato di sviluppare un elevato throughput, il protocollo sperimentale quantitativa che fosse compatibile con rilevare le nanoparticelle internalizzate così come batteri. Ad oggi, due tecniche indipendenti, microscopia e citometria di flusso, sono stati i metodi utilizzati per studiare la fagocitosi di nanoparticelle. La natura throughput elevato della citometria a flusso genera solidi dati statistici. Tuttavia, a causa della bassa risoluzione, non riesce a quantificare con precisione internalizzati contro cellule nanoparticelle associati. Microscopia genera immagini ad alta risoluzione spaziale; hazione sul mercato, è in termini di tempo e coinvolge campioni di piccole dimensioni 6-8. Multi-spettrale citometria a flusso di immagini (MIFC) è una nuova tecnologia che incorpora aspetti di microscopia e di citometria a flusso che esegue multi-color immagini spettrali di campo fluorescenza e luminoso simultaneamente attraverso un nucleo laminare. Questa funzionalità fornisce un&#39;analisi accurata di intensità di segnale fluorescenti e le relazioni spaziali tra le diverse strutture e funzioni cellulari ad alta velocità. Qui, descriviamo un metodo che utilizza MIFC per caratterizzare le popolazioni di cellule che hanno interiorizzato nanoparticelle polianidride o Salmonella enterica sierotipo Typhimurium. Si descrivono anche la preparazione di sospensioni di nanoparticelle, etichettatura cellulare, su un sistema di acquisizione ImageStream X e l&#39;analisi dei dati utilizzando l&#39;applicazione IDEE. Abbiamo inoltre dimostrato l&#39;applicazione di una tecnica che può essere utilizzata per differenziare il p internalizzazioneathways per nanoparticelle e batteri utilizzando citocalasina-D come un inibitore di actina-mediata fagocitosi.

In questo articolo descriviamo un metodo che utilizza multi-spettrale di citometria a flusso di imaging per quantificare l&#39;interiorizzazione delle nanoparticelle polianidride o batteri da parte delle cellule RAW 264.7.

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

I sistemi nanoparticolati sono emersi come strumenti preziosi per la somministrazione di vaccini grazie alla loro capacità di veicolare efficientemente il carico, incluse le proteine, a...

Per analizzare i meccanismi cellulari di internalizzazione di nanoparticelle e batteri mediante citometria a flusso con imaging multispettrale. I macrofagi vengono innanzitutto pretrattati con citocalasina D per inibire la polimerizzazione dell'actina. Vengono quindi aggiunte nanoparticelle o salmonella al monostrato di macrofagi e incubate.Successivamente i macrofagi vengono raccolti, fissati e marcati per l'analisi mediante un sistema di imaging in flusso. Le cellule analizzate con citometria a flusso multispettrale che hanno internalizzato nanoparticelle e/o salmonella vengono distinte da quelle con nanoparticelle e/o salmonella legate alla superficie. I dati ottenuti indicano che sia salmonella che nanoparticelle vengono internalizzate soltanto da cellule che non sono state trattate con citocalasina.D, suggerendo che l'internalizzazione dipende dall'actina. Questa tecnica presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti, come la citometria a flusso e la microscopia confocale. Principalmente, fornisce una misura accurata delle intensità del segnale fluorescente e della risoluzione spaziale tra diverse caratteristiche cellulari ad alta velocità.Questo metodo può aiutare a r

analyzing-cellular-internalization-nanoparticles-bacteria-multi

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Fonte: Zhang, Y., et al. Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare il rimodellamento del sistema endo-lisosomiale da parte di batteri intracellulari. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra l'uso di nanoparticelle fluorescenti per visualizzare il rimodellamento endolisosomiale nelle cellule epiteliali umane infettate da batteri intracellulari. In seguito all'invasione batterica, i patogeni manipolano il citoscheletro dell'ospite e il sistema endo-lisosomiale, formando vacuoli...

Visualizzazione mediata da nanoparticelle del rimodellamento endolisosomiale in cellule infettate da batteri

Esaminiamo i nostri risultati recenti sull'integrazione di microscopia a fluorescenza e di imaging strumenti di citometria a flusso su un telefono cellulare utilizzando compatte e convenienti opto-fluidici allegati. Questi cellulare basato micro-dispositivi di analisi può essere utile per l'analisi citometrica, ad esempio per eseguire operazioni di conteggio cellulari diversi e per high throughput screening di campioni di acqua, ad esempio in impostazioni delle risorse limitate.

Ampio campo di microscopia a fluorescenza e citometria di flusso Imaging fluorescente su un telefono cellulare

In questo studio, lo scopo principale era monitorare l'assorbimento cellulare e l'eventuale esocitosi dei nanotubi di carbonio (CNT). Da questo punto di vista, abbiamo proposto un metodo unico che utilizza la citometria a flusso con imaging multispettrale che consente una quantificazione e localizzazione di CNT in un numero statisticamente rilevante di cellule.

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Analisi delle interazioni delle nanoparticelle con sottopopolazioni di cellule immunitarie definite mediante citometria di flusso.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Questo articolo descrive i metodi per la sintesi e l'etichettatura fluorescente di nanoparticelle (NP). Le NP sono stati applicati in esperimenti di pulse-chase di etichettare il sistema endo-lisosomiale di cellule eucariotiche. Manipolazione del sistema endo-lisosomiale dalle attività del patogeno intracellulare Salmonella enterica sono state seguite da imaging cellulare dal vivo e quantificato.

Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare rimodellamento del sistema Endo-lisosomiale da batteri intracellulari

Questo metodo dimostra una tecnica per valutare la funzione dei granulociti misurando simultaneamente la fagocitosi dei batteri e lo scoppio ossidativo. La citometria a flusso basata su immagini ha permesso l'identificazione di tre sottogruppi distinti di granulociti attivati che differivano tutti nella loro capacità funzionale relativa.

Immagine a base di Citometria a flusso Tecnica per valutare le variazioni Granulocyte Funzione In Vitro

L'analisi cytometric di flusso si è dimostrato prezioso per l'indagine di colture pure e monitoraggio dinamiche comunità microbica. Presentiamo tre flussi di lavoro completi, dal campionamento all'analisi dei dati, delle colture pure e complessa comunità nel medio chiaro anche come matrici impegnativi, rispettivamente.

Caratterizzante Microbiome Dynamics – flusso Cytometry basato su flussi di lavoro da colture Pure di comunità naturali

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Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

Questo articolo presenta l'integrazione di un modulo di messa a fuoco spettrale e di un laser a impulsi a doppia uscita, che consente una rapida imaging iperspettrale di nanoparticelle d'oro e cellule tumorali. Questo lavoro mira a dimostrare i dettagli delle tecniche ottiche non lineari multimodali su un microscopio a scansione laser standard.

Imaging biomolecolare dell'assorbimento cellulare di nanoparticelle mediante microscopia ottica non lineare multimodale

Questo protocollo descrive un approccio quantitativo per misurare l'autoaggregazione microbica utilizzando la citometria a flusso di imaging.

Citometria a flusso per lo studio dell'autoaggregazione microbica

Questo studio chiarisce l'elaborazione fagocitaria delle particelle Godanti Bhasma (GB) nelle cellule di mammifero, caratterizzandone l'assorbimento cellulare, la dinamica del vacuolo, l'acidificazione e la degradazione. Questi risultati non solo migliorano la nostra comprensione dei meccanismi fondamentali della fagocitosi, ma stabiliscono anche la GB come un promettente sistema modello per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

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