Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Analizzare i meccanismi cellulari di internalizzazione di nanoparticelle e batteri mediante citometria a flusso con imaging multispettrale. I macrofagi vengono prima pretrattati con citoklain D per inibire la polimerizzazione dell'actina. Le nanoparticelle o la salmonella vengono aggiunte al macrofago, monostrato e incubate.

Quindi i macrofagi vengono raccolti, fissati ed etichettati per l'analisi utilizzando un flusso di immagini. Le cellule del citometro a flusso con imaging multispettrale che hanno internalizzato nanoparticelle e/o salmonella si distinguono da quelle con nanoparticelle legate alla superficie e/o salmonella. I dati risultanti indicano che sia la salmonella che le nanoparticelle sono internalizzate solo da cellule che non sono state trattate con cyto klain.

D suggerendo che l'internalizzazione è actina dipendente. Questa tecnica presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti come la citometria a flusso e la microscopia confocale. In primo luogo, fornisce una misura accurata dell'intensità del segnale fluorescente e della risoluzione spaziale tra diverse caratteristiche cellulari ad alta velocità.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sia per la ricerca sui vaccini biomateriali che sulla somministrazione di farmaci, nonché per una serie di studi sull'interazione con i patogeni. Ciò include la delineazione dei percorsi di internalizzazione utilizzati dalle nanoparticelle di polianidride e dai batteri. In generale, le persone che non conoscono questo metodo spesso lottano.

È importante dedicare del tempo alla titolazione dei coloranti per ottenere segnali di fluorescenza ottimali. Inoltre, conoscere il software e creare modelli di analisi richiede tempo. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che le nanoparticelle di poli-idro mostrano caratteristiche di imitazione dei patogeni durante l'impiego della microscopia e di altre tecniche.

Volevamo quindi un sistema ad alto rendimento per confrontare i processi di internalizzazione utilizzati dalla salmonella e dalle nanoparticelle di idruro di polline prima di eseguire il saggio. Tutte le colture cellulari di mammiferi e batteri devono essere raccolte e devono essere preparate sospensioni di nanoparticelle. Inizia raccogliendo le cellule RA confluenti W2 64.7 utilizzando un raschietto cellulare.

Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Quindi piastrate le cellule in una piastra di coltura da 24 pozzetti a una densità di cinque volte 10 per pozzetto in 0,5 millilitri. Incubazione completa di DMEM per una notte a 37 gradi Celsius e un incubatore al 5% di CO2.

Per preparare la salmonella tarica diluire trasformare la salmonella in C-D-M-E-M per ottenere una molteplicità di infezioni di cento per RA W2 64,7 cellule in una provetta di coltura in vetro con tappo a vite in autoclave da 16 x 125 millimetri. Successivamente, utilizzando carta del siero di latte sterilizzata, pesare cinque milligrammi di nanoparticelle di polianidride caricate all'1% FITC generate come descritto dai colleghi di Rean nella loro pubblicazione del 2009 e dalla ricerca farmaceutica in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere le nanoparticelle a 0,5 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato freddo e metterla sul ghiaccio.

Mantenere il tubo sul ghiaccio. Utilizzare un processore di liquidi a ultrasuoni con una micro punta per sonicare la sospensione per circa 25 secondi a quattro-sei joule. Ora che tutte le cellule e i reagenti necessari sono pronti, è possibile eseguire il test di fagocitosi.

Etichettare 24, piastre per colture tissutali contenenti cellule RA W2 64.7 in coltura in preparazione per il test sulla prima piastra. Ciascuno dei seguenti campioni sarà analizzato in triplicato, cito e D con nanoparticelle, cito e D con salmonella, terreno con nanoparticelle, terreno con solo nanoparticelle di salmonella, solo salmonella e AF sei cellule colorate a soli quattro gradi Celsius i controlli saranno analizzati sulla seconda piastra e includeranno terreno più nanoparticelle e mezzo più incubazione di salmonella a questa bassa temperatura, processi cellulari lenti come la fagocitosi un'ora prima dell'induzione. Aggiungere cinque microgrammi per millilitro di cito e D e C-D-M-E-M nei pozzetti appropriati e incubare le cellule a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, agitare la sospensione di nanoparticelle e aggiungere 10 microlitri nei pozzetti appropriati. Quindi agitare la salmonella e aggiungerla ai pozzetti appropriati a un MOI di 100. Toccare il piatto un paio di volte per mescolare.

Quindi posizionare le piastre campione a 37 gradi Celsius e le piastre di controllo negative a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Dopo l'incubazione, posizionare le piastre sul ghiaccio, lavare le cellule due volte con PBS ghiacciato senza calcio e magnesio aspirando e scartando il vecchio terreno per rimuovere le particelle non legate, la salmonella e le cellule morte o staccate. Uso di petali di magnesio.

La pre PBS in questa fase è essenziale perché facilita il distacco delle cellule dal substrato Per raccogliere le cellule, aggiungere 250 microlitri di PBS ghiacciato e raschiare delicatamente i pozzetti, pipettare le cellule raccolte in provette per microcentrifuga con tappo a scatto siliconato e tenerle sul ghiaccio. Lavare le celle aggiungendo un millilitro di tampone di lavaggio a freddo, quindi centrifugare a 250 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, rimuovere il tampone residuo picchiettando la provetta per microcentrifuga rovesciata su carta.

Risospendere il pellet della cella con un asciugamano rastrellando delicatamente la provetta della microcentrifuga su un rack per provette. Per fissare le cellule, aggiungere 100 microlitri di para formaldeide al 4% in PBS e lasciare riposare le cellule per 15 minuti. A temperatura ambiente, lavare le celle aggiungendo un millilitro di tampone di lavaggio permanente, quindi centrifugare a 250 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver eliminato il surnatante, rimuovere il tampone residuo come in precedenza. Quindi colorare le celle RA W2 64.7. Per l'actina, aggiungere 100 microlitri di tampone per il lavaggio permanente contenente Alexa Fluora foid in sei 60 per 15 minuti.

A temperatura ambiente, i campioni non colorati devono essere incubati con permanente, tampone di lavaggio senza phin. Dopo la colorazione, lavare e centrifugare nuovamente le cellule, quindi risospenderle in 50 microlitri di PBS contenente l'1% di PFA e conservarle al buio a quattro gradi Celsius fino all'acquisizione. Accensione, streaming di immagini e avvio.

Ispira e inizializza la fluidica nel menu file. Scegliere il modello di default di caricamento. Nella galleria di immagini, menu di visualizzazione, selezionare tutto e premere Esegui configurazione per avviare l'imaging delle perline, se necessario, regolare l'inseguimento del nucleo per centrare le immagini lateralmente.

Selezionare il canale del campo chiaro e fare clic su imposta intensità. Attendere che il coefficiente di variazione della velocità del flusso sia costantemente inferiore allo 0,2% Nella scheda di assistenza, fare clic su Avvia tutto per eseguire calibrazioni e test e verificare che tutti siano stati superati nel software. Fare clic su carica campione.

Quindi, quando richiesto, posizionare la fiala contenente il campione più luminoso. Con tutti i fluorocromi nel caricatore di campioni, selezionare l'ingrandimento 40x. Una volta stabilite le impostazioni dello strumento, non modificarle per l'intero esperimento.

Accendi ogni laser nell'esperimento facendo clic sulle icone del laser nel software e imposta la potenza del laser in modo che ogni fluorocromo abbia valori massimi di pixel compresi tra 104.000 conteggi misurati nei grafici a dispersione. Per eliminare la raccolta di oggetti indesiderati, fare clic sulla finestra del classificatore di celle nel software. Quindi, per raccogliere solo i dati delle celle, selezionare il canale del limite inferiore dell'area per il campo chiaro e impostare il valore a 50 micrometri: gli oggetti con area inferiore a 50 micrometri saranno considerati detriti e non verranno acquisiti.

Selezionare i canali da raccogliere facendo clic sulle icone dei canali appropriate nel software qui. I canali 1, 2, 3, 4, 5 e sei sono selezionati nella scheda di configurazione. Immettere il numero del file e la cartella di destinazione.

Impostare il numero di sequenza su uno e il numero di eventi da acquisire su 5.000. Fare clic su Esegui, acquisisci per raccogliere e salvare il primo file di dati dell'esperimento. Fare clic su FLL ed eseguire l'esempio sperimentale successivo.

Ripetere fino a quando tutti i campioni sperimentali sono stati raccolti. Successivamente, per eseguire i controlli, fare clic su Impostazioni comp. In questo modo si disattiveranno il campo luminoso e il laser a dispersione e si abiliterà la raccolta di tutti i canali di fluorescenza nella scheda di acquisizione.

Modificare il valore di input in 500. Quindi posizionare il tubo di controllo e fare clic su Esegui. Acquisisci per raccogliere 500 cellule positive in controlli colorati singolarmente.

Ripetere per ogni fluorocromo nell'esperimento per sviluppare una matrice di compensazione. Una volta acquisite tutte le immagini di esempio, avviare il software di analisi delle idee su un computer di analisi separato facendo doppio clic sull'icona delle idee sul desktop. Fare doppio clic sulla procedura guidata di internalizzazione e caricare uno dei file RIF di esempio del test.

Una finestra popup fornirà le istruzioni per caricare i file di test. Segui le istruzioni e fai clic sul pulsante Avanti. Quindi, fai clic su nuova matrice.

Verrà avviata la procedura guidata di compensazione. Quando richiesto, selezionare i file di dati per i singoli controlli colore per aggiungerli. Fare clic su Avanti nella procedura guidata seguendo le istruzioni fino a quando il file della matrice di compensazione non viene salvato e caricato nella casella nel passaggio due della procedura guidata di internalizzazione.

Fare clic su Avanti e seguire le istruzioni fino a generare un file DAF. Impostare le proprietà di visualizzazione dell'immagine selezionando i canali dell'immagine utilizzati durante l'acquisizione. Fare clic sul canale due per FITC e sul canale cinque per AF six 60.

Il campo chiaro e la dispersione laterale sono selezionati per impostazione predefinita. Selezionare il canale O-campo chiaro per creare il confine cellulare e il canale O2 in cui sono state raccolte nanoparticelle o batteri per la sonda internalizzante per definire la popolazione di singole cellule, viene generato un grafico a dispersione dell'area del campo chiaro rispetto al rapporto d'aspetto del campo chiaro di tutte le cellule. L'analisi ad alta velocità di trasmissione di più file di dati richiede un file modello, pertanto è di fondamentale importanza definire attentamente i gate durante la creazione di un file modello.

Ogni punto rappresenta i valori di una singola immagine di cella. Fare clic su un singolo. in un grafico per selezionare l'immagine di quella particolare cella nella galleria di immagini.

Quindi, disegna un cancello attorno alle celle con l'area e le proporzioni che corrispondono agli eventi di una singola cella. Le celle singole hanno un rapporto d'aspetto di primo round e doppietti. Avere un rapporto d'aspetto di circa 0,5.

Fare clic su più celle per distinguere tra la regione contenente singole celle rispetto a doppietti o detriti. Per generare un istogramma del gradiente di campo chiaro, la radice significa il quadrato dell'immagine in campo chiaro. Fare clic sul pulsante successivo.

Quindi, nella scheda Popolazione, selezionare l'opzione Contenitore per visualizzare il contenitore selezionato. Fare clic sui contenitori per determinare dove le celle e concentrarsi al meglio. Inizia e disegna una regione di linea per le celle focalizzate sull'andatura.

Più alto è l'RMS del gradiente, migliore è la messa a fuoco, salta il passaggio successivo a meno che non ci siano altre macchie su cui bloccare. Viene generato un nuovo grafico a dispersione dell'intensità del canale due sull'asse x rispetto al pixel massimo del canale due sull'asse Y. Clicca sui punti e visualizza le immagini per aiutare a determinare la regione da disegnare attorno alle cellule che sono positive per nanoparticelle o batteri.

Viene generato un istogramma della funzione di internalizzazione con una regione che inizia da zero, che dovrebbe essere regolata osservando le immagini. La caratteristica di internalizzazione è un rapporto tra l'intensità all'interno della cellula e l'intensità dell'intera cellula. Viene scalato in modo tale che a un valore di zero la metà dell'intensità sia all'interno.

La procedura guidata ha creato una regione di ogni cella che designa l'interno creando una maschera che viene utilizzata, l'input dell'immagine della cella per trovare la superficie della cella e l'ha erosa di quattro pixel. Si noti che questa maschera può essere regolata manualmente per diversi tipi di cella, quando necessario, creando prima una maschera di oggetto sull'immagine in campo chiaro ed erosandola di più o meno pixel. La funzione di internalizzazione viene calcolata in base a questa maschera di oggetto eroso utilizzando un algoritmo nel software.

Questa funzione ci permette di distinguere le particelle internalizzate e i batteri che hanno la maggior parte del loro segnale fluorescente all'interno del confine della maschera dalle particelle legate alla superficie e i batteri, che hanno la maggior parte del loro segnale fluorescente al di fuori del confine della maschera, come mostrato in questo esempio, creano un nuovo istogramma con una nuova funzione di internalizzazione basata sulla maschera dell'oggetto eroso. Disegna una regione da controllare sulle celle internalizzate visualizzando le immagini nella modalità bin selezionata. Imposta il cancello su 0.3.Qui.

Le celle con un punteggio inferiore a 0,3 sono considerate celle positive per particelle legate alla superficie. Per eliminare le cellule con l'etichettatura di sfondo e per identificare specifiche nanoparticelle o batteri internalizzati, scegliere le funzioni dal menu di analisi. Fare clic sul menu di analisi.

Quindi fare clic sulla funzione di conteggio spot accanto per aggiungere il conteggio spot medio al report delle statistiche. Nel menu dei rapporti, fare clic sull'icona dei rapporti. Quindi definisci il report delle statistiche, quindi aggiungi le colonne, quindi seleziona la popolazione di celle appropriata.

Fare clic su OK. La procedura guidata di internalizzazione aggiungerà automaticamente le statistiche a questo report per salvare il file di dati come file modello da utilizzare per l'analisi batch di tutti i file sperimentali. Fare clic sul menu file e selezionare Salva come modello.

File modello. Avere l'estensione dot AST per analizzare più file di dati nel software idea. Fare clic su Strumenti e selezionare i file di dati batch e inserire tutti i file RIF.

Aggiungere il file della matrice di compensazione e il file del modello nelle sezioni corrispondenti per inviare il batch per l'elaborazione, fare clic su Invia. Dopo la fase di elaborazione, tutti i file RAF vengono analizzati e vengono generati i file DAF per ciascuno dei singoli file raw. Viene generato un rapporto finale con le statistiche per tutti i campioni per confrontare l'effetto dell'inibizione dell'actina e della bassa temperatura sulla fagocitosi della salmonella e delle nanoparticelle.

RA W2 64,7 cellule sono state incubate a 37 gradi Celsius in terreno, con o senza cytoklain D o incubate in terreno a quattro gradi Celsius. Sia la temperatura che le manipolazioni dell'actina hanno ridotto l'internalizzazione sia delle nanoparticelle che della salmonella. Tuttavia, l'incubazione delle cellule in cito e D aumenta la percentuale di cellule con nanoparticelle legate alla superficie, diminuendo la percentuale di cellule con salmonella legata alla superficie.

La percentuale di cellule positive per le nanoparticelle legate alla superficie aumenta da circa l'8% a 37 gradi Celsius a oltre il 35% dopo il trattamento con cito e D o quattro gradi Celsius. Al contrario, la percentuale di cellule con salmonella legata alla superficie è stata ridotta dal 35% al 15% Dopo il trattamento con cito e D, l'incubazione di cellule RA W2 64,7 con salmonella a quattro gradi Celsius, ha diminuito l'internalizzazione senza un apparente aumento della quantità di batteri legati alla superficie rispetto al controllo a 37 gradi Celsius. Insieme, questi dati dimostrano che la salmonella e le nanoparticelle sono internalizzate da un processo cellulare simile che richiede actina ed è dipendente dalla temperatura.

Inoltre, i dati indicano che l'attaccamento prolungato della salmonella ai macrofagi richiede la polimerizzazione dell'actina. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare l'internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri mediante citometria a flusso con imaging multispettrale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che gli inibitori sono citotossici.

Pertanto, sono necessari precedenti esperimenti di profilazione della citotossicità per determinare le concentrazioni ottimali da utilizzare. Non dimenticare che lavorare con la salmonella può essere pericoloso prendere precauzioni, come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati ed evitare la creazione di aerosol quando si esegue questa procedura.