Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare campioni biologici intatti marcati in fluorescenza senza sezionamento istologico. Ciò si ottiene mediante incubazione sequenziale di tessuti fissati in solventi organici fino a raggiungere una piena trasparenza. Come secondo passo.

I tessuti trasparenti vengono riprodotti in 3D utilizzando un microscopio a scansione laser. Successivamente, i risultati dell'imaging vengono analizzati e le strutture neuronali nel midollo spinale e nel cervello non sezionati possono essere ricostruite in 3D dalle tre immagini della discoteca raccolte. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze su come mappare le connessioni neuronali e GAL nell'intero cervello e nel midollo spinale.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della neurodegenerazione poiché ora possiamo visualizzare l'integrità neurale in tutto il sistema nervoso. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione del sistema nervoso, può essere applicato anche ad altri organi come il polmone o il tessuto tumorale. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede solo poche ore per piccoli organi come il midollo spinale o il polmone, e circa uno o due giorni per il cervello Inizia la procedura aggiungendo due o tre millilitri di 50% THF appena preparato a una fiala di vetro per tessuto raccolto.

Quindi trasferire gli organi fissati nella soluzione di chiarificazione e chiudere saldamente i flaconcini. Posizionare le fiale su un rotatore e coprirle con un foglio di alluminio, agitando i campioni per il tempo opportuno a una velocità costante di 30 giri/min. Quindi rimuovere la soluzione di chiarificazione e utilizzare un nuovo PE o una pipetta per sospendere il tessuto nella soluzione successiva.

Come indicato nella tabella durante la fase finale di chiarifica, mantenere i campioni in soluzione fino a quando non diventano completamente trasparenti per la microscopia multifotone o confocale. Non appena si ottiene una pulizia completa, montare il campione su un vetrino di imaging a tale scopo. Usa il cemento dentale per fare un bordo attorno al tessuto.

Riempire la piscina con la soluzione di pulizia finale appena prima che il cemento dentale diventi completamente rigido, quindi posizionare immediatamente il campione purificato al centro della piscina e coprirlo con un vetro di copertura. Premere il vetro di copertura fino a quando non è completamente sigillato dal cemento dentale e tocca la superficie dell'organo pulito per la microscopia a foglio di luce non appena si ottiene una pulizia completa, quindi ruotare manualmente la vite del supporto del campione per fissare il campione. Quindi, immergere il campione nella camera di imaging del microscopio a foglio ottico riempito con la soluzione di pulizia finale appropriata per il tessuto visualizzato.

Quindi raccogli le scansioni Z che coprono l'intero tessuto pulito alla migliore risoluzione che il microscopio può fornire, ingrandendo le regioni di interesse per raccogliere immagini a risoluzione più elevata. Dopo aver raccolto le immagini, caricare la serie di immagini nel software Amira con il modulo resolve RT. Quando la serie è stata caricata, inserisci le dimensioni corrette dei voxel nella finestra dei parametri di lettura dell'immagine e fai clic su OK.

Quindi, selezionare l'applicazione secondaria della vista multiplanare. Quindi utilizzare i cursori primari e di spessore per scegliere lo spessore di proiezione e la soglia ottimali per i valori di grigio. Infine, utilizza il modulo angolo di ritaglio per sfogliare le fette con diversi orientamenti 3D.

Per visualizzare i campioni, mappare l'organizzazione strutturale dei neuroni è estremamente importante per capire come funzionano in salute e in malattia. Mentre tre disco può essere impiegato su vari organi, è quindi particolarmente utile per tracciare lunghe connessioni neuronali nel midollo spinale e nel cervello. Ad esempio, utilizzando scansioni al microscopio ultra di grandi segmenti di midollo spinale chiariti, le connessioni assonali possono essere seguite per centimetri nel midollo spinale del roditore, come illustrato in queste immagini.

In modo simile, l'intero cervello del topo e l'ippocampo ripuliti possono essere visualizzati per seguire le connessioni neuronali nel cervello. Quando si utilizza la microscopia confocale o multifotone, la risoluzione dell'imaging può essere notevolmente migliorata, soprattutto nella dimensione Z. Ad esempio, l'imaging multi-fotone di midollo spinale cancellato da topi della linea GFPM consente di ottenere un'immagine senza soluzione di continuità per l'intera profondità da 1,5 a due millimetri del midollo spinale.

La microscopia confocale sul midollo spinale liberato offre una risoluzione migliore in modo simile. L'imaging al microscopio multifotonico di cervelli puliti fornisce immagini ad altissima risoluzione per visualizzare i dettagli fini delle strutture neuronali, comprese le spine dendritiche. I campioni per tre disco possono essere etichettati in vari modi.

Ad esempio, è possibile marcare l'intera vascolarizzazione del cervello e del midollo spinale utilizzando traccianti fluorescenti coniugati con lectine, che possono essere utilizzati per studiare la barriera ematoencefalica in salute e malattia. Utilizzando tre discoteche, è possibile visualizzare anche cellule più piccole in tessuti di grandi dimensioni. Ad esempio, sia la microglia che gli astrociti sono altamente implicati nella patologia della neurodegenerazione, tra cui il morbo di Alzheimer e le lesioni traumatiche.

Utilizzando tre discoteche, è possibile studiare la loro densità e distribuzione nel midollo spinale. È possibile visualizzare anche tessuti non neuronali. Ad esempio, le cellule Clara nell'intero polmone dei roditori possono essere immunomarcate con anticorpi e sottoposte a imaging senza sezionamento a livello di singola cellula.

Allo stesso modo, è possibile eliminare e visualizzare le cellule nel tessuto pancreatico non autorizzato. Ad esempio, le cellule alfa marcate in fluorescenza vengono visualizzate dopo la pulizia in queste immagini del pancreas. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché, sebbene le fasi di cancellazione e imaging siano semplici, l'analisi dei dati può essere complicata.

Durante l'applicazione di questa procedura, è importante eseguire l'imaging dei tessuti trasparenti non appena si ottiene la completa trasparenza perché il segnale fluorescente si degraderà nel tempo nella soluzione di pulizia. Lo sviluppo di questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare dettagli e organi intatti, come la mappatura delle reti neuronali nel cervello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come chiarire e visualizzare le strutture cellulari e subcellulari in tutti gli organi, e successivamente visualizzarle e analizzarle.