Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere immagini di campioni biologici interi marcati con fluorescenza, senza ricorrere alla sezione istologica. Questo risultato si ottiene mediante incubazione sequenziale di tessuti fissati in solventi organici fino al raggiungimento di una trasparenza completa. Come secondo passaggio.

I tessuti trasparenti vengono acquisiti in 3D mediante un microscopio a scansione laser. Successivamente, i risultati dell'acquisizione vengono analizzati e le strutture neuronali nel midollo spinale e nel cervello non sezionati possono essere ricostruite in 3D a partire dalle immagini raccolte di tre dischi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze riguardo al modo di mappare le connessioni neuronali e GAL nell'intero cervello e midollo spinale.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della neurodegenerazione, poiché ora possiamo visualizzare l'integrità neuronale in tutto il sistema nervoso. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione del sistema nervoso, può essere applicato anche ad altri organi come il polmone o il tessuto tumorale. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica richiede solo poche ore per organi di piccole dimensioni come il midollo spinale o il polmone, e circa uno o due giorni per il cervello. Iniziare la procedura aggiungendo due o tre millilitri di THF al 50% appena preparato a un vial di vetro per ogni tessuto raccolto.

Quindi trasferire gli organi fissati nella soluzione di chiarificazione e chiudere accuratamente le provette. Posizionare le provette su un agitatore rotante e coprirle con carta d'alluminio, mescolando i campioni per il tempo appropriato a una velocità costante di 30 giri al minuto. Successivamente, rimuovere la soluzione di chiarificazione e utilizzare una nuova pipetta in polietilene o una pipetta per sospendere il tessuto nella soluzione successiva.

Come indicato nella tabella durante l'ultimo passaggio di chiarificazione, mantenere i campioni in soluzione fino a quando non diventano completamente trasparenti per la microscopia a fotoni multipli o confocale. Non appena si raggiunge una chiarificazione completa, montare il campione su un vetrino per l'analisi. Utilizzare del cemento dentale per creare un bordo intorno al tessuto.

Riempire la vaschetta con la soluzione di chiarificazione finale subito prima che il cemento dentale diventi completamente rigido, quindi posizionare immediatamente il campione chiarificato al centro della vaschetta e coprirlo con un vetrino. Premere il vetrino fino a quando non sia completamente sigillato dal cemento dentale e aderisca alla superficie dell’organo chiarificato per la microscopia a foglio luminoso; non appena si raggiunge una chiarificazione completa, montare il campione e ruotare manualmente la vite del portacampioni per fissarlo. Successivamente, immergere il campione nella camera di acquisizione del microscopio a foglio luminoso riempita con la soluzione di chiarificazione finale appropriata per il tessuto in esame.

Quindi, acquisire scansioni Z che coprono l'intero tessuto chiarificato alla massima risoluzione possibile offerta dal microscopio, ingrandendo le regioni di interesse per acquisire immagini ad alta risoluzione. Dopo aver acquisito le immagini, caricare la serie di immagini nel software Amira con il modulo resolve RT. Una volta caricata la serie, inserire le dimensioni corrette del voxel nella finestra dei parametri di lettura dell'immagine e fare clic su OK.

Successivamente, selezionare l'applicazione secondaria per la vista multiplanare. Quindi utilizzare i cursori principale e dello spessore per scegliere lo spessore di proiezione e la soglia ottimali per i valori di grigio. Infine, utilizzare il modulo dell'angolo di ritaglio per esaminare le sezioni in diverse orientazioni 3D.

Per visualizzare i campioni, mappare l'organizzazione strutturale dei neuroni è estremamente importante per comprendere il loro funzionamento in condizioni fisiologiche e patologiche. Mentre il metodo three disco può essere impiegato su diversi organi, risulta particolarmente utile per tracciare le connessioni neuronali lunghe nel midollo spinale e nel cervello. Ad esempio, utilizzando scansioni di microscopia ultravelocizzata di ampi segmenti di midollo spinale trasparentizzati, le connessioni assonali possono essere seguite per centimetri nel midollo spinale di roditore, come illustrato in queste immagini.

In modo analogo, l'intero cervello di topo trasparentizzato e l'ippocampo possono essere sottoposti a imaging per seguire le connessioni neuronali nel cervello. Quando si utilizza la microscopia confocale o a fotoni multipli, la risoluzione dell'imaging può essere notevolmente migliorata, specialmente nella dimensione Z. Ad esempio, l'imaging a fotoni multipli di midolli spinali trasparentizzati da topi della linea GFPM consente di ottenere un'immagine continua lungo tutta la profondità del midollo spinale, che va da 1,5 a due millimetri.

La microscopia confocale sul midollo spinale trasparentizzato fornisce una risoluzione migliorata in modo analogo. L'immagine ottenuta mediante microscopia a due fotoni di cervelli trasparentizzati consente di ottenere immagini ad altissima risoluzione per visualizzare i dettagli fini delle strutture neuronali, inclusi gli spine dendritici. I campioni per tre disco possono essere marcati in vari modi.

Ad esempio, è possibile etichettare l'intera vascolarizzazione del cervello e del midollo spinale utilizzando traccianti fluorescenti coniugati con lectine, che possono essere impiegati per studiare la barriera emato-encefalica in condizioni fisiologiche e patologiche. Utilizzando tre disco, è inoltre possibile osservare cellule più piccole all'interno di tessuti di grandi dimensioni. Ad esempio, sia la microglia che gli astrociti sono fortemente coinvolti nella patologia della neurodegenerazione, inclusa la malattia di Alzheimer e lesioni traumatiche.

Utilizzando tre disco, è possibile studiare la loro densità e distribuzione nel midollo spinale. È anche possibile acquisire immagini di tessuti non neuronali. Ad esempio, le cellule di Clara in tutti i polmoni dei roditori possono essere marcate mediante immunomarcatura con anticorpi e visualizzate senza sezionamento a livello di singola cellula.

In modo analogo, è possibile chiarire e acquisire immagini di cellule nel tessuto pancreatico non sottoposto a trattamento. Ad esempio, le cellule alfa marcate con fluorescenza vengono acquisite dopo il chiarimento in queste immagini pancreatiche. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché, sebbene i passaggi di chiarimento e acquisizione siano semplici, l'analisi dei dati può risultare complessa.

Durante l'applicazione di questa procedura, è importante acquisire immagini di tessuti trasparenti non appena si raggiunge la trasparenza completa, poiché il segnale fluorescente si degraderà nel tempo nella soluzione di chiarificazione. Lo sviluppo di questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare nei dettagli organi intatti, come la mappatura delle reti neuronali nel cervello. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come chiarificare e acquisire immagini di strutture cellulari e subcellulari in organi interi, e successivamente visualizzarle e analizzarle.