Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo
30 giugno 2016
Le tecniche di pulizia ottica stanno rivoluzionando il modo in cui i tessuti vengono visualizzati. In questo rapporto descriviamo le modifiche del protocollo originale Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Acrylamide-hybridized Imaging compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) che produce risultati più coerenti e meno costosi.
L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare delle modifiche al protocollo CLARITY originale, che producono risultati più riproducibili ed economicamente vantaggiosi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nelle neuroscienze, come la morfologia tridimensionale e la connettività nel sistema nervoso centrale. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel miglioramento della riproducibilità della chiarificazione ottica e della microscopia nel sistema nervoso centrale del topo.
In modo economico e riproducibile. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la costruzione della camera di imaging è complessa e non immediatamente evidente a partire da una descrizione scritta.
Ottenere il tessuto cerebrale e del midollo spinale fissato con paraformaldeide da topi esprimenti proteine fluorescenti. Emisecare il cervello posizionandolo in una matrice plastica per cervello di topo e tagliando lungo la linea mediana con una lama apposita. Aggiungere ciascun emisfero e il midollo spiniale a tubi centrifughi separati da 50 millilitri.
Ciascuno contenente 40 millilitri di soluzione di idrogel. Coprire i tubi con pellicola di alluminio per proteggere i fluorocromi. Incubare quindi i tubi contenenti i campioni e l'idrogel a quattro gradi Celsius con agitazione delicata per sette giorni.
Trascorso il periodo di incubazione, scartare 25 millilitri di idrogel lasciando il campione e circa 25 millilitri di idrogel nel tubo da centrifuga. Successivamente, deossigenare il campione rimuovendo il tappo, posizionando il tubo da centrifuga in un barattolo disidratatore e collegando il barattolo a una pompa a vuoto. Applicare il vuoto per almeno 10 minuti.
Agitare delicatamente per rimuovere le bolle di ossigeno emesse. Dopo 10 minuti, sostituire il vuoto nel barattolo del desiccante con gas azoto al 100% nell'arco di due o tre minuti. Una volta che la pressione si è equalizzata e il coperchio del barattolo del desiccante può essere aperto, chiudere rapidamente il tubo per evitare la re-introduzione di ossigeno.
Successivamente, polimerizzare l'idrogel ponendo il tubo con il campione in un bagno d'acqua a 37 gradi celsius per tre ore, fino al completamento della polimerizzazione. Dopo tre ore, l'idrogel polimerizzato assumerà una consistenza simile a quella di un gel. Utilizzare una spatola per rimuovere il campione polimerizzato dal tubo centrifuga, quindi tagliare l'eccesso di idrogel intorno al campione.
Infine, rimuovere l'idrogel residuo posizionando il campione su un panno privo di pelucchi e strofinando delicatamente il tessuto, arrotolandolo su di esso, in modo da lasciare solo uno strato sottile di idrogel polimerizzato sul campione. Per iniziare il processo di rimozione dei lipidi, trasferire il campione polimerizzato in un tubo da centrifuga pulito da 50 millilitri contenente 45 millilitri di buffer di chiarificazione, e incubare a 45 gradi Celsius con agitazione delicata per sette giorni. Cambiare il buffer ogni giorno durante questo periodo iniziale di sette giorni versando il buffer di chiarificazione usato in un contenitore per rifiuti chimici.
Aggiungere 45 millilitri di buffer di chiarificazione fresco. Una volta che tutti i lipidi sono stati solubilizzati e il tessuto ha raggiunto la trasparenza, trasferire il campione in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri riempito con 45 millilitri di PBST e lavare quattro volte a 40 gradi Celsius con agitazione delicata nell'arco delle successive 24 ore, per rimuovere l'SDS residuo. Dopo l'ultimo lavaggio con PBST, trasferire il campione in un tubo da centrifuga pulito da 15 millilitri contenente DAPI ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro in 1xPBST.
Avvolgere con carta stagnola e incubare a temperatura ambiente per 24 ore. Il giorno successivo, lavare tre volte in PBST a temperatura ambiente, per almeno sei ore per ogni lavaggio. Procedere quindi al matching dell'indice di rifrazione.
Per iniziare questa parte della procedura, trasferire il campione in un tubo da centrifuga pulito da 15 millilitri contenente 2-2 tiodeietanolo e PBS 1x a pH 7,5 e incubare come mostrato a schermo. Verso la fine della seconda incubazione, creare una camera per imaging arrotolando un pezzo di adesivo riutilizzabile in un cilindro con diametro uniforme leggermente superiore allo spessore del campione. Posizionare il cilindro in un cerchio aperto su una piastra da 40 millimetri con fondo in vetro.
Quindi utilizzare una punta per pipetta P1000 per creare un sigillo tra l'adesivo riutilizzabile e il vetro, facendola rotolare lungo il bordo esterno del cilindro. Pipettare circa 100 microlitri di TDE al 63% sulla piastra di vetro e distribuirli per coprire la superficie di vetro all'interno del cerchio formato dall'adesivo riutilizzabile. Successivamente, utilizzare una spatola per posizionare con attenzione il campione al centro del cerchio, avendo cura di non formare bolle d'aria.
Successivamente, pipettare altri 100 microlitri di TDE al 63% direttamente sul campione e posizionare immediatamente una copertura circolare da 40 millimetri sopra l'adesivo riutilizzabile. Utilizzare l'indice, il medio e l'anulare di entrambe le mani per premere con attenzione lungo il perimetro del cerchio finché la copertura non entra in contatto con il campione. Ora, portare lentamente la piastra con fondo in vetro in posizione verticale appoggiandola contro una superficie, quindi aggiungere TDE al 63% con una pipetta fino a quando la soluzione raggiunge l'apertura superiore.
Utilizzare un panno privo di pelucchi per asciugare la punta della pipetta in modo che la soluzione non goccioli sul vetro. Infine, aggiungere l'elastomero di silicone all'apertura piccola per chiudere il cerchio e creare una camera chiusa. Attendere cinque minuti affinché si asciughi, quindi procedere all'acquisizione delle immagini.
Posizionare la camera di imaging con il campione al suo interno sul piatto di un microscopio confocale a scansione laser. Aprire il software di imaging, accendere il laser di eccitazione all'argon cliccando sulla scheda di configurazione nella parte superiore del programma, quindi sull'icona del laser. Selezionare la casella accanto all'argon per alimentare il laser e spostare la scala del cursore al 30%. Tornare alla scheda di acquisizione nella parte superiore.
Nella casella delle impostazioni del percorso del fascio, accedere alla casella di caricamento/salvataggio delle impostazioni e selezionare dal menu a discesa il canale di lunghezza d'onda appropriato per emettere YFP. Nella casella delle impostazioni del canale, selezionare gli obiettivi appropriati per l'acquisizione immagini cliccando sul collegamento ipertestuale rosso denominato obiettivo corrente. Utilizzare obiettivi con una distanza di lavoro maggiore rispetto allo spessore del tessuto.
Un'ampia apertura numerica per massimizzare la risoluzione dell'immagine nel piano e per ridurre al minimo lo spessore della sezione ottica. Nella colonna a sinistra dei menu a discesa, aprire la finestra della risoluzione XY per impostare la matrice di acquisizione, denominata formato, su 1024x1024 o su un valore appropriato per il limite di risoluzione laterale dell'obiettivo. Impostare il fattore di ingrandimento il più basso possibile.
Viene utilizzato qui 1,7. Nella stessa finestra, impostare la media di otto linee e la media di un fotogramma selezionando le voci corrispondenti nei menu a discesa opportunamente etichettati. Individuare il campione utilizzando i controlli dello stage.
Una volta che un campo rappresentativo è visibile, impostare il guadagno tra 760 e 780 e l'offset tra 1,0 e 1,5 per YFP. Selezionare la scansione a tasselli. Quindi impostare i limiti superiore e inferiore dello stack Z da acquisire.
Impostare lo spessore della sezione ottica in base al limite di risoluzione della sezione ottica dell'obiettivo e quindi avviare l'acquisizione. Questa immagine mostra neuroni positivi per YFP nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo, acquisiti con un ingrandimento di 5x e ricostruiti in 3D. La barra della scala rappresenta un millimetro.
Questa proiezione dell'intensità massima di uno stack di immagini 10x della corteccia cerebrale mostra l'arborizzazione dendritica dei neuroni piramidali del quinto strato corticale. Qui la barra della scala rappresenta 100 micron. Qui l'espressione di THY-1YFP è mostrata in un midollo spinale cervicale e toracico intatto, acquisito con un ingrandimento 5x e ricostruito in 3D.
La barra della scala rappresenta due millimetri. Infine, questa proiezione dell'intensità massima di uno stack di immagini acquisite a 10x del midollo spinale mostra assoni individuali; le barre della scala rappresentano 100 micron. Se eseguita correttamente, questa tecnica può essere completata in due-quattro settimane per midolli spinali interi e in quattro-sei settimane per emisferi cerebrali emisecati.
Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'immunostoricchimica per rispondere a domande che richiedono un fenotipaggio biochimico più complesso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come rendere trasparente e acquisire immagini del sistema nervoso centrale di un topo. Utilizzando la tecnica di trasparenza passiva e la microscopia confocale a laser.
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Panoramica
Questo rapporto illustra le modifiche apportate al protocollo CLARITY originale, migliorando la coerenza e la convenienza economica delle tecniche di chiarificazione ottica. Questi progressi sono fondamentali per la visualizzazione dei tessuti nella ricerca neuroscientifica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immagini ottiche
- Tecniche di chiarificazione dei tessuti
Sfondo
- Le tecniche di chiarificazione ottica migliorano la visualizzazione dei tessuti.
- Il protocollo CLARITY è ampiamente utilizzato per l'imaging nelle neuroscienze.
- Le modifiche mirano a migliorare la riproducibilità e ridurre i costi.
- Le dimostrazioni visive sono essenziali per comprendere metodi complessi.
Scopo dello studio
- Illustrare modifiche al protocollo CLARITY.
- Ottenere risultati più uniformi nella chiarificazione ottica.
- Fornire un metodo economico per la ricerca in neuroscienze.
Metodi Utilizzati
- Modifiche al protocollo CLARITY originale.
- Dimostrazioni visive della costruzione della camera di imaging.
- Applicazione nel sistema nervoso centrale del topo.
- Concentrazione sull'analisi della morfologia e della connettività in 3D.
Risultati principali
- Maggiore coerenza nella chiarificazione ottica.
- Metodologia economica per i ricercatori.
- Potenziamento delle capacità di imaging nelle neuroscienze.
- Supporti visivi forniti per procedure complesse.
Conclusioni
- Le modifiche al protocollo CLARITY sono vantaggiose.
- Risultati coerenti possono far progredire la ricerca in neuroscienze.
- Le dimostrazioni visive facilitano la comprensione di metodi complessi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Le tecniche di chiarificazione ottica come CLARITY passivo permettono la visualizzazione tridimensionale di tessuto nervoso integro, risolvendo un collo di bottiglia fondamentale nella validazione degli obiettivi in neuroscienze, dove la sezione seriale introduce artefatti che compromettono l'analisi morfologica e delle connettività. Migliorando la coerenza e riducendo i costi, questo metodo supporta modellazioni precliniche affidabili delle malattie del sistema nervoso centrale, aumentando la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta. L'approccio facilita la riduzione del rischio meccanicistico consentendo l'osservazione diretta di fenotipi strutturali in sistemi rilevanti per la malattia, senza artefatti dovuti alla deformazione del tessuto.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante lo studio della morfologia e della connettività tridimensionali integre nel sistema nervoso centrale del topo.
- Valore operativo: Offre una riduzione del rischio biologico preservando l'integrità del tessuto e rimuovendo i lipidi che disperdono la luce, consentendo un'immagine nitida.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio generando dati strutturali quantitativi sulle reti neuronali per la validazione degli obiettivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi rendendo i tessuti trasparenti e adatti all'immagine ad alta risoluzione.
- Riproducibilità: Affronta la standardizzazione dei saggi attraverso modifiche passive del metodo CLARITY che migliorano la coerenza nei risultati di chiarificazione.
- Riutilizzo della piattaforma: Permette la valutazione scalabile di composti creando camere di imaging riutilizzabili compatibili con la microscopia confocale a scansione laser.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Supporta l'allineamento traslazionale dei biomarcatori consentendo l'imaging longitudinale dei cambiamenti strutturali in modelli integri di midollo spinale e cervello.
- Continuità preclinica: Collega la fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo letture strutturali tridimensionali applicabili agli studi sulla progressione delle malattie.
- Decisioni basate sul rischio: Facilita le decisioni di avanzamento fornendo dati chiari sulla morfologia assonale e dendritica per la riduzione del rischio meccanicistica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'Early Discovery all'identificazione del lead fino al lavoro preclinico, supportando in particolare la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nella validazione degli obiettivi del sistema nervoso centrale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo l'imaging 3D della morfologia neuronale e delle connettività in tessuti CNS intatti di topo.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso la trasparenza del tessuto ottenuta mediante rimozione dei lipidi e abbinamento dell'indice di rifrazione con TDE.
- Analisi: Evidenzia risultati quantitativi come la ricostruzione 3D dei neuroni positivi per YFP, l'arborizzazione dendritica e il tracciamento assonale per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo biomarcatori strutturali in modelli CNS rilevanti per la malattia, senza artefatti da sezionamento.
- Riutilizzo aziendale: Presenta la tecnica come una capacità riutilizzabile grazie alla costruzione di una camera di imaging durevole mediante l'uso di adesivo riutilizzabile e piastre con fondo in vetro.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nell'analisi strutturale del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante modifiche al protocollo CLARITY passivo che eliminano la variabilità elettroforetica.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, fornendo dati strutturali tridimensionali affidabili per ridurre i rischi biologici in fase avanzata nei programmi sul sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio mediante imaging quantitativo delle reti neuronali per la validazione degli obiettivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in istologia, polimerizzazione di idrogel e tecniche di chiarificazione lipidica.
- Necessita di strumentazione come provette per centrifuga, bagni termostatici, desiccatori sotto vuoto e microscopi confocali a scansione laser.
- Richiede standardizzazione tra i gruppi di lavoro per lo scambio di tamponi, i passaggi di lavaggio e le procedure di adattamento dell'indice di rifrazione.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diversi sistemi modello, poiché i tempi variano da 2-4 settimane per i midolli spinali a 4-6 settimane per cervelli emisecionati.
- Presenta limitazioni pratiche, come la necessità di espressione di proteine fluorescenti o di immunomarcatura per la visualizzazione, e la necessità di manipolazione accurata per evitare la formazione di bolle durante l'allestimento della camera di imaging.
