Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare le modifiche al protocollo CLARITY originale, che producano risultati più coerenti ed economici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze, come la morfologia 3D e la connettività nel sistema nervoso centrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che migliora la coerenza della pulizia ottica e della microscopia nel sistema nervoso centrale del topo.

In modo economico e riproducibile. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché la costruzione della camera di imaging è complicata e non immediatamente evidente dalla descrizione scritta.

Ottenere tessuto cerebrale e del midollo spinale fissato con paraformaldeide da topi che esprimono proteine fluorescenti. Emisecta il cervello inserendolo in una matrice cerebrale di topo di plastica e tagliando lungo la linea mediana con una lama di matrice. Aggiungere ogni emisfero e midollo spinale per separare le provette da centrifuga da 50 millilitri.

Ciascuno contiene 40 millilitri di soluzione di idrogel. Coprire i tubi con un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori. E incubare le provette contenenti campioni e idrogel a quattro gradi Celsius con un leggero agitamento per sette giorni.

Dopo il periodo di incubazione, scartare 25 millilitri di idrogel in uscita dal campione e circa 25 millilitri di idrogel nella provetta da centrifuga. Quindi deossigenare il campione rimuovendo il tappo, posizionando la provetta da centrifuga in un barattolo essiccatore e collegando il barattolo a un vuoto. Applicare l'aspirapolvere per almeno 10 minuti.

Agitare delicatamente per rimuovere le bolle di ossigeno emesso. Dopo 10 minuti, sostituire il vuoto nel barattolo dell'essiccatore con azoto gassoso al 100% in due o tre minuti. Una volta che la pressione si è equalizzata e la parte superiore del vaso essiccatore può essere aperta, tappare rapidamente il tubo per evitare la reintroduzione di ossigeno.

Successivamente, polimerizzare l'idrogel posizionando la provetta con il campione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per tre ore fino al completamento della polimerizzazione. Dopo tre ore, l'idrogel polimerizzato assumerà una consistenza simile a quella di un gel. Utilizzare una spatola per rimuovere il campione polimerizzato dalla provetta da centrifuga, quindi tagliare l'idrogel in eccesso dal campione.

Infine, rimuovere l'idrogel rimanente posizionando il campione su una salvietta priva di lanugine e strofinando delicatamente e arrotolando il tessuto su di esso, lasciando solo un sottile strato di idrogel polimerizzato sul campione. Per iniziare il processo di rimozione dei lipidi, trasferire il campione polimerizzato in una provetta da centrifuga pulita da 50 millilitri con 45 millilitri di tampone di pulizia e incubare a 45 gradi Celsius con agitazione delicata per sette giorni. Sostituire il tampone ogni giorno durante questo periodo iniziale di sette giorni versando il tampone di compensazione usato in un contenitore per rifiuti chimici.

E aggiungendo 45 millilitri di tampone di pulizia fresco. Una volta che tutti i lipidi sono solubilizzati e il tessuto raggiunge la trasparenza, trasferire il campione in una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri riempita con 45 millilitri di PBST e lavare quattro volte a 40 gradi Celsius agitando delicatamente nelle successive 24 ore, per rimuovere la SDS residua. Dopo il lavaggio PBST finale, trasferire il campione in una provetta da centrifuga pulita da 15 millilitri riempita con un microgrammo per millilitro DAPI e 1xPBST.

Avvolgere con un foglio e incubare a temperatura ambiente per 24 ore. Il giorno successivo lavare tre volte in PBST a temperatura ambiente per almeno sei ore per lavaggio. E poi procedere alla corrispondenza dell'indice di rifrazione.

Per iniziare questa parte della procedura, trasferire il campione in una provetta da centrifuga pulita da 15 millilitri riempita con 2-2 tiodietanolo e 1xPBS a PH 7,5 e incubare come mostrato sullo schermo. Verso la fine della seconda incubazione, creare una camera di imaging arrotolando un pezzo di adesivo riutilizzabile in un cilindro con diametro uniforme appena maggiore dello spessore del campione. Appoggiare il cilindro in un cerchio aperto su un piatto di vetro da 40 millimetri.

Quindi utilizzare un puntale per pipetta P1000 per creare una tenuta tra l'adesivo riutilizzabile e il vetro facendolo rotolare attorno al bordo esterno del cilindro. Pipettare circa 100 microlitri di TDE al 63% sulla capsula di vetro e stenderlo per coprire la superficie del vetro all'interno del cerchio di adesivo riutilizzabile. Quindi utilizzare una spatola per posizionare con cura il campione al centro del cerchio facendo attenzione a non formare bolle.

Quindi, pipettare altri 100 microlitri di TDE al 63% direttamente sul campione e posizionare immediatamente un vetro di copertura circolare da 40 millimetri sopra l'adesivo riutilizzabile. Utilizzare l'indice, il medio e l'anulare di entrambe le mani per premere con cautela lungo il perimetro del cerchio fino a quando il vetro di copertura non entra in contatto con il campione. A questo punto, portare lentamente la capsula con fondo in vetro in posizione verticale appoggiata a una superficie, quindi aggiungere il 63% di TDE con una pipetta fino a quando la soluzione non raggiunge la piccola apertura in alto.

Utilizzare un panno privo di lanugine per asciugare il puntale della pipetta in modo che la soluzione non goccioli sul vetro. Infine, aggiungi l'elastomero siliconico alla piccola apertura per racchiudere il cerchio e creare una camera chiusa. Attendere cinque minuti per l'asciugatura, quindi procedere con l'imaging.

Posizionare la camera di imaging con il campione all'interno sul tavolino di un microscopio confocale a scansione laser. Aprire il software di imaging, per accendere il laser di eccitazione dell'argon, fare clic sulla scheda di configurazione nella parte superiore del programma, quindi sull'icona del laser. Seleziona la casella accanto ad argon per alimentare il laser e sposta la scala delle diapositive al 30%Torna alla scheda di acquisizione in alto.

Nella casella delle impostazioni del percorso del raggio, vai alla casella delle impostazioni di salvataggio del carico e seleziona il menu a discesa per selezionare il canale di lunghezza d'onda appropriato per emettere YFP. Nella casella delle impostazioni del canale, selezionare gli obiettivi appropriati per l'imaging facendo clic sul collegamento ipertestuale rosso con l'etichetta obiettivo oggetto corrente. Utilizzare obiettivi con una distanza di lavoro maggiore dello spessore del tessuto.

E un'ampia apertura numerica per massimizzare la risoluzione dell'immagine inplane e ridurre al minimo lo spessore della sezione ottica. Nella colonna di sinistra dei menu a tendina si apre la finestra di risoluzione XY per impostare la matrice di acquisizione, chiamata formato a 1024x1024 o un valore appropriato per il limite di risoluzione laterale dell'obiettivo. Impostare il fattore di zoom al livello più basso possibile.

1.7 è usato qui. Nella stessa finestra, imposta i parametri della media dell'ottava riga e della media di un fotogramma abbassando i menu etichettati individualmente di conseguenza. Individuare il campione utilizzando i controlli del tavolino.

Una volta che un campo rappresentativo è visibile, impostare il guadagno su un valore compreso tra 760 e 780 e l'offset tra 1,0 e 1,5 per YFP. Seleziona Scansione piastrelle. E poi imposta i limiti superiore e inferiore della pila Z da acquisire.

Impostare lo spessore della sezione ottica in base al limite di risoluzione della sezione ottica dell'obiettivo e quindi avviare l'acquisizione. Questa immagine mostra i neuroni YFP positivi nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo ripresi con un ingrandimento 5x e ricostruiti in 3D. La barra della scala rappresenta un millimetro.

Questa proiezione di massima intensità di una pila di immagini 10x della corteccia cerebrale dimostra l'aborizzazione dendritica dei neuroni piramidali dello strato corticale cinque. Qui la barra della scala rappresenta 100 micron. Qui l'espressione di THY-1YFP è mostrata in un midollo spinale cervicale e toracico intatto, ripreso con un ingrandimento 5x e ricostruito in 3D.

La barra della scala rappresenta due millimetri. Infine, questa proiezione di massima intensità di una pila di 10 immagini del midollo spinale, dimostra i singoli assoni, le barre della scala rappresentano 100 micron. Se eseguita correttamente, questa tecnica può essere eseguita in due o quattro settimane per l'intero midollo spinale e da quattro a sei settimane per i cervelli emisletti.

Seguendo questa procedura, altri metodi come la chimica immunosistica possono essere preformati per rispondere a domande che richiedono una fenotipizzazione biochimica più complessa. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come pulire otticamente e visualizzare il sistema nervoso centrale di un topo. Utilizzo della chiarezza passiva e della microscopia confocale laser.