Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona

Questo metodo può aiutare a migliorare la caratterizzazione su larga scala e ad alta risoluzione delle isoforme proteiche e delle modifiche post-trascizionali delle proteine nelle cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la spettrometria di massa dell'elettroforesi a zona capillare offre una separazione altamente efficiente e un rilevamento altamente sensibile di proteine intatte. Per pre-trattare il capillare, asciugarlo con gas azoto a 10 psi per almeno 12 ore.

Quindi, riempire il capillare con il 50% volume per volume di metacrilato di 3-propile in metanolo utilizzando una pompa per siringhe. Sigillare entrambe le estremità del capillare con gomma silicea. Dopo aver incubato a temperatura ambiente per almeno 24 ore, continuare con un rivestimento lineare in poliacrilammide sulla parete interna del capillare di separazione, come descritto nel protocollo di testo.

Bruciare una porzione del capillare utilizzando una fiamma delicata per rimuovere il rivestimento esterno in poliammide a circa quattro centimetri di distanza da un'estremità del capillare. Pulire delicatamente la porzione bruciata del capillare pulendo per rimuovere completamente il rivestimento in poliammide. Praticare un piccolo foro alla fine di un tubo da 200 microliter delle stesse dimensioni del diametro esterno capillare per mantenere sufficientemente il capillare in posizione una volta infilato attraverso questo foro.

Infilare l'estremità del capillare che è vicino alla porzione bruciata attraverso il foro fino a quando la porzione bruciata non è nel tubo. Quindi, aggiungere circa 150 microlitri di HF al tubo da 200 microlitri in modo che la soluzione HF sia circa a metà della porzione bruciata sul capillare. Incubare il capillare nella soluzione HF a temperatura ambiente per 90-100 minuti.

Preparare la miscela proteica standard e il campione E.coli come descritto nel protocollo di testo. Per impostare l'elettroforesi della zona capillare, o sistema CZE, caricare il campione, l'elettrolita di fondo e il capillare di separazione nell'autocampatore CZE. Selezionare il carico di esempio nella pagina di controllo manuale del campionatore automatico CZE.

Caricare il flaconcino elettrolita di sfondo nel vassoio tampone del campionatore automatico, notandone la posizione nel vassoio tampone. Quindi, caricare il flaconcino campione nel vassoio campione del campionatore automatico, notandone la posizione nel vassoio del campione. Posizionare il campionatore automatico nella posizione di allineamento utilizzando il controllo manuale.

Ora, caricare il capillare di separazione nell'autocampcampatore CZE utilizzando l'estremità non incisa del capillare. Regolare l'altezza dell'estremità di iniezione del capillare se il volume del campione è inferiore a 50 microlitri. Passare al campionatore automatico in standby utilizzando il controllo manuale.

Digitare la posizione del campione nel sistema e spostare il capillare nel campione. Spingere l'estremità di iniezione del capillare più in basso per raggiungere il fondo del flaconcino campione. Continuando a utilizzare il controllo manuale, sciacquare il capillare con l'elettrolita di fondo per 20 minuti utilizzando una pressione di 20 psi.

Ora, monta un'interfaccia commerciale a flusso di focaia pompata elettrocineticamente nella parte anteriore dello spettrometro di massa. Riempire il serbatoio del tampone di karifica con un tampone contenente il 10% di metanolo volume-volume e lo 0,2% di acido formico volume-volume in acqua di grado LCMS. Sciacquare la T nell'interfaccia con il tampone della tona attraverso l'applicazione manuale della pressione con una siringa.

Infilare l'estremità del diametro esterno di un millimetro di un emettitore elettrospray attraverso un tubo a maniche e collegare l'emettitore con una porta della T tramite un raccordo. Basta sciacquare manualmente la T con una siringa per riempire l'emettitore con il tampone della torcia. Regolare la distanza tra l'orifizio dell'emettitore e l'ingresso dello spettrometro di massa a circa due millimetri con l'aiuto della fotocamera che è arrivata con l'interfaccia.

Applicare una tensione da due a 2,2 kilovolt alla fiala tampone di sheath per elettrospray. Quindi, regolare la tensione di spruzzatura per raggiungere un elettrospray stabile. Applicare una bassa pressione all'estremità di iniezione del capillare durante questo processo per assicurarsi che non ci siano bolle nel capillare.

Spegnere la tensione di spruzzatura e infilare delicatamente l'estremità incisa del capillare di separazione attraverso la T nell'emettitore fino a quando non può essere spinta oltre. Dopo aver fermato la bassa pressione all'estremità di iniezione del capillare, sciacquare un po 'l'emettitore con tampone di torcia. Ancora una volta, applicare da due a 2,2 kilovolt di tensione di spruzzatura per testare lo spray.

Selezionate un nuovo metodo nel menu a discesa file nella schermata principale dello strumento. Lì, selezionare l'ingresso come flaconcino del campione iniziale, il flaconcino del campione finale, il vassoio come campione, la pressione come cinque psi, i kilovolt come zero e la durata come 95 secondi per un'iniezione del campione. Quindi, impostare l'ingresso come fiala di ingresso, vassoio come tampone, pressione come zero psi, kilovolt come 30 e durata come 4.200 secondi per la separazione del campione standard di miscela proteica.

Per la separazione del campione di proteoma E.coli, impostare l'ingresso come flaconcino di ingresso, vassoio come tampone, pressione come psi zero, kilovolt come 20 e durata come 6.600 secondi. Infine, selezionare l'ingresso come flaconcino di ingresso, vassoio come tampone, pressione come 10 psi, kilovolt come 30 e durata come 600 secondi per lo sciacquone capillare. Ora, imposta i parametri MS e MS /MS per l'analisi delle proteine intatte utilizzando uno spettrometro a maschera di trappola ionica quadrupla.

Per regolare le impostazioni del file di sintonizzazione, attivare la modalità proteina intatta e utilizzare una pressione di abbondanza pari a 0,2. Impostare la temperatura capillare di trasferimento ionico a 320 gradi Celsius e il livello RF dell'obiettivo S su 55. Per eseguire l'esperimento MS/MS CZE, avviare il metodo di acquisizione dei dati nel computer dello spettrometro di massa, selezionando innanzitutto la sequenza di esecuzione.

Quindi, avviare la sequenza di elettroforesi capillare sul computer autocampcampatore di elettroforesi capillare. Eseguire una ricerca nel database con TopPIC nella suite TopPIC e nell'interfaccia utente grafica TopPIC. Fare clic sul file di database e selezionare un database appropriato per la ricerca.

Fare clic sul file di spettro e selezionare l'ms2 generato. msalign generato come input. Selezionate il file di funzionalità MS1 e scegliete il file di funzionalità generato.

Impostare la cisteina carbamidometile C57 come modifica fissa a causa del trattamento con iodoacetamide. Selezionare la funzionalità del database di esca e, in Impostazioni di taglio, selezionare la velocità di individuazione falsa nel menu a discesa accanto al livello dello spettro. Impostare la velocità di individuazione falsa su 0,01 a livello di spettro.

Lasciare la funzione generatrice deselezionata e impostare la tolleranza di errore su 15 parti per milione. Impostare la velocità di individuazione false su 0,05 a livello di proteoforma. In Parametri avanzati, selezionate due per il numero massimo di spostamenti di massa nel menu a discesa.

Impostare lo spostamento massimo di massa di modifiche sconosciute su 500 dalton. Lasciare tutti gli altri parametri ai valori predefiniti e fare clic sul pulsante start in basso a destra dell'interfaccia utente grafica. Viene mostrato l'elettroferogramma rappresentativo per la miscela proteica standard.

La miscela proteica standard viene tipicamente eseguita almeno in duplice copia per valutare l'efficienza di separazione e la riproducibilità del sistema. L'efficienza di separazione può essere valutata con il numero di placche teoriche di alcune proteine. La riproducibilità può essere valutata dalle deviazioni standard relative dell'intensità proteica e del tempo di migrazione.

La piattaforma CZE MS/MS può essere utilizzata per la caratterizzazione su larga scala di proteoforme in vari proteomi complessi, identificando oltre 500 proteoformi e 190 proteine da un proteoma E.coli in una singola corsa ad alta confidenza. Qui, una vista ingrandita dell'elettroferogramma può essere utilizzata per valutare la finestra di separazione del sistema. Il bassissimo valore E e l'FDR spettrale suggeriscono l'elevata confidenza dell'ID proteoforme.L'elevato numero di ioni frammenti abbinati indica ulteriormente l'elevata confidenza dell'ID.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di infilare il capillare di separazione inciso nell'emettitore elettrospray lentamente e delicatamente.

L'etichettatura stabile degli isotopi o i metodi senza etichette possono essere incorporati nella procedura CZE MS per determinare come l'abbondanza proteoforme cambia nelle cellule in varie condizioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della proteomica dall'alto verso il basso per esplorare i ruoli delle proteoforme nella regolazione di vari processi biologici nelle cellule. Non dimenticare che lavorare con acido fluoridrico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come adeguati dispositivi di protezione individuale e avere procedure di emergenza in atto dovrebbero sempre essere prese quando si esegue questa procedura.