Name: High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine prodotte in E. coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Scopri il protocollo di screening ad alto rendimento per l'espressione e la purificazione di proteine solubili in E. coli utilizzando robot automatizzati. Questo metodo ottimizza la produzione di proteine ricche di disolfuro per la ricerca biotecnologica.

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Questo lavoro è stato supportato dal progetto VENOMICS, concessione progetto europeo N ° 278346 attraverso il Settimo programma quadro (7 ° PQ HEALTH 2011-2015). Il progetto VENOMICS è una collaborazione tra diversi istituti di ricerca e aziende in Europa: AFMB, Aix-Marseille Université (Francia), CEA Saclay (Francia), NZYTech (Portogallo), SistemasGenomicos (Spagna), Università di Liegi (Belgio), VenomeTech (Francia), Vitamib (Francia), Zealand Pharma (Danimarca) Questo lavoro è stato supportato dal Infrastructure francese per la Biologia Integrata strutturale (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il Sig. Jeremy Turchetto per aiutare con i preparativi per le riprese del video.

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<li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129(2012).</li>
<li>Katzen, F., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+formation+in+periplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Non esiste un protocollo universale unico per l&#39;espressione di, piegato, proteine ​​funzionali solubili. Per essere costi e in tempi rapidi, la maggior parte dei laboratori o strutture di base delle proteine ​​che lavorano con obiettivi multipli utilizzano quindi alta espressione della proteina Throughput Screening per trovare la migliore combinazione &#39;generico&#39; di variabili per ottenere una proteina solubile attivo per la maggior parte degli obiettivi. Abbiamo identificato DsbC come partner di fusione generalmente applicabile per l&#39;espressione solubile di peptidi e proteine ​​11 ricco di disolfuro. Uso fusioni DsbC e metodi high throughput, entro una settimana l&#39;espressione solubile di bersagli multipli può essere osservato 11 e poi ulteriori variabili, come quelli discussi nell&#39;introduzione, può essere proiettato nei turni successivi su quei bersagli che richiedono ulteriore ottimizzazione. I protocolli qui descritte sono finalizzate alla espressione di proteine ​​e peptidi ricchi di disolfuro. Tuttavia, per gli utenti che desiderano express proteine ​​non reticolari in un alto modo di throughput, i protocolli corrispondenti sono stati pubblicati in precedenza e può essere trovato altrove 22,24. La configurazione high throughput è ideale per una serie di applicazioni, tra cui lo screening di un gran numero di differenti proteine ​​di espressione solubile o lo screening di un gran numero di costrutti di espressione (compresi i tag vari fusione) per diversi geni bersaglio contemporaneamente ( o l&#39;espressione più costruisce per un singolo bersaglio) al fine di migliorare il tasso di successo. La piattaforma può essere utilizzato anche per l&#39;analisi comparativa e validazione di nuovi protocolli su un gran numero di bersagli. Altre applicazioni includono la proiezione di varianti per un singolo bersaglio difficile, ad esempio, tutti ortologhi o membri di una stessa famiglia, o per verificare il successo della produzione di un pannello di mutanti di un singolo bersaglio in un esperimento. Questo protocollo è stato utilizzato anche in combinazione con vettori co-espressione (spiritoh uno tagged proteine ​​solo) per consentire il pull down e caratterizzazione preliminare di complessi proteina-proteina seguita da un&#39;analisi più approfondita biofisica per confermare la corretta formazione complessa e stechiometria 33. La quantità di proteina purificata è talvolta indicato per micro-test (test funzionali, proteina-DNA 34 o proteina-proteina Prove di interazione). Ci sono diversi vantaggi per l&#39;high throughput screening strategia espressione: (i) la possibilità di testare un gran numero di bersagli o un gran numero di variabili in un singolo esperimento, (ii) limitata variazione da lotto a lotto, (iii) l&#39; semplicità e la facilità di lavorare ad una scala ridotta utilizzando profondi pozzi, (iv) la scalabilità e la riproducibilità su scala più ampia, (v) la possibilità per l&#39;automazione, e (vi) la semplicità di monitoraggio e di manutenzione (senza etichettatura dei singoli tubi, meno errori introdotti quando si utilizza il formato lastra che con la manipolazione di singoli tubi in miscela o scambio di cloni). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Sebbene non discusso nella sezione del protocollo, ci sono diverse considerazioni importanti per la preparazione dell &#39;esperimento che verrà discusso brevemente di seguito. Per una discussione più approfondita si veda il nostro precedente pubblicazione 24. Per la massima efficienza, è utile avere un sistema adeguato per la clonazione alto rendimento, per semplificare la sub-clonazione di un gran numero di obiettivi. Per la fase iniziale del progetto VENOMICS, utilizziamo il versatile sistema di ricombinazione Gateway 25 che permette subcloning in qualsiasi vettore destinazione ad un ritmo di centinaia di cloni settimana. Protocolli per Gateway clonazione ricombinazione possono essere trovati sul sito web di Invitrogen. Altre alternative per la clonazione throughput elevato includono legatura-indipendente clonazione (LIC) 35,36 e senza restrizioni (RF) clonazione 37. Ci sono diversi modi per ottenere i geni bersaglio per l&#39;espressione, anche mediante PCR da DNA stampo, da ingresso collezioni clone o comegeni sintetici, che è la strategia scelta per il progetto VENOMICS. Geni sintetici possono essere ordinati con siti di ricombinazione su ciascuna estremità della sintesi gene e gene permette una facile ottimizzazione codone della sequenza del gene bersaglio (per escludere rare codoni di E. coli). Questo è consigliato ma non indispensabile. Per obiettivi senza ottimizzazione codone che contengono un elevato numero di codoni rari, Rosetta 2 (DE3) pLysS (che svolge tRNA rare codoni che non sono espressi in E. coli) può essere più adatto di BL21 (DE3) pLysS. Mentre ci sono ceppi disponibili che limitano la riduzione dei legami disolfuro nell&#39;ambiente normalmente riducente del citoplasma, nelle nostre mani non hanno avuto successo come regolare E. coli ceppi 11. Bilancia analitica purificazione per affinità è eseguita dalle colture espressione prova al fine di recuperare le proteine ​​di fusione solubili e quantificare i rendimenti. I dati quantitativi possono essere ottenuti on the rese solubili di proteine ​​di fusione espresse in un intervallo di 0,1-100 mg / L di cultura. Se un bersaglio non è solubile, di espressione e induzione temperature, ceppi o media alternativi possono essere testati prima di diversi partner di fusione vengono perseguiti. Per l&#39;espressione solubile di proteine ​​ricche di disolfuro, abbiamo precedentemente in classifica l&#39;effetto di partner di fusione come DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-tag per l&#39;espressione citoplasmatica 11. Espressione periplasmatico è un&#39;altra possibilità che può aiutare la piegatura successo degli obiettivi ricchi di disolfuro. Periplasma è un ambiente meno riducendo del citoplasma e contiene chaperon redox utili che facilitano il legame solforico. DsbC, DsbA, e MBP proteine ​​sono normalmente localizzati nel periplasma dalle loro sequenze segnale periplasmatiche. Ciò fornisce la possibilità di sfruttare questi tag per dirigere gli obiettivi ricchi di disolfuro di spazio periplasmatico per assistere piegatura. Per gli obiettivi intrattabili, il passo successivo sarebbe quello di purify il insolubile obiettivo HIS-tagged dai corpi di inclusione, solubilizzare e ripiegare (questo è fuori della portata di questo protocollo e non sarà discusso qui 3 9). Questo può essere abbastanza semplice per gli obiettivi con solo uno o due legami disolfuro, ma diventa sempre più difficile quanto il numero di legami disolfuro aumenta. In alternativa, e in particolare per le proteine ​​e peptidi con quattro o più legami disolfuro, può essere utile per provare sistemi di produzione più complessi come lievito, di insetto o di espressione di mammifero. Con i progressi nella miniaturizzazione e l&#39;automazione, tecnologie HTP elettrofisiologia lab-on-a-chip 28 sarà senza dubbio la via del futuro per analisi funzionali. Prevediamo che per la maggior parte degli scopi (forse con l&#39;eccezione di studi strutturali) questo negare la necessità di colture su larga scala. Colture su piccola scala non sarà solo utile per lo screening delle condizioni di espressione, ma anche essere in grado di fornire sufciente quantità di campione per questi test funzionali miniaturizzati. La capacità di produrre più bersagli in parallelo in quantità sufficiente per la caratterizzazione funzionale ridurrà i costi di coltura ed utilizzando questi tipi di piattaforme, espressione e caratterizzazione di proteine ​​ricombinanti diventeranno più costo e tempo efficace. I protocolli qui sono state applicate alla espressione di peptidi e proteine ​​ricche di disolfuro nella fase iniziale del progetto FP7 europeo VENOMICS. Veleni sono una fonte eccellente di peptidi bioattivi che spesso hanno interessante potenziale farmacologico. Tuttavia, la loro produzione è impegnativo a causa dei loro complessi modelli di disolfuro di legame e di piccole dimensioni. Utilizzando piattaforme high-throughput come quello qui descritto, il progetto VENOMICS mira a generare una libreria di 10.000 nuovi peptidi veleno per riprodurre la diversità osservata in natura. Questa libreria verrà sfruttata per la caratterizzazione di disolfuro-rpeptidi ich con potenziale farmacologico o applicazioni terapeutiche con l&#39;obiettivo di sviluppare nuovi farmaci. La piattaforma è attualmente utilizzato per l&#39;analisi comparativa e convalidare nuovi protocolli per l&#39;uso nel progetto VENOMICS.

Motivati ​​dal progresso della genomica e accelerare il tasso di scoperta di nuove proteine, gasdotti ad alta velocità effettiva sono stati sviluppati per parallelizzare approcci tradizionali per lo screening e l&#39;identificazione di strategie ottimali di produzione di proteine. Potenziali variabili da ottimizzare includono, ma non sono limitati a, l&#39;espressione varia ceppi 1,2, temperatura di 3,4, 2,3 dei media, bersaglio varianti 5, partner di fusione 6-13, co-espressione con accompagnatori 14,15, citoplasmatica o espressione 16-18, e tampone purificazione componenti periplasmatiche 3. Implementando approcci di throughput elevati, molte variabili o più bersagli possono essere testati in parallelo con un elevato livello di efficienza, limitando variazione da lotto a lotto. Nella nostra esperienza, la strategia dà anche una buona riproducibilità su scala industriale utilizzando la stessa cultura (temperatura, media, aerazione, ecc) e le condizioni di depurazione (stessa resin, tamponi, ecc.) Diverse piattaforme high throughput sono stati utilizzati in passato decennio per identificare le condizioni per l&#39;espressione della proteina solubile, cioè attraverso diversi parametri come partner di fusione, ceppi espressione o temperatura 19-23. Recentemente abbiamo usato il nostro metodo di screening ad alta produttività per l&#39;espressione di ricco-disolfuro proteine ​​solubili 11. Le proteine ​​selezionati non erano solo da fonti velenosi, ma comprendevano anche ricco di disolfuro inibitori enzimatici da una vasta gamma di specie tra piante, maiali, mucche e gli esseri umani. L&#39;esperimento ha confrontato gli effetti di 12 diversi partner di fusione e di tre diversi ceppi di espressione sulla solubilità e la piegatura di 28 proteine ​​disolfuro-reticolato. Abbiamo dimostrato che utilizzando DsbC come partner di fusione per la produzione del ceppo BL21 (DE3) pLysS notevolmente outproduced (sia resa e numero di proteine ​​solubili ottenuti) qualsiasi altra combinazione di deformazione e fusione testata 11. Ilrisultati di questo esperimento si è basata adattare nostra conduttura originale generale throughput elevato (che è stato utilizzato per lo screening espressione di una vasta gamma di proteine) 22,24 in uno più adatto per l&#39;espressione di bersagli ricchi di disolfuro. Proteine ​​ricche di disolfuro di veleni animali sono di particolare interesse. Veleni sono una miscela complessa di peptidi bioattivi e proteine, con valore potenziale farmacologicamente e terapeuticamente. Tuttavia, l&#39;espressione di proteine ​​disolfuro obbligazionari contenenti non è banale. Queste proteine ​​contengono generalmente tra 1-7 legami disolfuro, e devono essere ossidati con i corretti modelli disolfuro-bonding per essere attivi. Attualmente, la piattaforma viene utilizzato per lo screening di espressione di un gran numero di proteine ​​veleno animale ricchi di disolfuro nell&#39;ambito del Progetto FP7 VENOMICS europeo (www.venomics.eu) e comparativa nuovi protocolli per l&#39;espressione ad alto rendimento di migliaia di bersagli . Qui, un metodo automatizzatoè previsto per alta velocità su piccola scala di screening espressione e purificazione (vedi Figura 1) applicato alle proteine ​​animali veleno disolfuro-ricco. La strategia per disolfuro ricchi peptidi e proteine ​​utilizza una HIS-tag per la purificazione e il partner di fusione redox-attiva, DsbC, creando scindibili fusioni HIS-DsbC alle proteine ​​bersaglio (vedi Figura 2). Mentre l&#39;attenzione dei protocolli è qui automazione mediante elettroforesi robot e HTP gestione di liquidi, questi metodi sono adatti anche per un approccio manuale elevato throughput, il che significa che anche i laboratori con una configurazione di base possono usufruire dei protocolli, senza alcuna condizione preliminare per costose attrezzature . Protocolli manuali per la trasformazione di purificazione e analisi (non specifico alle proteine ​​ricche di disolfuro) sono stati pubblicati altrove 24 e non saranno ripetuti qui. La velocità della procedura manuale (dall&#39;espressione clone, prodotto dalla ricombinazioneclonazione nazionale 25, all&#39;analisi dei livelli di proteina solubile) è 96 (utilizzando l&#39;individuazione SDS-PAGE) o 384 (4 x 96; usando dot blot e SDS-PAGE 26) colture a settimana (vedere Figura 1). Questo può essere aumentato se eseguita in modo semi-automatico (usando un robot manipolatore liquido e dot blot 26 o elettroforesi HTP, ad esempio con un sistema Pinza GXII LabChip 22 per l&#39;analisi dei risultati) per un massimo di 1.152 (12 x 96) colture in parallelo superiori a una settimana, come descritto nel presente documento. Coltivazione viene eseguita in pozzo profondo 24 formato (DW24) in modo che regolari incubatori stringono possono essere utilizzati in contrasto con colture cresciute in pozzo profondo formato 96 (DW96), che necessitano l&#39;uso di brevi orbitali incubatori ad alta velocità di agitazione per aerazione sufficiente (scuotimento 800 rpm). L&#39;utilizzo di mezzi di auto-induzione 27 semplifica anche espressione, eliminando la fase di induzione manuale. Anche quando i laboratori utilizzano già espressione e puri pre-definiticondizioni cazione, questi possono essere trasferiti direttamente in questo sistema HTP semplicemente per migliorare l&#39;efficienza. Uno schema dettagliato del throughput elevato pipeline di screening per le proteine ​​ricche di disolfuro è fornita in Figura 3. I parametri del gasdotto sono stati selezionati sulla base di ampi esperimenti di screening 11, 22, che ci ha permesso di scegliere le condizioni più utili per la produzione di proteine. Caratterizzazione può essere eseguita su proteine ​​purificate con targhetta direttamente dalle espressioni di piccole dimensioni in studi pilota, dove decine di microgrammi di campione è sufficiente, o per saggi funzionali sensibili e saggi di legame (ad esempio, sistemi a basso volume di patch clamp HTP 28). Lo stesso può anche essere eseguita sugli obiettivi senza tag dopo la scissione, a condizione che l&#39;etichetta e la proteasi sono stati rimossi (per esempio, mediante HPLC in fase inversa). Il controllo di qualità può essere eseguita anche mediante spettrometria di massa (per confermare la dimensione prevista e ossidazione stmangiato) o metodi cromatografici (per confermare purezza o eterogeneità) 29. Talvolta tag scissione è inutile o addirittura indesiderabile (in particolare per le proteine ​​scarsamente solubili 30,31), quindi in questo scissione protocollo è facoltativo. Indipendentemente, in tutti i costrutti vi è un sito di scissione della proteasi TEV (ENLYFQ / [G] 32) immediatamente precedente il gene bersaglio per produrre proteina nativa dopo taglio (vedi figura 2 e Discussione). Se si desidera scissione del tag di fusione, scissione può essere testato (sulla frazione di eluizione o &#39;a colonna&#39;) alla piccola scala per analizzare l&#39;efficienza, ottimizzare le condizioni se necessario e di ottenere stime attendibili dei rendimenti per esperimenti di scale-up successivi. Ci sono due opzioni per il volume di perline utilizzati durante la purificazione per affinità, a seconda degli obiettivi e aspettative dell&#39;esperimento. Per essere in grado di catturare più proteine ​​possibile (per purificare per saggi pilota o MS, o per extrapolmangiato per rendimenti di scale-up) un volume finale di 200 ml di resina deve essere utilizzato, permettendo la rilevazione di proteine ​​solubili nell&#39;intervallo 1-100 mg / L cultura prima saturazione del sistema (vedere protocollo (A) al punto 8.1) . Tuttavia, se l&#39;obiettivo dell&#39;esperimento è il rilevamento di basse quantità di proteine ​​solubili quindi un volume finale di 50 ml di resina è adatto, permettendo la rilevazione di proteine ​​solubili nell&#39;intervallo 0,1-25 mg / L di coltura (vedi protocollo (B ) nella sezione 8.2). La produzione può essere scalata, se necessario, per ottenere quantitativi milligrammi di bersagli purificati per ulteriori studi strutturali e funzionali utilizzando le condizioni identificate per l&#39;espressione solubile. I dettagli dei protocolli scale-up usati a AFMB sono stati discussi altrove 22,24. Ulteriori dettagli relativi al setup sperimentale, fasi critiche all&#39;interno del protocollo, le modifiche e la risoluzione dei problemi e limiti della tecnica sono forniti nel discoussion. Si prega di leggere la discussione prima di iniziare gli esperimenti. Durante i protocolli ci aspettiamo un tasso di successo del 90% ad ogni passo (per esempio, almeno il 90% delle colture deve crescere in ogni fase). Se il tasso di successo di ogni fase dell&#39;esperimento scende al di sotto del 90% i campioni vengono scartati e l&#39;esperimento viene ripetuto per l&#39;intera collezione di costrutti. Tuttavia, questo tasso di successo non è applicabile al numero di costrutti che esprimono proteine ​​solubili o la percentuale di costrutti che solcano con un&#39;efficienza del 100%, in quanto questo sarà fortemente dipendente dalle proteine ​​testate. I dettagli specifici per il set-up del piano di lavoro del robot sono forniti per ciascun protocollo (vedi anche figura 4), ​​ma possono essere adattati come richiesto per tabella di lavoro alternativo set-up. L&#39;hardware robot (Tecan) è costituito da un braccio di 96-multicanale (MCA96), manipolatore robotico (Roma) e 8 canali di gestione dei liquidi di testa (LiHa). Tutti i passi che utilizzano il MCA96 possono essere eseguite anche utilizzando il LiHa se un MCA96 non è disponibile, tuttavia ci vorrà più tempo perché il LiHa avrà bisogno di essere lavati tra i passaggi. Mentre il robot non è tecnicamente un ambiente sterile, l&#39;inclusione di antibiotici generalmente assicura che non ci sono problemi di contaminazione o sterilità.

<table><tbody><tr><td>Robot per la manipolazione dei liquidi Tecan Freedom EVO 200</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td>I protocolli possono essere adattati a qualsiasi robot per la manipolazione dei liquidi con un collettore a vuoto per piastre . http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8</td></tr><tr><td>Piastre PCR a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>652270</td><td></td></tr> <tr><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/ LB medium</td><td></td><td></td><td>Autoclavato per sterilità.</td></tr><tr>Scorte <td></td><td></td><td>di antibiotici</td><td>Kanamicina (50 mg/ml), ampicillina (100 mg/ml), cloramfenicolo (34 mg/ml in etanolo), scorte di stoccaggio a &meno; 20 °C. Utilizzare una diluizione 1:1.000.</td></tr><tr><td>Piastra a pozzetti profondi 96 (DW96) con capacità di volume di 2,42 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780270</td><td>Autoclavato per sterilità. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td></tr> <tr><td>Vettori</td><td></td><td></td><td>di espressione Per l'espressione di costrutti target. Memorizza a &meno; 20 &deg;C.</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS cellule</td><td></td><td></td> competenti <td>O ceppo di espressione alternativo E. coli a scelta dell'utente. Memorizza a &meno; 80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Pellicola adesiva traspirante</td><td>Breathseal Greiner Bio-One</td><td>676050</td><td></td></tr><tr><td>Macchina PCR con blocco</td><td></td><td></td> piastre a 96 pozzetti <td>Per la trasformazione, lo shock termico e l'ebollizione di campioni SDS-PAGE/Calice.</td></tr><tr><td>Piastre sterili per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662165</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td></tr> <tr><td>LB-agar</td><td></td><td></td><td>Autoclavato per sterilità.</td></tr><tr><td>200 &mu; l puntali sterili monouso</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 617</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Incubatrice a scuotimento Multitron, con corsa di 3 mm</td><td>Infors</td><td>AJ103</td><td>Non indispensabile, può essere utilizzata anche un'incubatrice a scuotimento regolare. http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td></tr> <tr><td>Incubatore a piastre Piastra</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>per microtitolazionePer le scorte di glicerolo e l'eluizione utilizzando il protocollo di purificazione B.</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td></td><td></td><td>Per la preparazione di brodi di glicerolo.</td></tr><tr><td>200 &mu; l puntali monouso</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 616</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Tamponi per nastro adesivo&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td></tr><tr><td>Bactinyl</td><td>Orapi Group</td><td></td><td>O disinfettante microbico equivalente.</td></tr><tr><td>ZYP-5052 medio</td><td></td><td></td><td>Vedere Tabella 1 per le ricette dei componenti.</td></tr><tr><td>Pozzetti profondi 24 piastre (DW24), capacità 10 ml</td><td>Whatman</td><td>7701-5102</td><td>Autoclavato per sterilità. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td></tr><tr><td>Piastra per microtitolazione trasparente a fondo piatto</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Per letture di assorbanza. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td></tr> <tr><td>Spettrofotometro</td><td></td><td></td> <td>per lettura su piastraOpzionale. Per misurare OD600 delle colture.</td></tr><tr><td>Centrifuga con rotore per piastre a pozzetti profondi</td><td></td><td></td><td>Adatto per 3.800 x g.</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td></td><td></td><td>50 mg/ml in acqua. Memorizza a &meno; 20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Imidazolo Grado ACS</td><td>Merck</td><td>IX0005-1</td><td>È necessario utilizzare un grado di imidazolo di alta qualità in modo che non interferisca con le letture A280 per il calcolo della resa proteica.</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di lisi <td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo pH 8 contenente 0,25 mg/ml di lisozima (o il tampone preferito). Aggiungere il lisozima dalle scorte ogni volta e non conservare per lunghi periodi.</td></tr><tr><td>Sonicatore a piastre a bagno</td><td></td><td></td><td></td>d'acqua</tr><tr><td>(processore ad ultrasuoni XL, adattato per piastre a pozzetti profondi)</td><td>Misonix Inc.</td><td></td><td>Non essenziale. Il lisozima da solo è normalmente sufficiente per una lisi quasi completa.</td></tr><tr><td>DNase&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2 mg/ml brodo in acqua, filtro sterilizzato. Memorizza aliquote a &meno; 20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (MgSO4)</td><td></td><td></td><td>2 M stock in acqua, sterilizzato in autoclave.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE o tampone per campioni a pinza&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> legante <td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo pH 8 (o il tampone preferito). Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazolo pH 8 (o il tampone preferito). Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr>Tampone <td></td><td></td><td>di eluizione</td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo pH 8 (o il tuo tampone preferito). Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Piastra filtrante/ricevitore a 96 pozzetti 20 &; micro; m, capacità 1,8 ml</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740686,4</td><td>http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td></tr><tr><td>200 &mu; l punte monouso a foro largo</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 050 348 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Resina a flusso rapido</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-02</td><td>Per la purificazione delle proteine di fusione target. Conservare a 4 &deg;C. Lavare ed equilibrare prima dell'uso. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td></tr><tr>Proteasi <td></td><td></td><td>del virus dell'incisione del tabacco (TEV)</td><td>Opzionale, per la scissione. 2 mg/ml, senza agenti riducenti nel tampone di conservazione. Memorizza a &meno; 80 &deg;C.</td></tr><tr><td>96 pozzetti 0,22 &micro; m piastra filtrante</td><td>Millipore</td><td>MSGV N22 10</td><td>Opzionale. Per filtrare la frazione solubile dopo la scissione. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td></tr><tr><td>SDS-PAGE/dot blot o l'apparecchiatura</td><td></td><td></td> Caliper Labchip GXII <td>L'apparecchio per elettroforesi e la scelta del tipo di gel sono a disposizione dell'utente a sua discrezione.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro e cuvette</td><td></td><td></td><td>Per misurare l'assorbanza a 280 nm (A280) per calcolare la resa di proteine solubili. Non necessario se l'analisi viene eseguita sul calibro.</td></tr><tr><td>Puntali per pipette ZipTip</td><td>Millipore</td><td></td><td>Opzionale. Il tipo di ZipTip è a discrezione dell'utente. La resina C4 dovrebbe essere utilizzata per le proteine più grandi, mentre per i peptidi il C18 potrebbe essere migliore. Metodi alternativi per la desalinizzazione dei campioni possono essere utilizzati anche per ripulire i campioni prima di un ulteriore controllo di qualità. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td></tr><tr><td colspan="4">I materiali sono elencati nell'ordine in cui sono richiesti nella sezione Protocollo. I reagenti possono essere conservati a temperatura ambiente, se non diversamente specificato. Numeri di riferimento dell'autore» Viene fornita la scelta preferita dei materiali, tuttavia possono essere adatti anche prodotti equivalenti. Per i reagenti per i quali il marchio non influenzerà l'esito dell'esperimento, i dettagli dell'azienda sono stati omessi.</td></tr></tbody></table>

high throughput screening espressione quantitativa e purificazione applicata al ricombinante disulfide ricchi di venom proteine ​​prodotte in<em&gt; e. coli</em

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) è il sistema di espressione più utilizzato per la produzione di proteine ​​ricombinanti per studi strutturali e funzionali. Tuttavia, purificare proteine ​​è talvolta difficile poiché molte proteine ​​sono espresse in una forma insolubile. Quando si lavora con obiettivi difficili o multipli pertanto si consiglia di utilizzare un elevato throughput (HTP) controlli l&#39;espressione proteica su piccola scala (1-4 ml culture) per identificare rapidamente le condizioni per l&#39;espressione solubile. Per far fronte ai vari programmi strutturali genomica del laboratorio, una quantitativa (in un intervallo di 0,1-100 mg / L cultura della proteina ricombinante) e proteina HTP protocollo di screening espressione è stato implementato e validato su migliaia di proteine. I protocolli sono stati automatizzate con l&#39;uso di un robot manipolatore liquido, ma possono anche essere eseguite manualmente senza attrezzature specializzate. Proteine ​​del veleno ricco di disolfuro stanno guadagnandocrescente riconoscimento per il loro potenziale come lead terapeutiche di farmaco. Possono essere molto potente e selettivo, ma le loro reti legame disolfuro complesse renderli difficili da produrre. Come membro del progetto europeo FP7 Venomics ( <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), la nostra sfida è quella di sviluppare strategie di produzione di successo con l&#39;obiettivo di produrre migliaia di proteine ​​del veleno nuovi per la caratterizzazione funzionale. Aiutato dalle proprietà redox di legame disolfuro isomerasi DsbC, abbiamo adattato la nostra pipeline di produzione HTP per l&#39;espressione del ossidati, peptidi veleno funzionali del E. citoplasma coli. I protocolli sono applicabili alla produzione di diverse proteine ​​ricche di disolfuro anche. Qui mostriamo nostra conduttura applicata alla produzione di proteine ​​del veleno animale. I protocolli descritti nel presente documento è probabile che le proteine ​​ricche di disolfuro solubili saranno ottenuti in appena una settimana. Anche da una piccola scala, esiste la possibilità di utilizzare the proteine ​​purificate per convalidare lo stato di ossidazione mediante spettrometria di massa, per la caratterizzazione in studi pilota, o sensibili micro-saggi.

Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 6 per lo screening dell&#39;espressione di 96 ricchi di proteine ​​disolfuro dalla pipeline VENOMICS. Le proteine ​​sono disposte aumentando il numero di legami disolfuro poi crescente numero di residui. I peptidi sono stati espressi nel citoplasma con una HIS-tag e DsbC partner di fusione. Quando si utilizzano le condizioni di coltura raccomandate, un OD 600 del 12 si ottiene normalmente. I peptidi sono stati purificati utilizzando il protocollo 8.2-B con un volume finale di 50 ml di nichel resina di affinità, quindi un massimo di proteina ~ 25 mg / L di fusione potrebbe essere rilevato in questo esperimento. Figura 6A mostra il risultato elettroforesi dal sistema Pinza LabChip (mostrando la fusione prima scissione) e il sistema di punteggio basato su estrapolazione di cedere in mg / L cultura della proteina di fusione (in livelli da 0,1 a 2 mg / L cultura, 2 a 10 mg / L cultura, da 10 a 25 mg / L cultura e nessun<html> t rilevato.) Si noti che il tag DsbC spaccati normalmente funziona a circa 32 kDa, piuttosto che 27 kDa come previsto. Allo stesso modo, le fusioni DsbC anche eseguire circa 5 kDa superiori alle attese. Per molti obiettivi non solo vediamo la fusione intatta (banda superiore), ma anche il compagno di fusione solo (banda inferiore). Per alcuni di questi obiettivi ottimizzando le condizioni di coltura può migliorare il rapporto della fusione intatta (banda superiore) rispetto alla sola DsbC consentendo un aumento della resa finale. Il punteggio è basato solo sul piano della fusione intatta. Solo 16 su 96 proteine ​​non potevano essere rilevati a livello di fusione. Questo corrisponde ad un livello di successo complessivo del 83%. Delle 80 proteine ​​che potrebbero essere rilevati, 45 di queste sono state rilevate a livelli maggiori di 2 mg / L cultura (56%). A seconda del bersaglio e fusione, rese di proteine ​​sono di solito nell&#39;intervallo 2-100 mg / L cultura (sebbene in questo esempio utilizzando il protocollo 8.2 B un massimo di proteina ~ 25 mg / L di fusione può essere rilevata). t &quot;&gt; L&#39;analisi del successo per numero di ponti disolfuro presenti (Figura 6B) mostra ragionevole successo per tutti i numeri di legami disolfuro testate (tra 1 e 7), con il livello di successo più basso è il 66% per le destinazioni contenenti 6 disolfuro obbligazioni. L&#39;analisi della distribuzione di successo espressione in base al punto isoelettrico e numero di residui (Figura 6C) mostra alcun pregiudizio particolare per la tecnica, con obiettivi sia non rilevate sparsi trama espressi con successo. Figura 6D mostra un esempio dei risultati ottenuti dalla spettrometria di massa spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS) per un singolo bersaglio, prima e dopo la riduzione del campione con DTT. Normalmente, tale analisi esaustiva spettrometria di massa non dovrebbe essere eseguita (un campione ridotto non avrebbe bisogno di essere analizzato), ma ai fini della demonstratio approfonditan abbiamo dimostrato entrambi i risultati. L&#39;obiettivo indicato è un ricco di disolfuro di proteine ​​del veleno 5,7 kDa con 4 ponti disolfuro. Lo spettro a sinistra mostra i risultati per la proteina prima della riduzione con DTT, come dopo clivaggio e dissalazione senza ulteriori interventi. Lo spettro sul lato destro mostra la proteina dopo la riduzione con DTT seguita da demineralizzazione per eliminare ogni eccesso DTT. Gli ioni corrispondenti alle masse sperimentali sono contrassegnati con frecce sullo spettro e la designazione per ogni ione è mostrato in verde. Le masse progenitrici sperimentali calcolati per questi ioni (per la proteina prima della riduzione (-DTT) e dopo la riduzione (+ DTT)) sono riportati nella tabella. Le masse (5709,6 Da per campione prima riduzione e 5717,6 Da per campione ridotto) presentano una differenza di massa 8 bis. Una differenza di massa 2 Da corrisponde alla presenza di 1 legame disolfuro ossidato, quindi una differenza di massa 8 Da indica la presenza di 4 ponti disolfuro (come previsto) inil campione non ridotto. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo di screening espressione elevato throughput. Usando questo protocollo, 96-384 condizioni possono essere provati da una sola persona in una settimana con metodi manuali, o fino a 1152 condizioni con il descritto attrezzature semi-automatico. Plasmidi di espressione sono costruiti utilizzando una tecnologia di clonazione ricombinazione modo che numerosi obiettivi possono essere sub-clonate in una sola volta. Condizioni di espressione volta solubili sono stati identificati e scissione effettuate, se lo si desidera, la proteina in grado di procedere al controllo di qualità per controllare l&#39;ossidazione e la purezza, microassays e / o di produzione su larga scala. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 2. Schema per clonazione ricombinazione universale e costruire disegno. Dai cloni voce di destinazione, più vettori di espressione possono essere sub-clonate in un singolo esperimento in modo velocità elevata (fino a 6 x 96 cloni di ingresso in una settimana). La proteina espressa codifica una HIS tag per il nichel purificazione per affinità. Il DsbC (privo sua sequenza segnale periplasmic per espressione citoplasmatica) partner di fusione è usato per aumentare la solubilità e / o aiuti piegatura e corretta ossidazione della proteina bersaglio. Si noti che la sequenza codificante obiettivo dovrebbe contenere un sito di TEV proteasi N-terminale (ENLYFQ) se tag scissione si desidera. L&#39;inserto in alto a sinistra mostra la produzione dei cloni ingresso utilizzando un vettore donatore e le sequenze bersaglio, che può essere ottenuta tramite PCR o sintesi del gene. Cloni di ingresso possono essere ottenuti anche da collezioni commerciali clone di ingresso. Molteplici sistemi di clonazione ricombinazione sono disponibili, tuttavia utilizziamo il syste Gatewaym, come mostrato nello schema. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Alta velocità pipeline di screening per più destinazioni ricche di disolfuro. Obiettivi sono inizialmente espressi come fusioni HIS-DsbC nel citoplasma di BL21 (DE3) pLysS E. coli a 37/17 ° C con medie di auto-induzione (zyp-5052). La purificazione viene eseguita su resina nichel seguito da rilevamento dei costrutti solubili mediante elettroforesi HTP (o con dot blot / SDS-PAGE). Se il primo turno di selezione espressione è riuscita, condizioni di coltura alternativi sono provati. Se costrutti producono proteine ​​solubili in rendimenti abbastanza elevati, microassays e controllo di qualità può essere eseguito e, se necessario, la produzione su larga scala può essere perseguito. Per le destinazioni dove i rendimenti solubili non sono abbastanza alti, lo screening espressione può continuare con stra alternativains e le temperature poi altri partner di fusione e di espressione periplasmica. Passaggi facoltativi sono indicati da caselle tratteggiate. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Configurazione Robot Piano di lavoro per la piattaforma HTP. Il layout del nostro liquido movimentazione robot tavola portapezzo è mostrato, sebbene worktables alternative possono anche essere utilizzati purché ci sono siti equivalenti disponibili. L&#39;installazione consiste in una stazione di lavaggio (WS) per il (8 canali testa di gestione dei liquidi (LiHa)), due vettori micropiastra con 4 posizioni di ciascuno (MP4, posizioni 1-4 e 5-8), una stazione di vuoto con 2 posizioni (Te-Aspiratori, posizioni 9 e 10), un vettore micropiastra con 3 posizioni (MP3, le posizioni 11-13), due agitatori piastra con 2 posizioni di ciascuno (Te-Shakers, le posizioni 14-15 e 16-17) e un vettore per le punte monouso con 3 posizioni (Diti, posizioni 18-20). Inoltre l&#39;re sono due vettori hotel pozzetti profondi e uno per micropiastre (non mostrato). L&#39;hardware installato sul robot liquido di trattamento è un braccio di 96-multicanale (MCA96) per l&#39;utilizzo con punte monouso, un 8 canali di gestione dei liquidi testa (LiHa) con punte fisse e un manipolatore robotico (Roma), che si muove piastre / attrezzature giro su il piano di lavoro. La numerazione delle posizioni è indicato tutto il protocollo. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Schema per il trasferimento da una singola piastra a 96 pozzetti in quattro piastre da 24 pozzetti. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Risultati rappresentativi sono indicati per la schermata di espressione di 96 ricchi di disolfuro veleno proproteine. Le proteine ​​sono state espresse come fusioni HIS-DsbC nel citoplasma e purificato utilizzando 50 ml di resina Nickel (protocollo 8.2-B). A) Espressione di screening risultati, mostrando gel virtuale e segnando per la resa di espressione. Il contrasto nel gel virtuale è stato regolato corsia a corsia per compensare bande molto deboli o intensi. Si noti che per alcuni target due bande possono essere visti, la banda superiore corrispondente alla proteina di fusione intatta e la banda inferiore corrispondente al tag fusion solo. B) La proporzione di proteine ​​espresse a ciascun livello di espressione rispetto al numero di legami disolfuro in la proteina. Il numero effettivo di proteine ​​in ciascun gruppo è sovrapposto sul grafico. C) La distribuzione dei livelli di espressione in base al punto isoelettrico (pI) e il numero di residui. D) Un esempio dei risultati di spettrometria di massa per un ricco di disolfuro veleno 5,7 kDa proteina con 4 ponti disolfuro. Lo spettro susinistra mostra la proteina prima della riduzione con DTT e lo spettro sul lato destro indica la proteina ridotta con DTT e poi dissalato. Gli ioni corrispondenti alle masse sperimentali sono contrassegnati con frecce e loro assegnazioni sono visualizzati in verde. Le masse sperimentali per la proteina prima riduzione e dopo la riduzione sono riportati nella tabella e mostrano una differenza di massa di 8 Da, corrispondente alla presenza di proteine ​​ossidate prima aggiunta di agente riducente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Ricetta </td><td> Commento </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g di triptone 5 g di estratto di lievito Acqua 925 ml </td><td> Mescolare e poi autoclave per sterilizzare. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO 4 </td><td> 100 ml 49.3 g MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 ml di acqua </td><td> Mescolare fino a scioglimento poi in autoclave per la sterilizzazione. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g di glicerolo 730 ml di acqua 25 g di glucosio 100 g α-lattosio </td><td> Aggiungere in sequenza, mescolate a fuoco fino a quando tutti disciolto poi in autoclave per la sterilizzazione. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L Acqua 900 ml 66 g (NH 4) 2 SO 4 136 g KH 2 PO 4 142 g di Na 2 HPO 4 </td><td> Aggiungere in sequenza e mescolare fino a quando tutto dissolto allora autoclave per la sterilizzazione. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Ricetta per i componenti di media zyp-5052.

Un protocollo per l&#39;espressione elevato throughput screening e quantitativa analitica purificazione di proteine ​​di fusione di piccoli culture Escherichia coli è descritto ed applicato alla espressione di proteine ​​bersaglio veleno animale ricchi di disolfuro.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di utilizzare un protocollo di screening dell'espressione ad alto rendimento per quantificare in e coli il livello di proteine solubili utilizzando un robot automatizzato per la manipolazione dei liquidi. Ciò si ottiene con la prima inoculazione.96. Pre-colture a pozzetto con cellule trasformate con plasmidi che codificano per le proteine di fusione bersaglio il giorno successivo, piastre a 24 pozzetti riempite con mezzi di autoinduzione vengono inoculate con le pre-colture notturne per generare l'espressione.Le colture dopo la raccolta e il congelamento delle proteine solubili dalle colture di espressione vengono quindi purificate mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati. In definitiva, i livelli di solubilità per ogni fusione di bersagli intatti possono essere misurati per determinare le condizioni di espressione ottimali per la produzione di proteine e la generazione di bersagli di successo. Dai vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali di maggiore efficienza, alla limitata radiazione da lotto a lotto e alla semplicità della gestione e del tracciamento dei dati La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.I passaggi automatizzati possono sembrare scoraggianti e difficili da comprendere solo in formato testo, poiché il testo non trasmette la velocità o la semplicità della procedura. Dopo la trasformazione dei batteri, iniziare utilizzando la pinza robotica per mettere da parte il coperchio della prima piastra di agar LB a 24 pozzetti. Successivamente, utilizzare il braccio di manipolazione dei liquidi a otto canali per miscelare e aspirare 50 microlitri di miscela di trasformazione da una piastra di trasformazione a 96 pozzetti.Erogare la miscela di trasformazione all'interno dei primi quattro canali del braccio di manipolazione dei liquidi nella prima colonna della piastra di agar LB e le trasformazioni all'interno degli ultimi quattro canali nella seconda colonna della piastra di agar LB Lavare accuratamente tutti i puntali dopo l'erogazione e quindi continuare a trasferire la miscela di trasformazione dalla piastra a 96 pozzetti in tutti i pozzetti nelle quattro colonne successive della piastra di agar LB fino a Quel piatto è finito. Una volta completato il trasferimento sul primo piatto, riposizionare il coperchio e iniziare il trasferimento per il piatto successivo. Una volta che tutte le trasformazioni sono state placcate, agitare tutte le piastre per un minuto a 1200 giri/min per generare una distribuzione omogenea della miscela di trasformazione.Quindi, dopo la miscelazione, utilizzare il braccio multicanale 96 per aspirare 60 microlitri della miscela di trasformazione rimanente dalla piastra a 96 pozzetti ed erogare la miscela in una piastra a 96 pozzetti profonda contenente brodo LB. Sigillare le 96 precolture a pozzetto profondo con una pellicola adesiva traspirante per consentire l'aerazione della coltura, quindi posizionare la piastra in un'incubatrice con agitazione a 37 gradi Celsius alla massima velocità durante la notte. Una volta che le precolture sono nell'incubatore, guidare le piastre di agar LB in una cappa con i coperchi senza coperchio per circa 10 minuti.Quindi capovolgere le piastre in un'incubatrice per piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare il braccio di manipolazione dei liquidi per aspirare 100 microlitri di precoltura notturna in una piastra profonda a pozzetti 96 per inoculare le colture di espressione a una diluizione di un 40°, utilizzando lo stesso schema di prima, lavando accuratamente il braccio di manipolazione dei liquidi nella stazione di lavaggio tra ogni colonna delle pre-colture. Al termine dell'inoculazione, posizionare le colture di espressione in un'incubatrice con agitazione a 37 gradi Celsius, sigillata con adesivo traspirante per quattro ore.Quindi ridurre la temperatura a 17 gradi Celsius per un'incubazione notturna. La mattina seguente centrifugare le piastre a pozzetti profondi 24 per 10 minuti a 3000 Gs.Gettare il surnatante in un contenitore di scarto contenente un agente antimicrobico, quindi picchiettare le piastre capovolte su carta assorbente per rimuovere qualsiasi mezzo residuo per verificare che le colture siano cresciute correttamente. Verificare la presenza di pellet nel pozzo profondo.Quindi aspirare 125 microlitri di tampone di lisi ed erogare il tampone due volte in ciascun pozzetto delle 24 piastre profonde con quattro punte in ciascun pozzetto. Per raggiungere il volume finale di un millilitro di tampone di lisi per risospendere i pellet, agitare le piastre a 1200 giri/min per cinque minuti. Sul robot, trasferire nuovamente le sospensioni della cella nei pozzetti appropriati di una piastra profonda 96 e conservare le piastre sigillate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un minimo di un'ora.Per questa dimostrazione, utilizzeremo il protocollo con 50 microlitri di perle di nichel per la purificazione delle proteine di fusione bersaglio. Per prima cosa scongelare la piastra a pozzetti profondi 96 a bagnomaria per circa 15 minuti. Quindi sospendere nuovamente i lisati cellulari nell'incubatore di agitazione alla massima velocità per altri 10 minuti, le colture dovrebbero diventare viscose.Quindi, utilizzare una pipetta manuale a otto canali per erogare DNA e solfato di magnesio Mescolare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti profondi fino a una concentrazione finale rispettivamente di 10 microgrammi per millilitro e 20 millimolari. Agitare la piastra sigillata per altri 15 minuti, momento in cui la coltura dovrebbe diventare non viscosa. Per evitare l'intasamento della piastra filtrante durante la purificazione, è fondamentale controllare attentamente e visivamente che nessuno dei lisati sia più viscoso.Sul robot per la manipolazione dei liquidi, utilizzare punte a foro largo da 200 microlitri per miscelare accuratamente l'impasto di resina prima di trasferire 200 microlitri di impasto nella piastra 96 del pozzetto profondo contenente il lisato. Agitare la piastra 96 del pozzetto profondo a 1400 giri/min e temperatura ambiente per 10 minuti per consentire il legame, quindi utilizzare le punte a foro largo per mescolare e quindi trasferire tutti i 1200 microlitri di liquame di resina in aliquote da 200 microlitri sulla piastra filtrante. Ora accendi il vuoto per circa 30 secondi per filtrare il lisato attraverso la piastra, raccogliendo il flusso in un pozzetto profondo.96 sotto il pozzetto profondo 96 contenente il flusso viene rimosso da sotto la piastra filtrante e conservato su una rastrelliera fino alla fine dell'esperimento. Quindi lavare la resina due volte con 800 microlitri di tampone legante ogni volta dopo il secondo lavaggio, utilizzare la pinza robotica per posizionare una piastra fresca, profonda, ben 96 sotto la piastra filtrante per raccogliere il lavaggio midaz da 50 millimolari. Aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio sulla piastra filtrante e applicare nuovamente il vuoto fino a quando il tampone non è passato attraverso il pozzetto profondo 96 che contiene.Il lavaggio viene rimosso da sotto la piastra filtrante e conservato su una griglia fino alla fine dell'esperimento. Quindi, dopo aver lavato altre due volte con 800 microlitri di tampone di lavaggio, come dimostrato per il tampone legante, i lavaggi hanno utilizzato la pinza robotica per trasferire la micropiastra sul piano di lavoro e rimettere il blocco SPE e la piastra filtrante sopra la micropiastra per raccogliere l'elucian. Quindi aggiungere 190 microlitri di tampone Elucian alla resina nella piastra filtrante.Dopo tre minuti, applicare il vuoto per un minuto per consentire il passaggio di tutto il tampone. Rapidamente, controlla visivamente che i volumi Elluciani siano corretti. Infine, bloccare i campioni del lavaggio Elluciano e fluire attraverso piastre per la quantificazione del livello di espressione solubile.Analizzare prima la piastra elliana e solo quando necessario, controllare il lavaggio pertinente e far scorrere le frazioni. Questi dati illustrano un risultato dell'elettroforesi dal sistema di chip da laboratorio a pinza. Le proteine di fusione scisse intatte sono rappresentate dalle bande superiori con i frammenti proteici scissi rappresentati come bande inferiori.Le rese di fusione per ciascuna proteina bersaglio sono state determinate entro gli intervalli da 0,1 a due, da due a 10 e da 10 a 25 microgrammi per litro di livelli di coltura, o in alcuni casi non sono state rilevate. La valutazione del successo dell'espressione proteica in base al numero di legami diss solfuro presenti all'interno di ciascun frammento proteico di fusione dimostra un successo ragionevole per tutti i numeri di legami disolfuro testati con il livello di successo più basso del 66% per bersagli contenenti sei legami disolfuro. L'analisi della distribuzione del successo dell'espressione basata sul punto isoelettrico e sul numero di residui non indica alcuna particolare distorsione per la tecnica, con bersagli espressi con successo e bersagli che non sono stati rilevati sparsi in tutto il grafico.Una volta rilevate e scisse le fusioni, i bersagli purificati vengono sottoposti a controllo di qualità mediante ionizzazione elettrospray, spettrometria di massa. Qui il bersaglio rappresentativo mostrato è una proteina velenosa ricca di dissolfuro da 5,7 kilodalton con quattro legami disolfuro. Questo spettro mostra i risultati per la proteina prima della riduzione con DTT come lo era dopo la scissione e la desalinizzazione senza ulteriori interventi.Questo spettro mostra la proteina dopo la riduzione con DTT seguita dalla desalinizzazione per rimuovere l'eccesso di DTT. Le frecce indicano gli ioni corrispondenti alle masse sperimentali e la designazione di ogni ione è indicata in verde. Le masse parentali sperimentali calcolate per questi ioni sono mostrate nella tabella e corrispondono a una differenza di massa di otto Dalton, equivalente a quattro legami solfuro ossidati.Una volta configurato, il protocollo completo può essere eseguito su più di mille colture in una settimana. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le colture di e coli su piccola scala per identificare le condizioni di successo necessarie per la produzione di proteine solubili utilizzando metodi ad alto rendimento.

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