High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in E. coli

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di utilizzare un protocollo di screening dell'espressione ad alto rendimento per quantificare in e coli il livello di proteine solubili utilizzando un robot automatizzato per la manipolazione dei liquidi. Ciò si ottiene con la prima inoculazione.96. Pre-colture a pozzetto con cellule trasformate con plasmidi che codificano per le proteine di fusione bersaglio il giorno successivo, piastre a 24 pozzetti riempite con mezzi di autoinduzione vengono inoculate con le pre-colture notturne per generare l'espressione.

Le colture dopo la raccolta e il congelamento delle proteine solubili dalle colture di espressione vengono quindi purificate mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati. In definitiva, i livelli di solubilità per ogni fusione di bersagli intatti possono essere misurati per determinare le condizioni di espressione ottimali per la produzione di proteine e la generazione di bersagli di successo. Dai vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali di maggiore efficienza, alla limitata radiazione da lotto a lotto e alla semplicità della gestione e del tracciamento dei dati La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

I passaggi automatizzati possono sembrare scoraggianti e difficili da comprendere solo in formato testo, poiché il testo non trasmette la velocità o la semplicità della procedura. Dopo la trasformazione dei batteri, iniziare utilizzando la pinza robotica per mettere da parte il coperchio della prima piastra di agar LB a 24 pozzetti. Successivamente, utilizzare il braccio di manipolazione dei liquidi a otto canali per miscelare e aspirare 50 microlitri di miscela di trasformazione da una piastra di trasformazione a 96 pozzetti.

Erogare la miscela di trasformazione all'interno dei primi quattro canali del braccio di manipolazione dei liquidi nella prima colonna della piastra di agar LB e le trasformazioni all'interno degli ultimi quattro canali nella seconda colonna della piastra di agar LB Lavare accuratamente tutti i puntali dopo l'erogazione e quindi continuare a trasferire la miscela di trasformazione dalla piastra a 96 pozzetti in tutti i pozzetti nelle quattro colonne successive della piastra di agar LB fino a Quel piatto è finito. Una volta completato il trasferimento sul primo piatto, riposizionare il coperchio e iniziare il trasferimento per il piatto successivo. Una volta che tutte le trasformazioni sono state placcate, agitare tutte le piastre per un minuto a 1200 giri/min per generare una distribuzione omogenea della miscela di trasformazione.

Quindi, dopo la miscelazione, utilizzare il braccio multicanale 96 per aspirare 60 microlitri della miscela di trasformazione rimanente dalla piastra a 96 pozzetti ed erogare la miscela in una piastra a 96 pozzetti profonda contenente brodo LB. Sigillare le 96 precolture a pozzetto profondo con una pellicola adesiva traspirante per consentire l'aerazione della coltura, quindi posizionare la piastra in un'incubatrice con agitazione a 37 gradi Celsius alla massima velocità durante la notte. Una volta che le precolture sono nell'incubatore, guidare le piastre di agar LB in una cappa con i coperchi senza coperchio per circa 10 minuti.

Quindi capovolgere le piastre in un'incubatrice per piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare il braccio di manipolazione dei liquidi per aspirare 100 microlitri di precoltura notturna in una piastra profonda a pozzetti 96 per inoculare le colture di espressione a una diluizione di un 40°, utilizzando lo stesso schema di prima, lavando accuratamente il braccio di manipolazione dei liquidi nella stazione di lavaggio tra ogni colonna delle pre-colture. Al termine dell'inoculazione, posizionare le colture di espressione in un'incubatrice con agitazione a 37 gradi Celsius, sigillata con adesivo traspirante per quattro ore.

Quindi ridurre la temperatura a 17 gradi Celsius per un'incubazione notturna. La mattina seguente centrifugare le piastre a pozzetti profondi 24 per 10 minuti a 3000 Gs.Gettare il surnatante in un contenitore di scarto contenente un agente antimicrobico, quindi picchiettare le piastre capovolte su carta assorbente per rimuovere qualsiasi mezzo residuo per verificare che le colture siano cresciute correttamente. Verificare la presenza di pellet nel pozzo profondo.

Quindi aspirare 125 microlitri di tampone di lisi ed erogare il tampone due volte in ciascun pozzetto delle 24 piastre profonde con quattro punte in ciascun pozzetto. Per raggiungere il volume finale di un millilitro di tampone di lisi per risospendere i pellet, agitare le piastre a 1200 giri/min per cinque minuti. Sul robot, trasferire nuovamente le sospensioni della cella nei pozzetti appropriati di una piastra profonda 96 e conservare le piastre sigillate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un minimo di un'ora.

Per questa dimostrazione, utilizzeremo il protocollo con 50 microlitri di perle di nichel per la purificazione delle proteine di fusione bersaglio. Per prima cosa scongelare la piastra a pozzetti profondi 96 a bagnomaria per circa 15 minuti. Quindi sospendere nuovamente i lisati cellulari nell'incubatore di agitazione alla massima velocità per altri 10 minuti, le colture dovrebbero diventare viscose.

Quindi, utilizzare una pipetta manuale a otto canali per erogare DNA e solfato di magnesio Mescolare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti profondi fino a una concentrazione finale rispettivamente di 10 microgrammi per millilitro e 20 millimolari. Agitare la piastra sigillata per altri 15 minuti, momento in cui la coltura dovrebbe diventare non viscosa. Per evitare l'intasamento della piastra filtrante durante la purificazione, è fondamentale controllare attentamente e visivamente che nessuno dei lisati sia più viscoso.

Sul robot per la manipolazione dei liquidi, utilizzare punte a foro largo da 200 microlitri per miscelare accuratamente l'impasto di resina prima di trasferire 200 microlitri di impasto nella piastra 96 del pozzetto profondo contenente il lisato. Agitare la piastra 96 del pozzetto profondo a 1400 giri/min e temperatura ambiente per 10 minuti per consentire il legame, quindi utilizzare le punte a foro largo per mescolare e quindi trasferire tutti i 1200 microlitri di liquame di resina in aliquote da 200 microlitri sulla piastra filtrante. Ora accendi il vuoto per circa 30 secondi per filtrare il lisato attraverso la piastra, raccogliendo il flusso in un pozzetto profondo.

96 sotto il pozzetto profondo 96 contenente il flusso viene rimosso da sotto la piastra filtrante e conservato su una rastrelliera fino alla fine dell'esperimento. Quindi lavare la resina due volte con 800 microlitri di tampone legante ogni volta dopo il secondo lavaggio, utilizzare la pinza robotica per posizionare una piastra fresca, profonda, ben 96 sotto la piastra filtrante per raccogliere il lavaggio midaz da 50 millimolari. Aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio sulla piastra filtrante e applicare nuovamente il vuoto fino a quando il tampone non è passato attraverso il pozzetto profondo 96 che contiene.

Il lavaggio viene rimosso da sotto la piastra filtrante e conservato su una griglia fino alla fine dell'esperimento. Quindi, dopo aver lavato altre due volte con 800 microlitri di tampone di lavaggio, come dimostrato per il tampone legante, i lavaggi hanno utilizzato la pinza robotica per trasferire la micropiastra sul piano di lavoro e rimettere il blocco SPE e la piastra filtrante sopra la micropiastra per raccogliere l'elucian. Quindi aggiungere 190 microlitri di tampone Elucian alla resina nella piastra filtrante.

Dopo tre minuti, applicare il vuoto per un minuto per consentire il passaggio di tutto il tampone. Rapidamente, controlla visivamente che i volumi Elluciani siano corretti. Infine, bloccare i campioni del lavaggio Elluciano e fluire attraverso piastre per la quantificazione del livello di espressione solubile.

Analizzare prima la piastra elliana e solo quando necessario, controllare il lavaggio pertinente e far scorrere le frazioni. Questi dati illustrano un risultato dell'elettroforesi dal sistema di chip da laboratorio a pinza. Le proteine di fusione scisse intatte sono rappresentate dalle bande superiori con i frammenti proteici scissi rappresentati come bande inferiori.

Le rese di fusione per ciascuna proteina bersaglio sono state determinate entro gli intervalli da 0,1 a due, da due a 10 e da 10 a 25 microgrammi per litro di livelli di coltura, o in alcuni casi non sono state rilevate. La valutazione del successo dell'espressione proteica in base al numero di legami diss solfuro presenti all'interno di ciascun frammento proteico di fusione dimostra un successo ragionevole per tutti i numeri di legami disolfuro testati con il livello di successo più basso del 66% per bersagli contenenti sei legami disolfuro. L'analisi della distribuzione del successo dell'espressione basata sul punto isoelettrico e sul numero di residui non indica alcuna particolare distorsione per la tecnica, con bersagli espressi con successo e bersagli che non sono stati rilevati sparsi in tutto il grafico.

Una volta rilevate e scisse le fusioni, i bersagli purificati vengono sottoposti a controllo di qualità mediante ionizzazione elettrospray, spettrometria di massa. Qui il bersaglio rappresentativo mostrato è una proteina velenosa ricca di dissolfuro da 5,7 kilodalton con quattro legami disolfuro. Questo spettro mostra i risultati per la proteina prima della riduzione con DTT come lo era dopo la scissione e la desalinizzazione senza ulteriori interventi.

Questo spettro mostra la proteina dopo la riduzione con DTT seguita dalla desalinizzazione per rimuovere l'eccesso di DTT. Le frecce indicano gli ioni corrispondenti alle masse sperimentali e la designazione di ogni ione è indicata in verde. Le masse parentali sperimentali calcolate per questi ioni sono mostrate nella tabella e corrispondono a una differenza di massa di otto Dalton, equivalente a quattro legami solfuro ossidati.

Una volta configurato, il protocollo completo può essere eseguito su più di mille colture in una settimana. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le colture di e coli su piccola scala per identificare le condizioni di successo necessarie per la produzione di proteine solubili utilizzando metodi ad alto rendimento.